Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)

INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
Instrukcja do ćwiczenia nr 8
Produkcja rekombinowanej beta-laktoglobuliny w komórkach bakterii E. coli
CEL
Uzyskanie rozpuszczalnej formy białka BLG B (mutanty L1AI2S i L1AI2SV92F).
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1)
Jaką funkcję pełni izomeraza wiązań disiarczkowych DsbC w komórkach bakterii.
2)
Rola poszczególnych sekwencji DNA obecnych w wektorze ekspresyjnym pETDuet-1,
w tym genu dsbC.
MATERIAŁY
WEKTORY
 pET DUET-1/dsbC/blgBI1AL2S
 pET DUET-1/dsbC/blgBI1AL2SV92F
SZCZEPY BAKTERYJNE
 Origami B (DE3)
ODCZYNNIKI
 płynna pożywka LB
 IPTG
 antybiotyki: ampicylina, kanamycyna, tetracyklina
SPRZĘT LABORATORYJNY
 inkubator z wytrząsaniem, grzaniem i chłodzeniem
 komora laminarna
 spektrofotometr
 pipety automatyczne
 kuwety plastikowe do pomiarów gęstości optycznej zawiesiny bakterii
 wirówki
 waga laboratoryjna
1
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
WYKONANIE ĆWICZENIA
Ze względu na długi czas prowadzenia hodowli bakteryjnej, poszczególne grupy będą
wykonywać tylko wybrane elementy z całej procedury podanej w instrukcji.
UWAGA! W miarę możliwości zakładanie hodowli bakteryjnych oraz pobieranie próbek
hodowli do pomiarów OD powinno się odbywać w komorze laminarnej.
I.
Przygotować: 4,5 litra płynnej pożywki LB (skład: NaCl – 45 g, ekstrakt drożdżowy –
22,5 g, pepton – 45 g, 4,5 l wody demineralizowanej, roztwór zautoklawować), po 4,5
ml stężonych roztworów antybiotyków (ampicylina – 100 mg/ml, kanamycyna – 15
mg/ml, tetracyklina – 12,5 mg/ml), 4 ml tysiąc razy stężonego roztworu IPTG (0,5M),
4 sterylne kolby szklane o objętości 3 l. Po przygotowaniu roztwory antybiotyków
i IPTG należy przechowywać w temp. - 20°C.
II.
Dzień przed planowaną dużą hodowlą założyć 4 tak zwane hodowle-matki, czyli
z szalki, na której rosną komórki E. coli ze szczepu Origami B (DE3)
stransformowane wektorem pETDUET-1/dsbC/blgBI1AL2S (lub pETDUET1/dsbC/blgBI1AL2SV92F) pobrać przy pomocy sterylnej końcówki pojedynczą
kolonię, a następnie końcówkę umieścić w kolbie zawierającej 50 ml pożywki LB
z antybiotykami (końcowe stężenie antybiotyków: ampicylina – 100 µg/ml,
kanamycyna – 15 µg/ml, tetracyklina – 12,5 µg/ml). Prowadzić hodowlę przez noc,
w temperaturze 37°C w łaźni wodnej lub w inkubatorze z wytrząsaniem.
III.
W dniu hodowli do sterylnych kolb (obj. 3 l) przelać 1 litr ciepłej pożywki LB, dodać
antybiotyki (końcowe stężenie antybiotyków: ampicylina – 100 µg/ml, kanamycyna –
15 µg/ml, tetracyklina – 12,5 µg/ml) a następnie 50 ml całonocnej hodowli-matki.
IV.
Przygotować 2 kuwety plastikowe, jedną podpisać przy górnej krawędzi REF
a drugą KOM. Do pierwszej kuwety nalać 2 ml pożywki LB z antybiotykami
a do drugiej (po wcześniejszym wymieszaniu zawiesiny), pobrać 2 ml świeżo
założonej dużej hodowli.
V.
Kolby z dużymi hodowlami (podpisane A, B, C i D) umieścić w inkubatorze
o temperaturze 37°C i włączyć wytrząsanie (ok. 150 obr./min).
VI.
Włączyć spektrofotometr, uruchomić program OD600, wyzerować aparat używając
jako referencji pożywki z antybiotykami, następnie zmierzyć gęstość optyczną jednej
z założonych dużych hodowli (A, B, C lub D). Pomiar powtórzyć trzykrotnie,
w notatkach obok wyniku zapisać godzinę pomiaru. Po zakończeniu pomiaru wylać
zawartość kuwety podpisanej KOM do czerwonego pojemnika na odpady
biologiczne.
VII.
Co około 20 minut powtarzać pomiar gęstości optycznej w celu monitorowania tempa
wzrostu hodowli (do pomiaru należy za każdym razem pobierać próbkę z tej samej
kolby). Próbki należy pobierać w warunkach jałowych pamiętając o dokładnym
wymieszaniu zawiesiny. Po pobraniu próbki kolbę z hodowlą bakteryjną należy
natychmiast umieścić na powrót w inkubatorze.
VIII.
Gdy gęstość zawiesiny bakterii osiągnie wartość OD600 około 1 należy:
a) pobrać 1 ml hodowli do miniprobówki o objętości 1,5 ml i podpisać wg wzoru: dzień
tygodnia, symbol kolby (A, B, C lub D), PI, komórki bakteryjne zwirować (6000
obr/min, 3 min), nadsącz wylać a osad zamrozić w temp. -20°C.
UWAGA! Zamrożone próbki zostaną na kolejnych ćwiczeniach poddane
elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
w celu uzyskania profilu ekspresji rekombinowanego białka.
b) do kolb z dużą hodowlą dodać stężony IPTG (końcowe stężenie induktora
powinno wynosić 0,5 mM), kolby umieścić w inkubatorze i zwiększyć tempo
wytrząsania do około 400 obrotów na minutę.
2
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
IX.
Po zaindukowaniu ekspresji należy co godzinę sprawdzać gęstość hodowli.
Równolegle, za każdym razem, do przygotowanej wcześniej miniprobówki należy
pobrać 1 ml płynnej hodowli do zamrożenia. Kolejne próbki z osadem bakterii
należy podpisywać wg wzoru: dzień tygodnia, symbol kolby (A, B, C lub D), liczba
godzin po indukcji.
X.
Po czterech godzinach od indukcji zakończyć prowadzenie hodowli. Zawartość kolb
przelać do 6 gilz wirowniczych (poj. ok. 400 ml), gilzy podpisać symbolem kolby
i dobrze zrównoważyć. Zwirować bakterie (10 min., 6000 obr./min, 4°C).
W międzyczasie zważyć probówkę o obj. 50 ml, wynik pomiaru zanotować. Po
zwirowaniu hodowli wylać większość nadsączu i zawiesić osad bakterii w pozostałych
10-15 ml płynu hodowlanego. Zawiesinę z sześciu gilz przelać do zważonej probówki
o obj. 50 ml. Ponownie zwirować bakterie (10 min., 6000 obr./min, 4°C). Po
zwirowaniu starannie usunąć cały nadsącz, po raz kolejny zważyć probówkę i na
podstawie uzyskanego wyniku obliczyć masę mokrego osadu bakterii
uzyskanego z jednego litra płynnej hodowli. Wynik zapisać na probówce.
Dodatkowo na probówce umieścić następujące informacje: dzień tygodnia i nazwa
białka rekombinowanego (BLG B I1AL2S lub BLG B I1AL2SV92F). Tak przygotowany
osad zamrozić w temp. –20°C.
WYTYCZNE DO SPRAWOZDANIA NR 3
Sprawozdania powinno zawierać:
a. skrócony opis przebiegu doświadczenia, a dokładniej – tylko tej jego części, która
została faktycznie wykonana na ćwiczeniach (maksymalnie pół strony formatu A4);
b. wykres zależności wartości OD600 od czasu – na wykresie, o ile je zaobserwowano,
należy zaznaczyć poszczególne fazy wzrostu hodowli bakteryjnej (np. adaptacyjna,
wzrostu wykładniczego, równowagi, zamierania) oraz moment indukcji (dane do
sporządzenia wykresu zostaną udostępnione na stronie kursu w arkuszu programu
Excel);
c. odpowiedź na pytanie wylosowane w czasie ćwiczeń.
3