wytwarzanie psilocybiny w zanurzonej kulturze psilocybe cubensis

Transkrypt

Wytwarzanie psilocybiny w zanurzonej kulturze Psilocybe
cubensis
Część I. Przyłączenie oznakowanych pochodnych tryptamin
(The Production of Psilocybin in Submerged Culture by Psilocybe Cubensis)
by
Philip Catalfomo* i V.E. Tyler, Jr.
(Drug Plant Laboratory, College of Pharmacy, University of Washington, Seattle 5)
Lloydia 27, 53-63 (1964)
*Manuskrypt ten jest w części wypisem z rozprawy przedstawionej Szkole Wyższej Uniwersytetu
Waszyngtona przez Philipa Catalfomo jako częściowego spełnienia wymagań na stopień Doktora
Filozofii. Obecny adres: School of Pharmacy, Oregon State University, Corvallis.
Otrzymano 28 Maj 1963.
wersja ang. www.en.psilosophy.info/zzkgpxigbajwbnclcdarbkgi
original text: http://www.erowid.org/archive/rhodium/pdf/psilocybin.submerged.culture.pdf
backup source: http://www.psilosophy.info/resources/psilocybin.submerged.culture.pdf
[ tłumaczenie: cjuchu ]
Spis Tresci:
Wstęp
Materiały i metody
Techniki kulturowe
Metody analityczne
Procedura analityczna
Doświadczenie i wyniki
Wzrost, pH i wytwarzanie psilocybiny
Wpływ pominięcia pewnych składników odżywczych
Wpływ stężenia pewnych składników odżywczych
Badanie kultury zastępczej
Omówienie
Podziękowania
Cytowana literatura
Wstęp
Grzyby psychotomimetyczne długo były stosowane jako odurzające przez różne ludy tubylcze. Schultes10
opisuje ich stosowanie w ceremoniach magiczno religijnych przez Indian Meksyku i Ameryki Środkowej, a
rozległe udokumentowanie takiego stosowania zostało dostarczone przez Wassonów 14, 15 oraz przez Heima i
Wassona6.
Na szczególną uwagę zasługuje występowanie pewnych pochodnych indolu w wielu podstawczakach, dla
których opisano właściwości psychotomimetyczne. Kilka gatunków Panaeolus zawiera serotoninę (5hydroksytryptaminę), po raz pierwszy zademonstrowaną w grzybie Panaeolus campanulatus (Fr.) Quel., przez
Tyler'a13. Istnienie bufoteniny (5-hydroksy-N,N-dimetylotryptaminy) zostało ukazane w Amanita citrina
(Shaeff.) S.F. Gray [Amanita mappa (Lasch) Quel.] przez Wielanda i Motzela16. Psilocybina (4-fosforyloksy-N,Ndimetylotryptamina), wraz z blisko spokrewnioną psylocyną (4-hydroksy-N,N-dimetylotryptaminą), została po
soma rights re-served
1
od 19.03.2014 na http://www.psilosophy.info/
www.psilosophy.info/zzkgpxigbajwbnclcdarbkgi
raz pierwszy stwierdzona w gatunku Psilocybe przez Hofmanna, et al.8. Dwa ostatnie składniki są dopiero co
odkrytymi halucynogenami w podstawczakach i są szczególnie interesujące, gdyż są jedynymi zasadami
wyizolowanymi z grzybów, które zdolne są wywoływać efekty psychotomimetyczne u ludzi po przyjęciu
doustnym.
Heim et al.7, utworzył warunki sprzyjające formowaniu zarówno sklerocji jak i sporokarpów z przyrostu grzybni
otrzymanego na podkulturze zarodników i tkanki naturalnie występującego meksykańskiego gatunku
Psilocybe. W ten sposób otrzymali obfite ilości materiału do izolowania i do strukturalnych badań aktywnych
składników. Psychotomimetyczne efekty u ludzi następujące po spożyciu albo dziko rosnących sporokarpów
albo sporokarpów, sklerocji, i grzybni wyprodukowanych w kulturze laboratoryjnej były identyczne9. Singer 11 i
Stein 12 otrzymali podobne wyniki, lecz ani oni, Heim, et al.10, ani Hofmann, et al.8, nie przebadali wytwarzania
psilocybiny lub psylocyny w fermentacjach kultury zanurzonej. Stanowiło to główny cel, a przedstawione tu
dane pochodzą z fermentacji zanurzonej kultury gatunku Psilocybe.
Dowody eksperymentalne dotyczące biosyntezy psilocybiny lub psylocyny są dość ograniczone. Podobieństwo
strukturalne między tymi związkami a tryptofanem sugerowało, że mogą pochodzić z pospolitego aminokwasu.
Część psilocybiny wyizolowanej z wyhodowanej powierzchniowo grzybni Psilocybe semperviva Heim i Cailleux
według Brack, et al. 2, otrzymano ze znakowanego izotopowo tryptofanu dodanego do podłoża odżywki.
Dodatkowy cel niniejszego badania dotyczył losu tryptofanu dodanego do zastępczego podłoża kultury
zawierającego wymyte granulki grzybni z fermentacji kultury zanurzonej.
Materiały i metody
Techniki kulturowe - Kultury grzybni badanych organizmów były utrzymywane na skosach agaru ziemniaczano
glukozowo drożdżowego1. Składy podłoża pożywki (podłoże nr 1) i podłoża zapasowego (podłoże nr 2) podane
są w tabeli 1. Różne modyfikacje tych podłoży zostaną opisane później.
Tabela 1. - Podłoże pożywki
Podstawowe podłoże pożywki
Podłoże nr 1
Bursztynian amonowy
1,0 g
Glicyna
9,0 g
Glukoza
5,0 g
Ekstrakt drożdżowy
0,5 g
KH2PO4
0,1 g
Chlorowodorek tiaminy
0,003 g
(NH4)6Mo7O24-4H2O
0,05 mg
ZnSO4-7H2O
0,3 mg
MnCl2-4H2O
0,35 mg
FeSO4-7H2O
2,5 mg
CuSO4-5H2O
0,5 mg
MgSO4-7H2O
0,5 g
Destylowana woda by uzyskać
1,0 litr
Wyregulowane do pH 5,5 kwasem chlorowodorowym.
Podłoże zastępcze
Podłoże nr 2
Kwas cytrynowy (0,1M)
307,0 ml
Na2HPO4-7H2O (0,2M)
193,0 ml
Destylowana woda by uzyskać
1 litr
Do każdej kolby kultury zastępczej zawierającej 30 ml tego podłoża (pH 4,2) dodano 2 mg tryptofanu.
2
Do badań z kolbą wstrząsaną, transfery były wykonywane ze skosów agarowych do 125ml kolb Erlenmeyera
zawierających 30ml pożądanego podłoża. Po czterech do siedmiu dniach na szejkerze w 25±1°C, wzrost
grzybni (forma granul) był homogenizowany przez piętnaście sekund w sterylnym Waring Blendor semimicro i
do wszystkich kolb eksperymentalnych dodawano tego 5ml na 100ml jako inokulantu. O ile nie odnotowano
inaczej, kolby były następnie wstrząsane przy 25°C przez okresy pięciu do piętnastu dni.
Inokulant kultury zastępczej został otrzymany w sposób podobny, lecz krok homogenizacji został wydłużony do
jednej minuty. Homogenat z jednej, 125ml kolby został przeniesiony ilościowo do 2800ml kolby Fernbacha
zawierającej 300ml podłoża, i grzybnię pozostawiono do wzrostu na wstrząsarce obrotowej. Wytworzone w ten
sposób granulki grzybni zostały ostrożnie przemyte 500ml sterylnej wody destylowanej; porcje zostały
przeniesione do 125ml kolb zawierających 2mg tryptofanu w 30ml podłoża nr 2 i były wstrząsane przez
określony okres czasu.
Wstrząsarkami stosowanymi rutynowo w tych badaniach była wstrząsarka obrotowa New Brunshwick, model
V, oraz wstrząsarka obrotowa Gump, model M, które działały przy 240 i 185 rpm, odpowiednio.
Metody analityczne - Granulki grzybni, oddzielone od kultury lub podłoża zastępczego przez filtrację ssącą na
palniku Büchnera, były suszone w piecyku do suszenia o wymuszonym obiegu powietrza przy 48°C przez okres
minimalny czterdziestu ośmiu godzin a następnie przechowywane w osuszaczu nad bezwodnym chlorkiem
wapnia. Po określeniu wartości pH przefiltrowanego podłoża kultury, filtraty zostały odparowane do suchości
w parowniku zapłonowym (flash evaporator) w 40°C przy obniżonym ciśnieniu. Osady zostały starannie
wyekstrahowane 2ml porcjami absolutnego metanolu by rozpuścić psilocybinę i psylocynę, i roztwory
przechowano w lodówce aż do poddania analizie chromatograficznej.
Po wyschnięciu, granulki grzybni z indywidualnych kolb kultury zostały zważone a następnie zamienione w
proszek nr 60 w młynku laboratoryjnym Wiley. Do każdej próbki sproszkowanego materiału w 25ml kolbie
dodano dziesięć ml metanolu (ok 25-100mg). Po ośmiogodzinnym wstrząsaniu otrzymana zawiesina została
odwirowana, a płyny supernatantu przelano do 50ml kolb okrągłodennych. Wytłoki zostały potraktowane w
identyczny sposób dwa dodatkowe razy, po których połączone ekstrakty metanolowe odparowano do
niewielkiej ilości (1-2ml) w obrotowym ewaporatorze do klisz w 40°C przy zmniejszonym ciśnieniu.
Skoncentrowany wyciąg został przeniesiony do 5ml kolby miarowej przy pomocy mikrozakraplacza. Materiał
osadowy w kolbie do ewaporacji został usunięty poprzez przepłukanie metanolem i został dodany do kolby
miarowej, a ostateczną objętość skorygowano do 5ml. Ekstrakty przygotowane w ten sposób przechowywano w
lodówce do czasu użycia do analizy.
Do ustalenia obecności lub nieobecności psilocybiny i psylocyny została zastosowana procedura wznoszącej
chromatografii dwuwymiarowej. Ekstrakty (50-200µl) naniesiono na arkusze bibuły filtracyjnej (8x8 cali)
Whatmana nr 1 i uformowano z n-butanolem-kwasem octowym-wodą (4:1:5) w pierwszym kierunku oraz z npropanolo-1N wodorotlenkiem amonu (5:1) w drugim kierunku. Pochodne indolu umiejscowiono poprzez
spryskanie arkuszy roztworem 2 procentowego p-dimetyloaminobenzaldehydu w 1N kwasie chlorowodorowym
(PDAB) i osuszenie arkuszy opalarką laboratoryjną.
Procedura analityczna - analiza bibułowej chromatografii podziałowej dla psilocybiny została opracowana w
oparciu o procedurę seryjnego rozcieńczania zastosowaną przez Browna, et al.4 do analizy muskaryny w
gatunku Inocybe. Technika obejmowała obserwację wzrokową minimalnej wykrywalnej ilości psilocybiny w
wyniku reakcji z PDAB na chromatogramach papierowych. Ustalono, że 1,0µg psilocybiny mógłby z pewnością
zostać wykryty na chromatogramach wywołanych w n-butanolu-kwasie octowym-wodzie (4:1:5), spryskanych
PDAB, i dopuszczonych do samoistnego wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez trzydzieści minut.
Objętość ekstraktów grzybniowych, odpowiadająca tej ilości związku została określona eksperymentalnie, i
obliczono ilość psilocybiny w ekstraktach i w grzybni (w oparciu o suchą masę).
Spis Tresci
3
DOŚWIADCZENIE I WYNIKI
Wzrost, pH i wytwarzanie psilocybiny - Kultury zastosowane w badaniu obejmowały Psilocybe cubensis (Earle)
Singer otrzymane z Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois (NRRL A-9109), Psilocybe
cyanescens Wakefield i Psilocybe pelliculosa (Smith) Singer & Smith, wyizolowane z tkanki owocników
grzybów zebranych na obszarze Seattle. By określić czy zostanie wytworzona psilocybina i/lub psylocyna,
grzybnia została wyhodowana w zanurzonej kulturze na różnych podłożach, w różnych warunkach
laboratoryjnych. Granulki grzybni Psilocybe cubensis wyhodowane na podłożu nr 1 zawierały psilocybinę,
aczkolwiek podłoże kultury nie; psylocyny nie można było wykryć ani w podłożu ani w grzybni. Pozostałe dwa
gatunki nie wytworzyły wykrywalnych ilości żadnego z tych związków w żadnym z badanych podłoży.
Wywnioskowano, że grzyby różniły się swymi metabolicznymi zdolnościami, a z tych trzech, jedynie Psilocybe
cubensis został poddany dalszemu badaniu.
Przeprowadzono wstępne eksperymenty by określić optymalny okres wzrostu i jego związek z wytwarzaniem
psilocybiny. Kultury organizmu w podłożu nr 1 były zbierane co drugi dzień, pięć do piętnastu dni po
zaszczepieniu. Repliki czterech kultur były badane przy każdym okresie wzrostu. Po zakończeniu
eksperymentu zostało określone pH podłoża, sucha masa grzybni, oraz ilość wytworzonej psilocybiny. Wyniki
są zestawione w tabeli 2 i na rycinie 1.
Tabela 2. - Wzrost, pH podłoża, oraz wytworzenie psilocybiny.
Okres wzrostu (dni) pH podłoża Sucha masa grzybni (mg) Psilocybina (%)
5
średn.
7
średn.
9
średn.
11
średn.
13
średn.
15
średn.
4,4
40,5
0,23
4,2
53,9
0,20
4,3
50,0
0,21
4,8
29,0
0,25
4,4
43,4
0,22
4,2
72,0
0,51
4,0
110,6
0,51
4,6
114,1
0,54
4,2
67,3
0,54
4,2
91,0
0,52
4,1
114,9
0,46
4,4
114,6
0,50
4,5
106,1
0,44
4,1
114,8
0,46
4,3
112,6
0,46
4,6
101,0
0,36
4,6
109,4
0,34
7,8
81,7
0,27
7,7
82,9
0,37
6,1
93,2
0,35
7,6
81,9
0,32
7,6
88,1
0,33
7,8
102,3
0,31
7,8
80,2
0,31
7,7
88,1
0,32
8,0
82,6
0,28
7,9
81,5
0,27
7,6
104,6
0,20
7,8
89,5
0,25
4
Rycina 1. Wzrost, pH podłoża, oraz wytwarzanie psilocybiny.
Dane te ujawniły, że pH podłoża pozostało kwaśne aż do dziewiątego dnia a wtedy gwałtownie wzrosło aż
ustabilizowało się w pobliżu pH 8. Maksymalne wytwarzanie psilocybiny (procentowo) nastąpiło dnia
siódmego, podczas gdy wytwarzanie grzybni osiągnęło szczyt dnia dziewiątego. Psilocybina nie została wykryta
w podłożu. Maksymalne wytwarzanie zarówno grzybni (sucha masa) jak i psilocybiny (procentowo) nastąpiło w
kwaśnym podłożu, i oba zmalały gdy pH podłoża zaczęło rosnąć po dziewiątym dniu fermentacji. Zauważono,
że psilocybina była wytwarzana podczas najbardziej aktywnego okresu wzrostu organizmu.
Mimo że psilocybina została wstępnie zidentyfikowana chromatograficznie, dodatkowy dowód otrzymano z
ultrafioletowych danych spektralnych. Ekstrakty metanolowe grzybni poddano chromatografii w n-butanolu
nasyconym wodą, strefę odpowiadającą psilocybinie eluowano metanolem, a eluat rechromatografowano jak
uprzednio. Stwierdzono że ultrafioletowe spektrum absorpcji otrzymane z końcowego eluatu w
spektrofotometrze Cary, model 14, pokrywa się ze znanym spektrum psilocybiny (maksimum 268 mµ i 290
mµ).
Wpływ pominięcia pewnych składników odżywczych - Przeprowadzono kolejne badanie by określić wpływ na
wzrost i wytwarzanie psilocybiny gdy w podłożu nr 1 pominięty został pojedynczo każdy z następujących
składników: glukoza, bursztynian amonowy, ekstrakt drożdżowy, tiamina, i glicyna. W kolejnym badaniu, w
podłożu jednocześnie zostały pominięte ekstrakt drożdżowy i tiamina. Replikanty czterech kultur dla każdej
zmodyfikowanej kombinacji, plus grupy kontrolne, zostały zebrane piątego, siódmego i jedenastego dnia po
zaszczepieniu. Kultury kontrolne rosły w niezmodyfikowanym podłożu nr 1. Wyniki podsumowane zostały w
tabeli 3.
Spis Tresci
5
Tabela 3. - Wpływ modyfikacji podłoża na pH, wzrost, oraz wytwarzanie psilocybiny.
Okres wzrostu (dni)
Pominięte
składniki
Brak
średn.
Glukoza
średn.
Bursztynian
amonu
średn.
Glicyna
średn.
Ekstrakt
drożdżowy
średn.
Ekstrakt
drożdżowy i
tiamina
średn.
5
pH
7
11
Sucha masa
Sucha masa
Sucha masa
grzybni
Psilocybina (%) pH
grzybni
Psilocybina (%) pH
grzybni
Psilocybina (%)
(mg)
(mg)
(mg)
4,0
53,9
0,26
4,1
81,4
0,67
-
-
-
4,0
54,6
0,25
3,8
115,0
0,57
7,1
110,0
0,32
3,9
63,5
0,24
4,1
84,4
0,64
7,2
78,9
0,34
4,2
45,2
0,25
3,9
-
-
6,9
106,4
0,34
4,1
54,3
0,25
3,9
93,6
0,62
7,1
97,5
0,33
5,8
7,5
-
6,6
8,6
-
6,8
8,6
-
5,7
9,4
-
6,4
7,9
-
6,9
9,1
-
5,9
5,0
-
6,3
7,6
-
6,8
6,9
-
5,8
6,1
-
6,3
5,5
-
6,9
7,6
-
5,8
7,0
-
6,4
7,4
-
6,8
8,0
-
3,8
33,7
0,34
3,9
54,4
0,34
7,8
92,8
0,31
3,8
37,3
0,30
4,0
61,1
0,29
7,8
86,2
0,30
3,8
34,2
0,30
3,8
95,9
0,21
7,7
80,0
0,36
3,9
23,0
0,31
3,8
109,3
0,18
7,6
99,2
0,29
3,8
32,0
0,31
3,9
80,1
0,25
7,7
89,5
0,31
3,7
76,1
0,23
3,8
87,5
0,75
6,3
84,9
0,33
3,7
89,8
0,38
3,5
100,0
0,75
7,4
88,8
0,33
3,9
55,6
0,35
3,3
130,0
0,63
7,4
84,1
0,39
3,9
50,1
0,35
3,3
105,4
0,71
7,2
88,4
0,41
3,8
67,6
0,33
3,5
98,9
0,71
7,0
86,5
0,36
4,6
22,8
-
4,0
81,7
0,86
-
-
-
4,4
31,7
0,08
4,2
56,8
0,64
3,9
102,6
0,28
4,5
32,0
-
4,2
68,5
0,81
3,9
104,4
0,28
4,4
31,1
-
4,3
55,9
0,68
3,9
100,2
0,35
4,4
31,0
-
4,2
65,7
0,74
3,9
102,4
0,30
4,2
23,3
0,30
4,2
45,4
0,30
3,7
91,0
0,24
4,3
31,5
0,30
3,8
89,9
0,31
3,8
88,0
0,25
4,2
27,4
0,30
4,0
67,6
0,31
3,8
89,5
0,24
Pominięcie glukozy zapobiegło jakiemukolwiek znacznemu wzrostowi organizmu, i nie zostały wytworzone
wykrywalne ilości psilocybiny. Brak ekstraktu drożdżowego osłabił wstępny wzrost; jednakże, organizm
przystosował się do tego niedoboru a następnie uległ energicznemu wzrostowi i porównywalnemu wytworzeniu
psilocybiny. Plon grzybni z podłoża bez bursztynianu amonu był obniżony a siedmiodniowe granule ukazały
najniższe poziomy psilocybiny. Gdy pominięta została glicyna, ilość psilocybiny w suchej masie była znacznie
większa. Gdy został pominięty jednocześnie ekstrakt drożdżowy i tiamina, wyniki dorównały wynikom
uzyskanym gdy nie było jedynie ekstraktu drożdżowego, z wyjątkiem tego, że nagromadzenie psilocybiny było
znacznie niższe.
Spis Tresci
6
Wpływ stężenia pewnych składników odżywczych - Opracowano eksperymenty do określenia wpływu różnych
stężeń glukozy, fosforanu kwasu potasowego, oraz bursztynianu amonu na wzrost i metabolizm organizmu.
Zostały przygotowane zduplikowane kultury zawierające następujące stężenia (procentowo) trzech
indywidualnych składowych z normalnymi stężeniami innych składników w podłożu nr 1: glukoza - 1,0; 0,5;
0,25; fosforan kwasu potasowego - 0,02; 0,01; 0,005; bursztynian amonu - 0,2; 0,1; 0,05. Kultury te zostały
przygotowane i przetworzone jak opisano poprzednio. Wyniki są zestawione w tabeli 4.
Tabela 4. - Wpływ stężenia na pH, wzrost, oraz wytwarzanie psilocybiny.
Okres wzrostu (dni)
5
Stężenie (%)
pH
7
11
Sucha masa
Sucha masa
Psilocybina (%) pH
Psilocybina (%) pH
grzybni (mg)
grzybni (mg)
Sucha masa
Psilocybina (%)
grzybni (mg)
Glukoza
0,25
średn.
0,50
średn.
1,0
średn.
3,9
60,8
0,29
7,3
65,6
0,47
7,7
42,3
0,23
4,2
51,7
0,28
6,8
97,8
0,45
7,6
44,1
0,25
4,1
56,2
0,28
7,0
81,7
0,46
7,6
43,2
0,24
4,7
27,2
0,32
4,0
72,4
0,64
7,3
100,5
0,22
4,9
28,0
0,31
3,9
86,2
0,65
7,4
114,2
0,20
4,8
27,6
0,31
3,9
79,3
0,64
7,4
107,3
0,21
3,9
73,1
0,40
3,8
112,4
1,01
3,7
176,6
0,16
3,9
72,0
0,41
3,9
108,4
1,06
3,9
181,9
0,15
3,9
72,5
0,40
3,8
110,4
1,03
3,8
179,2
0,15
4,3
28,0
0,30
3,7
89,6
0,62
7,9
88,4
0,32
4,1
27,8
0,26
3,5
124,4
0,54
7,8
95,0
0,29
4,2
27,9
0,28
3,6
107,0
0,58
7,8
91,7
0,30
3,8
82,0
0,27
3,8
88,4
0,55
7,7
96,7
0,28
3,9
61,7
0,30
3,8
96,3
0,58
7,6
91,5
0,24
3,8
71,8
0,29
3,8
92,3
0,56
7,6
94,1
0,26
4,7
40,3
0,29
4,0
95,3
0,45
7,7
104,2
0,26
4,3
62,4
0,34
4,0
90,6
0,48
7,4
102,0
0,26
4,5
51,3
0,32
4,0
92,8
0,46
7,6
103,1
0,26
4,4
31,2
0,40
3,9
80,1
0,57
3,9
102,2
0,17
4,2
45,4
0,26
3,8
95,9
0,60
3,8
98,8
0,17
4,3
38,3
0,33
3,9
88,0
0,58
3,9
100,5
0,17
3,7
111,4
0,34
3,9
88,9
0,63
7,7
90,8
0,24
3,7
102,3
0,35
3,8
100,8
0,55
7,1
104,1
0,27
3,7
106,8
0,34
3,9
94,8
0,59
7,4
97,4
0,25
4,1
43,4
0,25
4,0
88,4
0,41
7,4
87,1
0,25
4,1
40,7
0,27
3,9
83,5
0,48
7,2
126,0
0,33
4,1
42,0
0,26
3,9
85,9
0,44
7,3
106,5
0,29
Bursztynian amonu
0,05
średn.
0,10
średn.
0,20
średn.
Fosforan
0,005
średn.
0,01
średn.
0,02
średn.
Niskie stężenie glukozy związane było z gwałtownym wzrostem pH, natomiast przy wysokim poziomie glukozy
utrzymywało się kwaśne pH. Wyższe poziomy glukozy skutkowały wyższymi uzyskami psilocybiny aż do
siódmego dnia, lecz mogło to być związane z podwyższonym wzrostem, który wystąpił w tym podłożu. W
granulach grzybni w podłożu zawierającym zwiększoną ilość glukozy godny uwagi jest gwałtowny wzrost i
następujący spadek zawartości psilocybiny. Niskie stężenie fosforanu skutkowało gwałtownym spadkiem
poziomu psilocybiny. W tym przypadku także, pH pozostało kwaśne aż do jedenastego dnia. Wariacje stężenia
bursztynianu nie wpłynęły wyraźnie na organizm.
7
Tabela 5. - Porównanie między wielkoskalową a małoskalową kulturą Psilocybe cubensis.
Kolby kultury (określenie) Wiek kultury w dniach pH podłoża Waga grzybni oznaczona w mg Psilocybina %
Fernbacha
7
4,0
106,8
0,47
Erlenmeyera
7
4,2
43,5
0,46
Fernbacha
9
7,1
133,8
0,04
Erlenmeyera
9
4,2
83,1
0,23
Fernbacha
11
8,0
159,4
0,03
Erlenmeyera
11
3,8
95,0
0,12
Spis Tresci
Badanie kultury zastępczej - Ponieważ okazało się, że tryptofan oddziałuje jako biosyntezowy prekursor
psilocybiny w kulturach powierzchniowych Psilocybe semperviva, opracowano badanie kultury zastępczej by
określić, czy grzybnia Psilocybe cubensis uprzednio hodowana w kulturze zanurzonej może wykorzystać
egzogenny tryptofan do zwiększenia syntezy psilocybiny. Badanie to mogłoby również dostarczyć informacji
dotyczącej związku między biosyntezą psilocybiny a wzrostem organizmu.
Badanie kultury zastępczej wymagało dużych ilości grzybni porównawczej, a wstępne badania wykazały, że na
metabolizm organizmu wyraźnie wpłynął rozmiar kolb z kulturą. Zaszczepiacz z grzybnią z tego samego źródła
był wstrząsany równocześnie w trzech Fernbachach i trzech 125 ml kolbach Erlenmeyera, a jedna kultura z
kolby każdego rozmiaru została oznaczona odpowiednio po siedmiu, dziewięciu, oraz jedenastu dniach
inkubacji. Porównanie to wykazało, że siedmiodniowa grzybnia wyhodowana w kolbie Fernbacha zawierała
znaczną ilość psilocybiny i że po siedmiu dniach, pH wywaru odżywki w kolbie Fernbacha było wciąż kwasowe
(tabela 5). W ten sposób, wyniki ujawniły, że siedmiodniowa grzybnia wyhodowana w kolbie Fernbacha ma
potencjał do formowania psilocybiny i nie była fizjologicznie stara.
Tabela 6. - Wpływ tryptofanu na biosyntezę psilocybiny w kulturach zastępczych przygotowanych z siedmiodniowej
grzybni.
Kultury
Czas inkubacji (godzin)
Sucha waga grzybni (mg)
Psilocybina (%)
0,24
57,2
0,29
Zastępcza
12
42,1
━━━━
średn. 0,26
0,33
28,1
0,24
Kontrolna
12
72,8
━━━━
średn. 0,28
0,18
65,4
0,17
Zastępcza
24
66,7
━━━━
średn. 0,17
0,18
64,9
0,14
Kontrolna
24
58,6
━━━━
średn. 0,16
0,12
88,0
0,12
Zastępcza
48
91,4
━━━━
średn. 0,12
0,11
69,1
0,18
Kontrolna
48
45,5
━━━━
średn. 0,14
Dodanie tryptofanu do kultur zastępczych nie zwiększyło produkcji psilocybiny. Jednakże, wizualne porównanie
chromatogramów ujawniło, że zawartość psilocybiny stopniowo malała oraz że akumulacja kinureniny
odpowiadała zmniejszeniu zawartości tryptofanu w ciągu czterdziestoośmiogodzinnego okresu.
Po wyjęciu małej próbki siedmiodniowych granul grzybni z kolby Fernbacha i sprawdzeniu na obecność
psilocybiny, równe porcje pozostałych granul przeniesiono do dwunastu kolb kultury zastępczej, każdej
zawierającej 30 ml podłoża nr 2. Tryptofan (2mg/kolbę) dodano do połowy kultur zastępczych a pozostałe
8
służyły jako kontrolne, bez tryptofanu. Dwie kultury kontrolne i dwie kultury zawierające tryptofan wyjmowano
z szejkera i analizowano po 12, 24, i 48 godzinach, odpowiednio (tabela 6).
Spis Tresci
Omówienie
Granule Psilocybe cubensis wytworzone w podłożu nr 1 skumulowały psilocybinę lecz nie psylocynę.
Maksymalna produkcja pierwszego związku wystąpiła siódmego dnia (0,52 procent, suchej masy grzybni),
podczas gdy wzrost osiągnął maksimum (średnio 112,6 mg, suchej masy grzybni na 30 ml podłoża w 125 ml
kolbie) dnia dziewiątego.
Maksymalne plony zarówno psilocybiny jak i grzybni wystąpiły w przedziale kwasowym pH (4,0 - 4,6).
Jednakże, kwaśna natura podłoża nie wyklucza możliwości, że wewnętrzne pH organizmu utrzymane jest na
innym poziomie dzięki efektywnemu systemowi ochrony. Nieznalezienie psilocybiny w podłożu można
przypisać jej nietrwałości w energicznie wstrząsanym kwaśnym podłożu, choć zaangażowane są
prawdopodobnie również czynniki przepuszczalności.
Przy braku łatwo przyswajalnego źródła węgla (glukoza), nie gromadzą się wykrywalne ilości psilocybiny.
Pominięcie bursztynianu amonu nie zwiększyło istotnie pH podłoża, lecz obniżyło uzyski psilocybiny. Bez
ekstraktu drożdżowego, produkcja grzybni była opóźniona o pięć dni, a zalewy kultury pozostały kwasowe
przez jedenaście dni. Adaptacja i/lub synteza niezbędnych prekursorów zezwoliła jednakże na zwiększony
wzrost, czemu towarzyszyło gwałtowne zwiększenie uzysku psilocybiny siódmego dnia. Podobne wyniki
otrzymano dla podłoża, w którym pominięto zarówno ekstrakt drożdżowy jak i tiaminę, z wyjątkiem tego, że
poziomy psilocybiny pozostały niższe.
Zgodnie z Cochranem5 większość grzybów bezwzględnie wymaga tiaminy; jednakże, tam gdzie potrzebne są
niskie poziomy, synteza zachodzi po zainicjowaniu wzrostu. W warunkach niedoboru tiaminy, wykorzystanie
glukozy jest osłabione, co może być przyczyną wstępnego zahamowania wzrostu, gdy w podłożu zostały
pominięte ekstrakt drożdżowy lub ekstrakt i tiamina. Chociaż glicyna stanowiła więcej niż połowę całkowitej
masy rozpuszczonych substancji stałych w podłożu nr 1, przy jej braku organizm rósł i metabolizował
skutecznie.
W podłożu nr 1 odnotowany został wpływ różnych stężeń glukozy, bursztynianu amonu, oraz wodorofosforanu
potasu. Niski poziom glukozy był związany z gwałtownym wzrostem pH zewnątrzkomórkowego, i akumulowały
się niższe poziomy produktu. Podwojenie normalnej ilości węglowodanów sprzyjało akumulacji psilocybiny,
która siódmego dnia osiągnęła poziom 1,03 procent (suchej masy). Po jedenastu dniach, poziom ten spadł do
0,15 procent; podobny nagły spadek zawartości psilocybiny został również odnotowany w kolbach
zawierających zmniejszone stężenie fosforanu. Znaczenie niskich poziomów pH po jedenastu dniach jest
nieznane. W przeciwieństwie do tego, poziomy bursztynianu amonu, które były połową lub dwukrotnością z
normalnego podłoża nie miały istotnego wpływu na pH lub wytwarzanie psilocybiny.
Zewnątrzkomórkowy tryptofan dodany do kolb zastępczych nie zwiększył wytwarzania psilocybiny, lecz
zamiast tego przeszedł reakcje degradacyjne, których występowanie stwierdzono u grzybów Neurospora i
innych5. Wniosek ten oparty jest na obserwacji, iż progresywny wzrost kinuraniny, katabolicznego produktu
metabolizmu tryptofanu, odpowiadał za zanik tryptofanu. Wyniki te niekoniecznie są sprzeczne z tymi
otrzymanymi przez Brack, et al. 2 , gdyż stosowali oni inny organizm oraz inny projekt badawczy, co
uniemożliwia bezpośrednie porównanie. Jednakże, nasze wyniki dowodzą istnienia bezpośredniego związku
między wytwarzaniem psilocybiny a wzrostem grzybni. Wykorzystanie techniki kultury zastępczej służyło
rozdzieleniu wzrostu i wytwarzania psilocybiny, podczas gdy metoda Bracka, et al., nie dostarczyła tego
rozróżnienia. Wywnioskowano, że wytwarzanie psilocybiny jest tak ściśle związane z proliferacją grzybni, że
podłoże zastępcze odżywczo niepełne miało małą wartość w badaniu biosyntezy psilocybiny. Jednakże,
technika ta okazała się uprzednio zadowalająca w biosyntetycznych badaniach innych pochodnych indolu w
grzybach3.
Zwiększenie skali fermentacji z 30 ml podłoża w 125 ml kolbach do 300 ml w 2800 ml kolbach wpłynęło
wyraźnie na wytwarzanie psilocybiny. Istotne różnice w uzyskach nie wystąpiły aż do siódmego dnia, gdy
9
akumulacja produktu ustała, i w dużych kolbach gwałtowniejszy spadek wystąpił gdy granule fizjologicznie się
zestarzały. Choć przyczyna tego zjawiska nie została ustalona, może być przypisana, przynajmniej częściowo,
do różnic w efektywności napowietrzenia kultur.
Podziękowania
Badanie to zostało wsparte dotacją badawczą PHS (GM-07515-03) od Division of General Medical Sciences,
Public Health Service.
Autorzy są wdzięczni dr Robertowi G. Benedictowi, z Wydziału Farmakognozji, Uniwersytetu
Waszyngtońskiego, który dostarczył kultury pierwotne wykorzystane w tym badaniu. Pragną również wyrazić
podziękowania dr Aleksandrowi H. Smithowi, Muzea Uniwersyteckie, Uniwersytetu Michigan, Ann Arbor, za
dostarczenie autorytatywnej identyfikacji zbioru grzybów z którego przygotowano izolaty.
Cytowana literatura
1. Benedict, R. G. and V. E. Tyler, Jr. 1962. Examination of mycelial cultures of Panaeolus species for tryptophan hydroxylase
activity. Lloydia 25: 46-54.
2. Brack, A., A. Hofmann, F. Kalberer, H. Kobel and J. Rutschmann. 1961. Tryptophan als biogenetische Vorstufe des Psilocybins.
Arch. Pharm. 294: 230-234.
3. Brady, L. R. and V. E. Tyler, Jr. 1959. The biosynthesis of clavine alkaloids. Planta Med. 7: 225-233.
4. Brown, J. K., M. H. Malone, D. E. Stuntz and V. E. Tyler, Jr. 1962. Paper chromatographic determination of muscarine in
Inocybe species. J. Pharm. Sci. 51: 853-856.
5. Cochrane, V. W. 1958. Physiology of fungi. John Wiley & Sons, Inc., New York. 524 pp.
6. Heim, R. and R. G. Wasson. 1958. Les champignons hallucinogenes du Mexique. Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris.
322 pp.
7. Heim, R., A. Brack, H. Kobei, A. Hofmann and R. Cailleux. 1958. Determinisme de la formation des carpophores et des
sclerotes dans la culture du Psilocybe mexicana Heim, Agaric hallucinogéne du Mexique, et mise en évidence de la psilocybine
et de la psilocine. Comp. rend. 246: 1346-1351.
8. Hofmann, A., R. Heim, A. Brack and H. Kobel. 1958. Psilocybin, ein psychotroper Wirkstoff aus dem mexikanischen
Rauschpilz, Psilocybe mexicana. Experientia 14: 107-112.
9. Hofmann, A., R. Heim, A. Brack, H. Kobei, A. Frey, H. Ott, T. Petrzilka and F. Troxler. 1959. Psilocybin und Psilocin, zwei
psychotrope Wirkstoffe aus mexikanischen Rauschpilzen. Helv. Chim. Acta 42: 1557-1572.
10. Schultes, R. 1960. Botany attacks the hallucinogens. Third Annual Visiting Lecture Series in the Pharmaceutical Sciences,
College of Pharmacy, University of Texas, Austin. pp. 169-185.
11. Singer, R. 1958. Mycological investigations on teonanácatl, the Mexican hallucinogenic mushroom. I. The history of
teonanácatl, field work and culture work. Mycologia 50: 239-261.
12. Stein, S. I. 1958. Observations on agarics causing cerebral mycetism. I. An unusual effect from a species of Mexican
mushrooms Psilocybe cubensis. Mycopathol. et Mycol. Appl. 9: 263-267.
13. Tyler, V. E., Jr. 1958. Occurrence of serotonin in a hallucinogenic mushroom. Science 128: 718.
14. Wasson, R. G. 1961. The hallucinogenic fungi of Mexico: an inquiry into the origins of the religious idea among primitive
peoples. Botan. Museum Leaflets, Harvard Univ. 19: 137-162.
15. Wasson, R. G. and V. P. Wasson. 1958. The hallucinogenic mushrooms. Garden J. N. Y. Botan. Garden 8: 1-5.
16. Wieland, T. and W. Motzel. 1953. Über das Vorkommen von Bufotenin in gelben Knollenblätterpilz. Ann. Chem. Liebigs 581:
10-16.
[ tłumaczenie: cjuchu ]
10

wytwarzanie psilocybiny w zanurzonej kulturze psilocybe cubensis

Transkrypt

Podobne dokumenty

uprawa grzybów na łące

psilocybe azurescens raport z uprawy

azurescens foundation - uprawa psilocybe azurescens

uprawa psilocybe azurescens w lodówce

Zasady grzybobrania: • Grzyby zbieramy do przewiewnych koszy

uprawa panaeolus cyanescens i panaeolus tropicalis

GanoCord

Sylwetka firmy Kanmycel - Wytwórnia Grzybni Pieczarek

ampco 15 - AMPCO METAL

RD-DECO ACRYL EXTRA MAT