pobierz

Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 1, str. 119–123
STANDARDY – Standards
TOMASZ SACHA1, KRZYSZTOF LEWANDOWSKI2, KAJETANA FORYCIARZ1, MICHAŁ GNIOT2, DAMIAN SZATKOWSKI3, IZABELA FLOREK1, MAGDALENA ZAWADA1 MAREK SIEMIĄTKOWSKI4, KATARZYNA BORYCKA4, MONIKA LEWANDOWSKA5, MIROSŁAW MAJEWSKI5
Wytyczne dotyczące analizy mutacji domeny kinazy tyrozynowej genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową: stanowisko uzgodnione z Polish Adult Leukemia Group
Recommendations for analysis of BCR-ABL tyrosine kinase domain
gene mutations in patients with chronic meylogenous leukemia:
opinion accepted by the Polish Adult Leukemia Group
1
Katedra i Klinika Hematologii, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego, Uniwersytet
Medyczny w Poznaniu
3
Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii, Akademia Medyczna w Gdańsku
4
Bristol-Myers Squibb
5
Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa
2
STRESZCZENIE
W publikacji przedstawiono aktualne wytyczne dotyczące wykonywania analizy mutacji domeny
kinazowej genu BCR-ABL metodą sekwencjonowania u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową.
SŁOWA KLUCZOWE: BCR-ABL – Mutacja – Sekwencjonowanie
SUMMARY
The publication presents current recommendations for BCR-ABL kinase domain mutation analysis using sequencing method in patients with chronic meylogenous leukemia.
KEY WORDS: BCR-ABL – Mutation – Sequencing
WSTĘP
W dniu 26.06.2007 w Krakowie odbyło się spotkanie osób zaangaŜowanych w hematologiczną diagnostykę molekularną w najbardziej doświadczonych w tej dziedzinie
Ośrodkach Klinicznych w Polsce. W czasie spotkania przedyskutowano dostępne dane
literaturowe oraz doświadczenia własne uczestników panelu dotyczące metodyki i zastosowania analizy mutacji domeny kinazowej genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (CML).
120 T. SACHA i wsp.
Na spotkaniu przedstawiono aktualnie stosowane metody analizy obecności mutacji onkogenu BCR-ABL w pracowniach biologii molekularnej. Przedyskutowano takŜe
dotychczasowe doświadczenie ośrodków w Polsce. Szczegółowo omówiono dotychczas stosowane protokoły sekwencjonowania produktów PCR oraz przedstawiono
propozycje dotyczące standaryzacji badań. Omówiono logistykę przeprowadzania
badań w Polsce. PoniŜszy dokument jest podsumowaniem dyskusji panelu ekspertów
i zawiera uzgodnienia dotyczące metodyki przeprowadzania badań dotyczących oceny
obecności mutacji genu BCR-ABL oraz interpretacji uzyskanych wyników.
Uczestnicy spotkania
W panelu ekspertów udział wzięli:
dr Mirosław Majewski
dr Katarzyna Borycka
mgr Izabela Florek
dr Kajetana Foryciarz
mgr Michał Gniot
dr Tomasz Sacha
dr Marek Siemiątkowski
dr Damian Szatkowski
dr Bartosz Wasąg
PROPOZYCJA PROTOKOŁU BADANIA METODĄ SEKWENCJONOWANIA
Wstęp
Test na obecność mutacji domeny kinazowej BCR-ABL (KD BCR-ABL) powinien:
− polegać na analizie RNA,
− być przeprowadzany w oparciu o jednostopniowy PCR,
− obejmować całą domenę kinazową genu ABL z moŜliwością badania mutacji dotyczących aminokwasów 244–486,
− cechować się specyficznością dla onkogenu BCR-ABL (nie dla genu ABL),
− z jednakową skutecznością rozpoznawać mutacje KD BCR-ABL u chorych z CML
i ALL,
− posiadać czułość min. 20-30% (% klonu z obecnością mutacji KD BCR-ABL w stosunku do typu dzikiego BCR-ABL).
W trakcie dyskusji zaakceptowano protokół sekwencjonowania opracowany
w ośrodku australijskim (Branford i wsp., 2006) jako najbardziej odpowiadający wyŜej
wymienionym wymaganiom.
NaleŜy podkreślić, Ŝe jakość badań mutacji KD BCR-ABL zaleŜy w znacznym
stopniu od jakości RNA wyizolowanego z komórek białaczkowych, szczególnie
w przypadku małej ilości transkryptu BCR/ABL. Jako gen kontrolny zdecydowano
stosować gen ABL zgodnie z wytycznymi badania The Europe Against Cancer. Na
wszystkich etapach badania zalecono zachowanie środków ostroŜności związanych
Wytyczne dot. Analizy mutacji domeny kinazy tyrozynowej genu BCR-ABL
121
z moŜliwością wystąpienia kontaminacji materiałem genetycznym oraz zapobieganie
degradacji kwasów nukleinowych. Ustalono takŜe algorytm postępowania metodycznego dla oceny mutacji KD BCR-ABL.
Etapy badania
1. Izolacja RNA z uŜyciem Trizolu lub metodą kolumienkową z komórek krwi obwodowej lub szpiku.
2. Przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji z uŜyciem enzymu MMLV lub Superscript
II (zalecane) oraz tzw. random hexamers.
3. Ocena jakości RNA metodą RQ-PCR (oznaczenie wartości Ct dla genu kontrolnego
ABL).
4. Określenie parametru BCR/ABL:ABL.
5. Wykonanie PCR:
– etap pierwszy (2 róŜne mieszaniny reakcyjne):
100 ng cDNA (>1% BCR/ABL:ABL) lub
150 ng cDNA (<1% BCR/ABL:ABL) (odpowiada całkowitej odpowiedzi cytogenetycznej)
Startery: 5’BCR 3’ABL
– b3a2, b2a2
– e1a2 – inny starter 5’BCR
– etap drugi – ewentualna reamplifikacja transkryptu w przypadku małej ilości
transkryptu BCR/ABL.
6. Zaleca się uŜycie kontroli pozytywnej BCR/ABL:ABL o zakresie ilości transkryptu
od 1 do 8% oraz kontroli negatywnej niezawierającej cDNA BCR/ABL.
7. Zaleca się stosowanie polimerazy do długich matryc (tzw. long template); całkowita
objętość reakcji PCR 25 µl.
8. Elektroforeza produktów PCR w 2% Ŝelu agarozowym (produkt specyficzny wielkości 1504-1641 bp):
− ocena kontroli dodatniej,
− ocena kontroli ujemnej,
− w przypadku obecności słabego sygnału dla produktu PCR lub jego braku naleŜy wykonać drugi etap badania PCR (seminested PCR, produkt wielkości 863
bp).
9. Oczyszczenie produktu PCR z uŜyciem UltraClean Purification kit (metodyka wg
producenta).
10. NiezaleŜne sekwencjonowanie uzyskanych produktów PCR z obu kierunków:
− zaleca się stosowanie w trakcie sekwencjonowania odczynnika Big Dye 3 terminator (metodyka wg producenta),
− oczyszczenie produktu za pomocą glikogenu i 75% izopropanolu,
− elektroforeza kapilarna 2-10 µl (w zaleŜności od uŜywanego sekwenatora)
oczyszczonego produktu PCR,
− pomiar stęŜenia produktu PCR nie jest wymagany.
122 T. SACHA i wsp.
Analizę uzyskanej sekwencji nukleotydów w obu kierunkach naleŜy porównać
z sekwencją w bazach genów (nr sekwencji: M14752, X16416, U07563). NaleŜy
zwrócić uwagę na obecność opisanych dotychczas polimorfizmów w genie ABL:
• 894 A>G
• 1062 A>G
• 1334 G>T
• 1335 T>G
• 1375 A>G
W przypadku stwierdzenia wysokiego tła naleŜy ponownie wykonać reakcję sekwencjonowania. Dodatni wynik w kierunku mutacji KD BCR-ABL powinien zostać
potwierdzony w drugiej próbce RNA wyizolowanej od chorego w tym samym czasie
(lub z tej samej próbki RNA). Wynik badania mutacji powinien zawierać nazwę wykrytej mutacji oraz informację czy dana mutacja moŜe być związana z całkowitą lub
częściową opornością na imatynib, opornością na dazatynib, opornością na nilotynib
lub teŜ, Ŝe w danym przypadku nie ma obecnie danych literaturowych (przykład wyniku p. Hughes i wsp., 2006). Istnieje równieŜ moŜliwość wykonania badania przesiewowego metodą DHPLC przed wykonaniem badania metodą sekwencjonowania w
celu określenia próbek zawierających mutacje KD BCR-ABL. Stwierdzenie mutacji
metodą DHPLC wymaga dalszego określenia ich typu metodą sekwencjonowania.
LOGISTYKA BADAŃ
Badania diagnostyczne są obecnie wykonywane w następujących ośrodkach w kraju: Gdańsk (Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii oraz Katedra i Zakład
Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna), Kraków (Katedra i Klinika Hematologii,
Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego), Poznań (Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego, Uniwersytet Medyczny),
Warszawa (Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Pracownia Biologii Molekularnej,
Klinika Hematologii).
1. Transport próbek
Materiał do badań stanowi krew obwodowa (20 ml, EDTA) lub szpik (3 ml,
EDTA). W ośrodkach nie posiadających pracowni biologii molekularnej pobranie materiału do badania powinno mieć miejsce w godzinach popołudniowych, a próbki powinny być przesłane niezwłocznie kurierem i być odebrane w pracowni biologii molekularnej do godziny 9 następnego dnia. Po pobraniu materiał do badań powinien być
natychmiast wymieszany w celu uniknięcia powstania skrzepów. Materiału do badania
nie naleŜy pobierać do probówek z heparyną. Probówki z materiałem do badania naleŜy owinąć grubą warstwą ligniny i umieścić w pudełku zapewniającym utrzymanie
temperatury próbki podczas transportu od 4oC do 22oC. Do próbek powinno być dołączone skierowanie na wykonanie badania.
Wytyczne dot. Analizy mutacji domeny kinazy tyrozynowej genu BCR-ABL
123
2. Wskazania do wykonania badań
Przy kwalifikacji do badania naleŜy zwrócić szczególną uwagę na spełnienie wskazań do wykonania badań diagnostycznych według aktualnych wytycznych zawartych
m.in. w „Rekomendacje dotyczące stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową” (Hellmann i wsp., 2007), NCCN oraz European LeukemiaNet (Baccarani i wsp., 2006). Stwierdzenie występowania mutacji KD
BCR-ABL u chorych odpowiadających na leczenie imatynibem (np. w CCR) nie oznacza konieczności zmiany dotychczasowego postępowania.
Nie naleŜy kierować na badania molekularne w kierunku obecności mutacji KD
BCR-ABL w przypadku braku optymalnej odpowiedzi na imatynib, jeŜeli lek stosowany był w dawce <400 mg lub jeŜeli imatynib nie był stosowany regularnie.
Wzór skierowania na badanie składa się z 2 części: standardowej uŜywanej przez
laboratoria oraz dodatkowej, zawierającej krótką informację o przebiegu klinicznym z
zaznaczeniem wskazań do wykonania badania (załącznik nr 1).
Czas wykonania badania nie powinien przekraczać 10 dni roboczych. U niektórych chorych istnieje konieczność powtórnego wykonania badania.
Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2005–2008 jako projekt badawczy zamawiany PBZ-KBN-120/P05/2004 oraz projekt badawczy własny PO5B 00530.
PIŚMIENNICTWO
1. Baccarani i wsp., Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 2006;108:1809-1820
2. Branford i wsp., Detection of BCR-ABL mutations and resistance to imatinib mesylate. Methods
Mol Med. 2006;125:93-106
3. Hellmann A. i wsp., Rekomendacje dotyczące stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL u
chorych na przewlekłą białaczkę szpikową. Acta Haematol. Pol.,2007,3,361-374
4. Hughes T. i wsp., Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood. 2006;108:28-37.
5. NCCN, National Comprehensive Cancer Network, Practice Guidelines in Oncology, Chronic
Meylogenous Leukemia, v. 2.2007, www.nccn.org (dostęp: 05.2007)
Praca wpłynęła do Redakcji 25.02.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 3.03.2008 r.
Adres Autora:
Dr med. Tomasz Sacha
Klinika Hematologii Collegium Medicum UJ
Ul. Kopernika 17
31-501 Kraków