ćwiczenie 1 - ATRINBIOTECH

„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
IZOLACJA I WSTĘPNE OCZYSZCZANIE 1,2-DIOKSYGENAZY
KATECHOLOWEJ
WPROWADZENIE
Stopniowa degradacja środowiska naturalnego człowieka spowodowała, że w
ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się problemom związanym z biologicznym
oczyszczaniem wód i gleby z akumulujących się w środowisku trudno rozkładalnych
związków ksenobiotycznych. Do jednych z najbardziej trwałych i cechujących się dużą
toksycznością
związków
należą
związki
aromatyczne,
w
tym
wielopierścieniowe
węglowodory (naftalen, antracen, fenantren), jak również pochodne fenolowe (metylofenole,
nitrofenole, aminofenole, chlorofenole itd.).
Kluczową rolę w degradacji ksenobiotyków odgrywają dioksygenazy, enzymy katalizujące
reakcje wprowadzenia obu atomów tlenu z cząsteczki O2 do jednej lub dwóch cząsteczek
substratów. Większość dioksygenaz wymaga obecności jonów żelaza związanych w układzie
niehemowym i nie tworzących standardowych kompleksów Fe/S.
Dioksygenazy biorące udział w katabolizmie pierścieni aromatycznych dzielimy na
dwie główne klasy- pierwsza klasa to dioksygenazy hydroksylujące pierścień aromatyczny z
równoczesnym utlenieniem NAD(P)H, a powstały w wyniku reakcji cis-dihydrodiol
przekształca się do katecholu. Do drugiej grupy dioksygenaz należą dioksygenazy
rozszczepiające pierścień aromatyczny. Podział dioksygenaz rozszczepiających pierścień na
intradiolowe i ekstradiolowe jest związany z obecnością podstawników hydroksylowych przy
atomach węgla, pomiędzy którymi dochodzi do rozerwania wiązania. Jeżeli rozcięciu ulega
wiązania pomiędzy atomami węgla, z których każdy zawiera grupę hydroksylową jako
podstawnik, reakcja ta jest katalizowana przez dioksygenazy intradiolowe, czyli pierwszy
enzym szlaku orto rozkładu związków aromatycznych. Natomiast jeżeli tylko jeden z atomów
węgla,
pomiędzy
którymi
dojdzie
do
rozerwania
wiązania,
posiada
podstawnik
hydroksylowy, wówczas w proces ten zaangażowane są dioksygenazy ekstradiolowe,
pierwsze enzymy szlaku meta rozkładu związków aromatycznych.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
1,2-dioksygenaza katecholowa należy do dioksygenaz intradiolowych, będących
najczęściej homomultimerami, zawierającymi różną ilość trójwartościowego żelaza na mol
enzymu. Mimo różnego układu podjednostek, domeny katalityczne tych enzymów wykazują
podobną strukturę pofałdowania oraz skład aminokwasowy. Ich podjednostki zbudowane są z
około 300 reszt aminokwasowych, tworzących dwie domeny. Typową dla 1,2-dioksygenaz
jest domena N-terminalna, pośrednicząca w dimeryzacji podjednostek. Składa się ona z około
100 aminokwasów, tworzących maksymalnie pięć helis. Helisy dwóch podjednostek
przenikają się wzajemnie tworząc strukturę dimeru i jednocześnie hydrofobowy tunel, do
którego
mogą
być
dołączane
cząsteczki
fosfolipidów.
Zestawienie
sekwencji
aminokwasowych 1,2-dioksygenaz katecholowych wykazuje, iż domena z motywem
helikalnego zamka błyskawicznego (ang. helical-zipper) jest charakterystyczna dla enzymów
z tej rodziny. Istnieje kilka hipotez wyjaśniających znaczenie tego motywu. Jedna z nich
zakłada, iż hydrofobowy tunel odpowiada za wzrost miejscowej koncentracji substratu.
Wydaje się to jednak mało prawdopodobne, gdyż katechol jest związkiem rozpuszczalnym w
stężeniach znacznie przekraczających stężenia fizjologiczne. Ponadto nie stwierdzono
występowania dla substratu bezpośredniej drogi od tunelu do centrum aktywnego enzymu.
Uważa się również, iż fosfolipidy przyłączone do hydrofobowego tunelu służą jako cząsteczki
efektorowe. Odpowiadają one za zmiany konformacyjne centrum aktywnego enzymu, co z
kolei umożliwia przyłączenie do hydrofobowego fragmentu enzymu laktonizującego cis,cismukonian, czyli kolejnego enzymu szlaku orto. Dzięki temu w komórce zachowane jest
niskie stężenie intermediatów, które mogą być dla niej potencjalnie toksyczne. Uważa się
również, iż hydrofobowy fragment dioksygenaz może wpływać na płynność dwuwarstwy
lipidowej. Związki aromatyczne znane są z antybakteryjnych właściwości ze względu na ich
wpływ na integralność i funkcjonalność błony komórkowej. Wykazano jednak, iż niektóre
mikroorganizmy rozwinęły mechanizmy pozwalające pokonać toksyczność związków
aromatycznych. Mogą one wypompowywać z komórki węglowodory aromatyczne przy
użyciu energo-zależnej pompy, utrzymując ich stężenie w komórce na bezpiecznym
poziomie. Drugi, alternatywny mechanizm, polega na zmianie płynności warstwy
fosfolipidowej. Przypuszcza się, iż dzięki hydrofobowemu regionowi, dioksygenazy
intradiolowe mogą wiązać fosfolipidy błony komórkowej lub nowo zsyntetyzowane w
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
komórce fosfolipidy. Powoduje to uwalnianie z błony hydrofobowych węglowodorów
aromatycznych i ich wiązanie w centrum aktywnym enzymu. Efektem tego procesu jest
wzrost sztywności błony komórkowej, a w konsekwencji zmniejszenie jej przepuszczalności,
co zabezpiecza komórkę przed toksycznym stężeniem związków aromatycznych w
środowisku.
Mechanizm
rozszczepienia
pierścienia
aromatycznego
przez
dioksygenazy
intradiolowe został zaproponowany na podstawie biochemicznych, spektroskopowych i
strukturalnych badań tych enzymów. Reakcja wiązania substratu z enzymem jest procesem
wieloetapowym, którego ostatecznym rezultatem jest zastąpienie aksjalnej tyrozyny i
ekwatorialnego jonu wodorotlenkowego 1,2-dioksygenazy lub 3,4-dioksygenazy przez,
odpowiednio, jon katecholanowy lub protokatecholanowy. Efektem tego jest ich aktywacja.
W wyniku ataku żelaza na tlen, podczas którego dochodzi do redukcji żelaza z +3 na +2
stopień utlenienia i powstanie Fe2+-semichinonu, który reaguje bezpośrednio z dwoma
atomami tlenu, wytwarza się struktura nadtlenku C-O-O-Fe. W powstałym intermediacie
hydronadtlenkowym dochodzi do przegrupowania Criegee’a względem wiązania węgielwęgiel poprzez migrację grupy acylowej, w konsekwencji której powstaje nietrwała struktura
laktonowa. Efektem hydrolizy bezwodnika laktonowego jest uwolnienie produktu reakcji
rozszczepienia pierścienia aromatycznego, czyli kwasu cis,cis-mukonowego.
Celem ćwiczenia jest izolacja i częściowe oczyszczenie wyidukowanej kwasem
benzoesowym 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu Stenotrophomonas maltophilia KB2.
WYKONANIE
A.
Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu KB2
• 48 godzinną hodowlę bakteryjną indukowaną 6 mM benzoesanu zwirować przy 5000
rpm przez 30 minut w temperaturze 4˚C.
• UWAGA! W każdej frakcji należy wykonać oznaczenie aktywności 1,2dioksygenazy katecholowej oraz stężenia białka metodą Bradford’a. Z każdej
frakcji pobrać 0,5 ml i przechowywać w lodówce.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
• Uzyskany osad rozpuścić w buforze fosforanowym o pH 7,2 i sonikować z
częstotliwością 20 kHz, w temperaturze 4˚C, 6 razy po 15 sekund w odstępach 30
sekundowych z użyciem dezintegratora ultradźwiękowego Vibre Cell.
• UWAGA! Wszystkie operacje po rozbiciu komórek należy wykonywać w łaźni
lodowej.
• Dla oddzielenia nie rozbitych komórek, zawiesinę zwirować przy 9500 rpm przez 20
minut. Uzyskany supernatant stanowi mieszaninę błon, peryplazmy i cytoplazmy
(Frakcja F1). Do frakcji F1 wprowadzić PMSF w ilości takiej, aby finalne stężenie
inhibitora wynosiło 0,5 mM, pobrać 2 ml tej frakcji i pozostawić w lodówce.
Pozostałą część frakcji F1 wykorzystywać w dalszych etapach badań.
• Następnie supernatant zwirować przy 46 000 rpm przez 90 minut, w temperaturze 4˚C,
w ultrawirówce Beckman. Uzyskany osad zawiera błony, a supernatant (Frakcja F2)
cytoplazmę i peryplazmę.
• Do supernatantu dodać 2% siarczanu protaminy w takiej ilości, aby końcowe stężenie
w supernatancie wynosiło 0,01%. Supernatant wytrząsać 10 minut w temperaturze 4˚C
w celu wytrącenia kwasów nukleinowych.
•
Zawiesinę zwirować przez 15 minut w temperaturze 4oC, z szybkością 15 500 rpm w
ultrawirówce Beckman (Frakcja F3).
• Białka supernatantu wysolić odpowiednim stężeniem siarczanu amonu. W tym celu
odważyć siarczan amonu do 2 ml probówek typu Eppendorf , tak aby uzyskać stężenia
5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 i 50% siarczanu amonu, po wprowadzeniu do
probówki 1,0 ml supernatantu. Przygotowane mieszaniny wytrząsać przez 10 minut, w
temperaturze 4˚C, i odwirować prze 15 minut przy 14 000 rpm w celu oddzielenia
wytrąconych białek.
• W uzyskanych supernatantach zmierzyć aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej.
Stężenie siarczanu amonu przy którym aktywność enzymu jest największa zastosować
do wysolenia pozostałego supernatantu.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
• Odwirowany po wysoleniu supernatant (Frakcja F4) przenieść na kolumienki
Amicon Ultra 50K NMWL, skondycjonowane wcześniej zgodnie z instrukcją
producenta i postępować dalej zgodnie z załączoną procedurą.
• Uzyskany przesącz przechowywać (Frakcja F5) w probówce typu Blue caps w
temperaturze 4˚C.
B.
Oznaczanie aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej
W oznaczeniu aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej stosuje się metodę
Hegeman’a, polegającą na spektrofotometrycznym oznaczeniu pierwszego produktu
rozkładu pirokatechiny – kwasu cis,cis-mukonowego. Aktywność właściwą 1,2dioksygenazy katecholowej oblicza się korzystając z wzoru:
( At − A0 ) ∗106
ε ∗l ∗t
Awł =
mg białka w próbie
[U ∗ mg białka ]
−1
gdzie:
Awł – aktywność właściwa 1,2-dioksygenazy katecholowej,
A0 – absorbancja światła w zerowym czasie reakcji enzymatycznej,
At – absorbancja światła po czasie t reakcji enzymatycznej,
ε – molowy współczynnik absorbancji dla kwasu cis,cis-mukonowego
ε =16800 dm3 * mol-1 * cm-1,
l – grubość warstwy roztworu, cm,
t – czas pomiaru reakcji enzymatycznej, s
mg białka w próbie – białko oznaczone metodą Bradford’a i przeliczone na objętość próby
•
W celu oznaczenia aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej przygotować
mieszaninę reakcyjną o objętości 1 ml, o składzie: 0,97ml 50 mM buforu
fosforanowego o pH 7,4; 0,02ml 10 mM pirokatechiny oraz 0,016 ml
odpowiedniej frakcji enzymatycznej. Pomiar prowadzić wobec próby ślepej nie
zawierającej frakcji enzymatycznej, w temperaturze 30ºC przez 3 minuty od
momentu zmieszania reagentów, przy długości fali λ=260 nm, przy użyciu
spektrofotometru dwuwiązkowego z wykorzystaniem opcji „Time plot”.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
C.
Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford’a
Do najczęściej stosowanych metod oznaczania białka należy metoda Bradforda.
W metodzie tej wykorzystuje się wiązanie barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250
z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem głównie
reagują reszty argininy, w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny,
tryptofanu i fenyloalaniny. Błękit brylantynowy CBB G-250 w środowisku
kwasowym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkiem zmienia się na
błękitne. Wiąże się z tym zmiana maksimum pochłaniania z 465 na 595 nm. Natężenie
barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. W zależności od budowy
białka, mogą zaistnieć różnice w wiązaniu barwnika, co powoduje uzyskiwanie
różnego natężenia barwy przy tych samych stężeniach odmiennych białek.
• W celu oznaczenie stężenia białka w badanym materiale biologicznym pobrać 200
µl próby, dodać 1 ml odczynnika Bradford’a i starannie wymieszać. Oznaczyć
ekstynkcję przy długości 595 nm. Stężenie białka określić na podstawie krzywej
wzorcowe, której współczynnik kierunkowy wynosi 0,0135. Jeśli wartość
otrzymanej ekstynkcji przekroczy 1 próbę należy odpowiednio rozcieńczyć.
LITERATURA
Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-258 (1976).
Gniot-Szulżycka J., Leźnicki A., Komoszyński M., Jakubowska A., Wojczuk B. Materiały
pomocnicze do ćwic zeń z biochemii dla studentów biologii i chemii. Metody ilościowego
oznaczania, rozdziału i oczyszczania cz. I białka. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu,
Toruń 1994.
Guzik U., Greń I., Hupert-Kocurek K., Wojcieszyńska D. Catechol 1,2-dioxygenase from the
new aromatic compounds - degrading Pseudomonas putida strain N6. Int. Biodeter. Biodegr.
65, 504-512 (2011).
Guzik U., Greń. I., Wojcieszyńska D., Łabużek S. Dioksygenazy – kluczowe enzymy
degradacji związków aromatycznych. Biotechnologia, 3 (82), 71-88 (2008)
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
Hegeman G.D. Synthesis of enzymes of the mandelate pathways by Pseudomonas putida.
Synthesis of enzyme by the wild type. J. Bacteriol. 91, 1140-1154 (1966).
Wojcieszyńska D., Greń I., Łabużek S. Dioksygenazy- kluczowe enzymy rozkładu związków
aromatycznych. Post. Mikrobiol. 44, 63-70 (2005)
Wojcieszyńska D., Hupert-Kocurek K., Greń I., Guzik U. Modulation of FAD-dependent
monooxygenase activity from aromatic compounds-degrading Stenotrophomonas maltophilia
strain KB2. Acta Biochim. Pol. 58, 421-426 (2011)
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW
Tabela I Aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej i stężenie białka w poszczególnych
frakcjach uzyskanych podczas izolacji
Absorbancja
Frakcja
Czas (s)
F1
F2
F3
F4
F5
0
30
60
90
120
150
180
∆A
A595 białka
Objętość frakcji (ml)
Rozcieńczenie białka
Stężenie białka mg/ml
Białko całkowite
Ilość białka w próbie
Aktywność właściwa
U/mg białka
Aktywność całkowita
(U)
Stopień oczyszczenia
Wydajność (%)
Wyniki aktywności właściwej enzymu oraz stężenia białka w poszczególnych frakcjach
przedstawić graficznie.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
Tabela II Aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej i stężenie białka po zastosowaniu
różnych stężeń siarczanu amonu w etapie wysalania
Absorbancja
C(NH4)2SO4 (%)
Czas (s)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
30
60
90
120
150
180
∆A
A595 białka
Rozcieńczenie białka
Stężenie białka mg/ml
Ilość białka w próbie
Aktywność właściwa
U/mg białka
Wyniki aktywności właściwej enzymu oraz stężenia białka w poszczególnych frakcjach
przedstawić graficznie.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
50