Sposób otrzymywania stałego preparatu kompleksu enzymów

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
OPIS PATENTOWY
Patent dodatkowy
do patentu nr
Zgłoszono:
86 07 31
145 354
Int. Cl.4 C12N 9/99
C12N 9/00
(P. 260887)
Int. Cl.5 CUD 3/386
C12N 9/00
Pierwszeństwo
URZĄD
PATENTOWY
RP
Zgłoszenie ogłoszono:
87 07 13
Opis patentowy opublikowano: 1990 09 28
Twórcywynalazku: Edward Galas, Tadeusz Trzmiel, Janusz Idziak,
Mirosława Szczęsna
Uprawniony zpatentu: Politechnika Łódzka,
Łódź (Polska)
Sposób otrzymywania stałego preparatu kompleksu enzymów
pochodzenia bakteryjnego
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania stałego preparatu kompleksu enzymów
pochodzenia bakteryjnego, zawierającego proteinazę serynową, metaloproteinazę, alfa-amylazę i
lipazy, przeznaczonego zwłaszcza do środków piorących.
Z polskiego opisu patentowego nr 97 023 jest znany sposób otrzymywania stałych preparatów
enzymu subtilopeptydazy polegający na tym, że do 2-krotnie zatężonego filtratu po hodowli
Bacillus subtilis o pH = 7,5 dodaje się etanol w ilości 2,5 części objętościowe na 1 część objętościową
filtratu, po czym oddziela się osad enzymu, który po przemyciu acetonem suszy się w warunkach
próżniowych nad wodorotlenkiem potasu.
Niedogodnością tego sposobu jest stosowanie rozpuszczalników organicznych do wytrącania
preparatów enzymatycznych. Enzymy wytrącane przy użyciu rozpuszczalników organicznych są
trudnorozpuszczalne w wodzie, co uniemożliwia zastosowanie ich w środkach piorących. Nadto
stosowanie acetonu i etanolu w warunkach przemysłowych stwarza zagrożenie pożarowe oraz
pociąga za sobą konieczność stosowania wysokoenergochłonnej aparatury do ich regeneracji oraz
opracowania sposobu utylizacji odpadów pogonowych.
Z innego polskiego opisu patentowego nr 137479 jest znany sposób otrzymywania stałego
preparatu kompleksu enzymów proteolitycznych, amylolitycznych i lipolitycznych z Bacillus
subltilis IBT C-3 polegający na wysoleniu tych preparatów z oczyszczonych roztworów pohodowlanych o pH = 7,4 za pomocą siarczanu amonu i następnie osadzeniu ich na nieorganicznych lub
organicznych chemicznych zmiękczaczach wody.
Preparat enzymów otrzymany tym sposobem zawiera domieszkę siarczanu amonu pochodzącego z
procesu wysalania, który w środowisku alkalicznym ulega rozkładowi z wydzieleniem amoniaku.
Zastosowanie więc preparatu otrzymanego tym sposobem do środków piorących powoduje
wydzielanie się nieprzyjemnego zapachu amoniaku z kąpieli piorącej, a także podczas przechowy¬
wania środków piorących zawierających preparat otrzymany tym sposobem.
Znany jest także, z polskich opisów patentowych nr nr 87 350 i 114 551, sposób otrzymywania
stałych preparatów enzymu alfa-amylazy polegający na suszeniu praparatów ciekłych metodą
rozpyłową. Preparaty otrzymane tym sposobem są słaborozpuszczalne w wodzie, zawierają
związki balastowe pochodzące z podłoży pohodowlanych drobnoustrojów i są bardzo pyliste.
145 354
2
Znane są także sposoby wysalania preparatów enzymatycznych z płynu pohodowlanego za
pomocą siarczanu sodowego w temperaturze bliskiej 0°C. Sposoby te znane są, między innymi, z
książki pt. „Methods in Enzymology vol. XXII, s. 511 (1971).
Sposoby te znajdują zastosowanie najczęściej do frakcjonowanego wysalania białek z dalszą
ich ekstrakcją rozpuszczalnikami. Sposoby wytrącania enzymów w temperaturach bliskich 0°C są
nieprzydatne do otrzymywania stałych preparatów enzymów w skali przemysłowej.
Sposób otrzymywania stałego preparatu kompleksu enzymów pochodzenia bakteryjnego,
zawierającego proteinazę serynową, metaloproteinazę, alfa-amylazę i lipazy, przeznaczonego
zwłaszcza do środków piorących, na drodze wysalania z roztworów pohodowlanych za pomocą
stałego siarczanu sodowego, według wynalazku polega na tym, że wstępnie oczyszczony roztwór
kompleksu enzymów poddaje się działaniu siarczanu sodowego przy pH = 7,4-9,1, korzystnie
8,1-8,6 i w temperaturze 289-308 K, korzystnie 303-306 K, po czym wytrącony osad preparatu
oddziela się w temperaturze 306 K, suszy w temperaturze 333-378 K oraz ewentualnie granuluje
i/lub otoczkuje, przy czym siarczan sodowy stosuje się w ilości 300-350 g, korzystnie 330 g na 1 dm3
roztworu pohodowlanego.
Prowadzenie w sposobie według wynalazku procesu wysalania kompleksu enzymów w tempe¬
raturze ok. 306 K zapobiega krystalizacji siarczanu sodowego i czyni sposób ten w pełni przydat¬
nym do produkcji preparatów enzymatycznych przeznaczonych do środków piorących w skali
przemysłowej.
Preparaty enzymatyczne otrzymane sposobem według wynalazku spełniają wszystkie wymagania
stawiane preparatom enzymatycznym przeznaczonym do produkcji dobrych środków piorących,
są bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie, stabilne podczas przechowywania i mogą być stosowane
bez niebezpieczeństwa rozkładu w roztworach o szerokim zakresie pH.
Sposób według wynalazku ilustrują bliżej podane niżej przykłady.
Przykład I. Do 100 cm3 cieczy po hodowli Bacillus subtilis IBT C-3, wstępnie oczyszczonej
przez oddzielenie biomasy, 2-krotnie zatężonej w wyparce próżniowej i przefiltrowanej przez płyty
filtrujące EK, zawierającej w 1 cm3 ll,56mjA proteinazy serynowej, 7,23mjA metaloproteinazy,
800jFS alfa-amylazy i 65jL lipazy, o pH = 8,3 i temperaturze 303 K, dodano powoli, w trakcie
ciągłego mieszania 30 g stałego, bezwodnego siarczanu sodowego. Rozwtór reakcyjny mieszano do
całkowitego rozpuszczenia siarczanu i następnie jeszcze w ciągu 30 minut. Wytworzony osad
enzymów odwirowano w wirówce kuwetowej i wysuszono w temperaturze 338 K. Otrzymano 2,6 g
preparatu stałego o aktywności: serynowej proteinazy 391 mjA/g, metaloproteinazy 208mjA/g,
alfa-amylazy 24300 jFS/g oraz lipazy 16jL/g.
Otrzymany preparat okazał się odporny w temperaturze 318 K w ciągu 60 minut na działanie
składników środków piorących takich, jak Kosulfonat 40, Rokafenol N-8, Rokanol R2-12, trójpolifosforan sodowy, Ergon B, metakrzemian sodowy, kwaśny węglan sodowy, nadboran sodowy.
Ponadto preparat ten zwiększał wyraźnie — o około 30% — zdolność usuwania zabrudzeń, a
zwłaszcza plam krwi z tkanin testowych w porównaniu z modelowymi środkami piorącymi
nieenzymatycznymi.
Przykład II. Do 4,09 dm3 cieczy po hodowli Bacillus subtilis IBT C-3, wstępnie przygoto¬
wanej jak w przykładzie I, zawierającej w 1 cm3 12,26 mjA proteinazy serynowej, o pH = 8,3 i
temperaturze 303 K, dodano powoli, w trakcie ciągłego mieszania 1227 g stałego, bezwodnego
siarczanu sodowego. Roztwór reakcyjny mieszano do całkowitego rozpuszczenia się siarczanu i
następnie jeszcze w ciągu 30 minut. Wytworzony osad enzymu odwirowano i wysuszono w
temperaturze 378 K w suszarce z nawiewem powietrza. Otrzymano 137,6g preparatu stałego o
aktywności serynowej proteinazy 321 mjA/g praparatu. Własności preparatu były analogicznejak
preparatu otrzymanego w przykładzie I.
Zastrzeżenie patentowe
Sposób otrzymywania stałego preparatu kompleksu enzymów pochodzenia bakteryjnego,
zawierającego proteinazę serynową, metaloproteinazę, alfa-amylazę i lipazy, przeznaczonego
zwłaszcza do środków piorących, na drodze wysalania z roztworów pohodowlanych za pomocą
stałego siarczanu sodowego, znamienny tym, że wstępnie oczyszczony roztwór kompleksu enzy-
145 354
3
mów poddaje się działaniu siarczanu sodu przy pH = 7,4-9,1, korzystnie 8,1-8,6 i w temperaturze
289-308 K, korzystnie 303-306 K, po czym wytrącony osad preparatu oddziela się w temperaturze
306 K, suszy w temperaturze 333-378 K oraz ewentualnie granuluje i/lub otoczkuje, przy czym
siarczan sodu stosuje się w ilości 300-350 g, korzystnie 330 g na 1 dm3 roztworu pohodowlanego.