Monoclonal Mouse

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Myogenin
Clone F5D
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS067
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Myogenin, klon F5D, Ready-to-Use, (Dako Autostainer/Autostainer
Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus.
Przeciwciało znakuje białko miogeninę w tkankach prawidłowych i nowotworowych, takich jak mięsak
poprzecznie prążkowany i guz Wilmsa (1). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być
uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być
przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań
diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Gen miogeniny należy do rodziny genów miogenicznych, która obejmuje MyoD, myf5 i MRF4. W genach tych jest
zakodowany zestaw czynników transkrypyjnych koniecznych do rozwoju mięśni. Stwierdzono, że transfekcje
miogeniny w komórkach multipotencjalnych mezodermalnych przekształcają komórki mezodermalne w mioblasty
(2-4). Ekspresja miogeniny jest ograniczona do komórek pochodzących z mięśni szkieletowych (2). Białko
miogeniny istnieje w postaci dimeru lub tetrameru, lecz najczęściej występuje jako struktury wyższego rzędu (5).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z
zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości,
7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do użycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i azydek sodu o stężeniu 0,015 mol/L.
Klon: F5D (6). Izotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Peptyd miogeniny szczurzej (aa 73-94) z białkiem nośnikowym i peptydem fuzyjnym zawierającym miogeninę aa
30-224 (6).
Swoistość
Przeciwciało rozpoznaje epitop zlokalizowany w regionie aminokwasów 138-158 białka miogeniny; stwierdzono,
że znakuje miogeninę w ludzkich, mysich i szczurzych miotubach hodowanych oraz w próbkach tkanek
noworodków kocich, mysich i szczurzych (6).
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
Przechowywanie
(118597-001)
Do stosowania przez wyszkolony personel.
Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, należy stosować
właściwe procedury postępowania.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą należy nosić odpowiednie osobiste wyposażenie ochronne.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta należy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
307694PL_001 str. 1/3
Przygotowanie próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe należy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy użyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(10x), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010/K8014).
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, które zostały odparafinowane, zalecany jest odczynnik Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101).
Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja użytkownika aparatu PT Link.
Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX
Target Retrieval Solution, High pH (10x), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010/K8014). Dla
aparatów PT Link należy stosować następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C;
temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97°C przez 20 (±1) minut, ochłodzić do 65°C. Usunąć statywy na
szkiełka aparatu Autostainer wraz ze szkiełkami ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w
słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX
Wash Buffer (10x), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010) o temperaturze pokojowej. Zostawić
szkiełka w buforze Wash Buffer na 1-5 minut.
Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i
odmaskowanie można wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje można
znaleźć w Instrukcji użytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe
należy poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów
Dako Autostainer/Autostainer Plus, przy użyciu następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych
odczynników)
Autoprogram: Myog (bez barwienia kontrastowego) lub MyogH (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” należy ustawić opcję „rinse buffer” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku
programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary należy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy
płukania.
Wszystkie procedury inkubacji należy również przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe
informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w używanym
aparacie Dako Autostainer, należy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i
powinny być określone indywidualnie w każdym laboratorium. Aby możliwe było wykonanie oceny przez
patologów z różnym nasileniem odczynu preparatów, należy skontaktować się z działem obsługi/obsługą
techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. Należy upewnić
się, że działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu należy ocenić, czy odczyn jest taki jak
opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy użyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów należy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z użyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować mięsaka
poprzecznie prążkowanego, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny
wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana
kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750).
Interpretacja
wybarwienia
Przeciwciała dają reakcję jądrową, chociaż mogą również wystąpić ślady odczynu cytoplazmatycznego.
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: Przeciwciało znakuje jądra komórkowe mioblastów z kończyn płodu ludzkiego, jednak nie
odnotowano odczynu w tkankach mięśni szkieletowych osób dorosłych (1).
Tkanki patologiczne: Przeciwciało dało odczyn w przypadku większości poddanych rutynowym badaniom tkanek
mięsaków poprzecznie prążkowanych i guzów Wilmsa. Nie stwierdzono odczynu immunologicznego w
przypadku mięsaka Ewinga/pPNET i neuroblastomy. Ekspresja jądrowa miogeniny jest odwrotnie proporcjonalna
do stopnia zróżnicowania komórek nowotworowych mięsaka poprzecznie prążkowanego (1).
(118597-001)
307694PL_001 str. 2/3
Piśmiennictwo
1.
Wang NP, Marx J, McNutt MA, Rutledge JC, Gown AM. Expression of myogenic regulatory proteins
(myogenin and MyoD1) in small blue round cell tumors of childhood. Am J Pathol 1995; 147:1799-810.
2.
Wright WE, Sassoon DA, Lin VK. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to
MyoD. Cell 1989; 56:607-17.
3.
Auradé F, Pinset C, Chafey P, Gros F, Monterras D. Myf5, MyoD, myogenin and MRF4 myogenic
derivatives of the embryonic mesenchymal cell line C3H10T1/2 exhibit the same adult muscle phenotype.
Differentiation 1994; 55:185-92.
4.
Weintraub H, Davis R, Tapscott S, Thayer M, Krause M, Benezra R, et al. The myoD gene family: Nodal
point during specification of the muscle cell lineage. Science 1991; 251:761-6.
5.
Farmer K, Catala F, Wright WE. Alternative multimeric structures affect myogenin DNA binding activity. J
Biol Chem 1992; 267:5631-6.
6.
Wright WE, Dac-Korytko I, Farmer K. Monoclonal antimyogenin antibodies define epitopes outside the bHLH
domain where binding interferes with protein-protein and protein-DNA interaction. Dev Genet 1996; 19:131-8.
Wydanie 04/08
(118597-001)
307694PL_001 str. 3/3