Biotransformacja korteksolonu do hydrokortyzonu w hodowli

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
Biotransformacja korteksolonu do hydrokortyzonu w hodowli Curvularia lunata.
Cel dwiczenia: ocena wydajności produkcji hydrokortyzonu metodą mikrobiologiczną.
Szczep wzorcowy: Curvularia lunata (ATCC: 12017), BSL1.
Skład podłoża PL2:
Brzeczka 12°Blg
100 ml
Aminobak
5,0 g
Ekstrakt drożdżowy 5,0 g
KH2PO4
5,0 g
Woda
do 1000 ml; pH=5,8-6,0
Wykonanie dwiczenia:
A. Indukcja układu enzymatycznego i przeprowadzenie biotransformacji korteksolonu
1. Zaszczepid ok. 20 ml pożywki PL2 zarodnikami zmytymi ze skosu. Prowadzid hodowlę
na wytrząsarce przez 24 h (temp. 28°C).
2. Następnego dnia dodad 30 ml podłoża z dodatkiem induktora układu
hydroksylującego (korteksolon w stężeniu 0,1 g/L). Prowadzid hodowlę przez
następną dobę.
3. Do indukowanej hodowli C. lunata dodad substrat (200 mg korteksolonu w 0,5 ml
96% etanolu) i przeprowadzid biotransformację przez kolejne 24 godziny (w takich
samych warunkach).
4. Oddzielid grzybnię od podłoża produkcyjnego, przesącz poddad analizie
chromatograficznej w celu określenia obecności produktu biotransformacji
korteksolonu.
B. Analiza chromatograficzna przesączu hodowlanego
1. Przesącz ekstrahowad mieszaniną chloroformu z acetonem (9:1) – 3-krotnie po 15 ml.
2. Uzyskany ekstrakt odwodnid bezwodnym siarczanem sodu, przesączyd i odparowad
do sucha (ogrzewad bardzo delikatnie, aby nie doszło do degradacji hydrokortyzonu).
3. Suchą pozostałośd rozpuścid w niewielkiej ilości mieszaniny chloroform-metanol (9:1),
nanieśd na płytkę chromatograficzną i przeprowadzid rozdział. Porównad wynik
rozdziału ze standardami ilościowymi hydrokortyzonu w zakresie stężeo: 0,25; 0,5; 1;
2,5 i 5 mg/ml.
Wyniki:
Określid przybliżoną zawartośd hydrokortyzonu w ekstrakcie z hodowli C. lunata na
podstawie intensywności plam standardów na chromatogramie. Wynik podad w mg na 100
ml hodowli. Obliczyd wydajnośd praktyczną bioprocesu.
Zawartośd hydrokortyzonu w hodowli badanej:
Wydajnośd praktyczna bioprocesu:
Wnioski:
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
1