FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Podoplanin Clone

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human Podoplanin
Clone D2-40
Ready-to-Use
(Link)
Code IR072
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Podoplanin, klon D2-40, Ready-to-Use, (Link), przeznaczone
jest do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciała te znakują marker
podoplaniny w śródbłonku naczyń limfatycznych w tkankach prawidłowych i nowotworowych. Przeciwciała mogą
być przydatne do identyfikacji rozsiewu limfatycznego szeregu nowotworów (1, 2). Interpretacja kliniczna
wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem
odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z
uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Podoplanina jest sialoglikoproteiną przezbłonową o masie ~38 kDa , usieciowaną wiązaniami O-glikozydowymi,
ulegającą ekspresji w śródbłonku naczyń limfatycznych, ale nie w naczyniach krwionośnych (3). Poza ekspresją
w śródbłonku naczyń limfatycznych podoplanina występuje takŜe w wielu innych tkankach: komórkach
międzybłonka, komórkach retikularnych, komórkach dendrycznych grudek chłonnych, guzach zarodkowych
jajników i jąder (4). Wykazano równieŜ, Ŝe przeciwciało przeciw podoplaninie reaguje ze śródbłonkiem naczyń
limfatycznych, a nie reaguje ze śródbłonkiem naczyń krwionośnych (1, 2). Ponadto wykazano, Ŝe w tkance
nowotworowej odczyn immunologiczny śródbłonka limfatycznego z zastosowaniem przeciwciała przeciw
podoplaninie jest przydatny w diagnostyce nacieku limfatycznego guzów pierwotnych (1, 2). Dodatkowo
udowodniono, Ŝe zastosowanie markerów kalretyniny i podoplaniny pomaga w odróŜnieniu międzybłoniaka od
przerzutowego gruczolakoraka (5). Wykazano równieŜ, Ŝe podoplanina jest przydatnym markerem do diagnostyki
róŜnicowej nasieniaków i mięsaków komórek dendrytycznych (6).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z
zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości,
7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: D2-40 (7). Izotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Tkanka rozrodczaka (7).
Swoistość
Przeciwciała przeciwko podoplaninie, Clone D2-40, badano metodą Western blot na lizatach róŜnych linii
komórek nowotworowych. W badaniach komórek HEY raka nabłonkowego jajnika metodą immunoblotting
przeciwciała tworzą prąŜek ~40 kDa, a w badaniach komórek MGH-U3 — związek o nieco większej masie
cząsteczkowej. Reaktywność immunologiczną D2-40 obserwowano takŜe w testach Western blot komórek SKOV-3 i Caov-3 raka nabłonkowego jajnika, komórek PA-1 PA-1 potworniaka złośliwego jajnika, komórek Tera-1 i
Tera-2 potworniaka złośliwego jądra, komórek 833 raka zarodkowego, komórek RT-4 raka z nabłonka dróg
moczowych pęcherza oraz komórek U-2 OS kostniako-mięsaka. Nie zaobserwowano reaktywności w testach
Western blot innych linii komórek nowotworowych, pochodzących z róŜnych nowotworów. (7).
Wpływ trawienia enzymatycznego na reaktywność immunologiczną klonu D2-40 badano przy uŜyciu
niezmienionych komórek HEY oraz antygenu z komórek HEY oczyszczonego pod względem powinowactwa.
Reaktywność immunologiczna w testach Western blot oczyszczonego antygenu oraz w komórkach badanych
metodą cytometrii przepływowej nie uległa zmianie po usunięciu pozostałości kwasu sialowego przez obróbkę
komórek lub białek z zastosowaniem neuraminidazy. Stwierdzono, Ŝe obróbka białek lub komórek z
zastosowaniem O-sialoglikoproteazy upośledza reaktywność immunologiczną klonu D2-40 zarówno w badaniach
Western blot, jak i w cytometrii przepływowej, co świadczy o tym, Ŝe antygen rozpoznawany przez D2-40 jest
glikoproteiną z wiązaniem O-glikozydowym (7).
Środki ostroŜności
1.
2.
3.
4.
(118653-002)
Do stosowania przez wyszkolony personel.
Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
307710PL_002 str. 1/4
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x), (Link) (nr kat. K8000/K8004).
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, które zostały odparafinowane, zalecany jest odczynnik Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101).
Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link.
Postępować według procedury wstępnej obróbki zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target
Retrieval Solution, High pH (50x), (Link) (nr kat. K8000/K8004). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować
następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas odmaskow ania antygenu:
97°C przez 20 (±1) minut, ochłodzi ć do 65°C. Usun ąć statywy na szkiełka aparatu Autostainer wraz ze szkiełkami
ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat.
PT109) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX Wash Buffer (20x), (Link) (nr kat. K8000) o
temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1-5 minut.
Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i
odmaskowanie moŜna wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje moŜna
znaleźć w Instrukcji uŜytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe
naleŜy poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym system wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer
Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania
szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli
protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia
technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze
pokojowej.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i
powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez
patologów z róŜnym nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą
techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić
się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak
opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat.
K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować wyrostek
robaczkowy i migdał, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać
odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola
ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Odczyn komórkowy ma charakter cytoplazmatyczny i błonowy.
Charakterystyka
działa
Tkanki normalne: Przeciwciała charakteryzują się silną reaktywnością immunologiczną wobec komórek
śródbłonka naczyń limfatycznych, komórek zwojów nerwowych i nerwów w wielu rodzajach prawidłowych tkanek.
W Ŝadnych tkankach prawidłowych nie zaobserwowano reaktywności wobec komórek śródbłonka naczyń
krwionośnych (8).
(118653-002)
Rodzaj tkanki (liczba testowanych
przypadków)
Składniki komórkowe dające odczyn dodatni
Nadnercza (3)
2/3 cytoplazma fibroblastów torebki;
1/3 cytoplazma fibroblastów śródmiąŜszowych;
1/3 cytoplazma limfocytów części przytorebkowej
Wyrostek robaczkowy (11)
9/11 cytoplazma komórek śródbłonka
Szpik kostny (3)
0/3
Mózg, móŜdŜek (3)
3/3 cytoplazma włókien sieci nerwowych
307710PL_002 str. 2/4
Mózg, mózgowie (3)
3/3 jądra nielicznych astrocytów
Gruczoły sutkowe (3)
3/3 cytoplazma komórek mięśniowo-nabłonkowych
Szyjka macicy (3)
3/3 błona komórkowa i/lub cytoplazma komórek podstawnych
nabłonka,
3/3 cytoplazma fibroblastów podścieliska
Jelito grube (3)
2/3 limfocyty
Przełyk (3)
1/3 cytoplazma komórek zwojów nerwowych w mięśniach;
1/3 cytoplazma komórek podstawnych nabłonka
Serce (3)
2/3 cytoplazma miocytów
Nerki (3)
1/3 cytoplazma fibroblastów części przytorebkowej
Wątroba (3)
0/3
Płuca (3)
2/3 cytoplazma komórek nabłonka oskrzeli;
3/3 obrzeŜe cytoplazmy komórek pęcherzyków płuc
Komórki międzybłonka (3)
1/3 cytoplazma komórek międzybłonka
Jajniki (3)
3/3 cytoplazma komórek podścieliska jajnika;
1/3 cytoplazma komórek nabłonka powierzchniowego torbieli
inkluzyjnych
Trzustka (3)
2/3 cytoplazma fibroblastów okołoprzewodowych;
1/3 cytoplazma komórek mięśniowo-nabłonkowych przewodów
Przytarczyce (3)
0/3
Nerwy obwodowe (3)
2/3 cytoplazma komórek onerwia
Przysadka mózgowa (3)
1/3 cytoplazma fibroblastów części przytorebkowej przedniego
płata przysadki; 1/3 cytoplazma włókien nerwowych przedniego
płata przysadki
Gruczoł krokowy (3)
3/3 cytoplazma komórek podstawnych przewodzików;
3/3 cytoplazma fibroblastów podścieliska
Ślinianki (3)
3/3 cytoplazma komórek przewodzików i komórek zrazikowych
mięśniowo-nabłonkowych
Mięśnie szkieletowe (3)
3/3 cytoplazma omięsnej
Skóra (3)
3/3 cytoplazma komórek mięśniowo-nabłonkowych struktur
przydatków
Jelito cienkie (3)
3/3 cytoplazma śródściennego splotu nerwowego jelit
Śledziona (3)
0/3
śołądek (3)
3/3 cytoplazma fibroblastów okołogruczołowych;
1/3 cytoplazma śródściennego splotu nerwowego jelit;
1/3 cytoplazma i błona komórkowa limfocytów ośrodków
rozmnaŜania
Jądra (3/3)
3/3 cytoplazma fibroblastów okołokanalikowych
Grasica (3)
3/3 cytoplazma i błona komórkowa limfocytów rdzenia
Tarczyca (3)
0/3
Migdałki (3)
3/3 cytoplazma i błona komórkowa komórek podstawnych
nabłonka i limfocytów ośrodków rozmnaŜania
Macica (3)
3/3 cytoplazma komórek mięśniówki macicy;
1/3 cytoplazma komórek gruczołów endometrium
Tkanki nieprawidłowe (2, 7):
(118653-002)
Rodzaj tkanki (liczba testowanych
przypadków)
Tkanki dające dodatni odczyn
Mięsak Kaposiego (24):
Stadium plamy, płytki i guzka
24/24
Naczyniak chłonny (10)
10/10 śródbłonek wyściełający przestrzenie zatok naczyniowych
Mięsak naczyniowy (7)
3/7
Mięsak gładkokomórkowy (10)
3/10
Włókniak skóry (6)
2/6
Złośliwy guz włóknisty z histiocytów (2)
1/2
Naczyniak (10)
0/10
Kłębczak (3)
0/3
Tłuszczak z tkanki naczyniowej (2)
0/2
307710PL_002 str. 3/4
Ziarniniak ropotwórczy (2)
0/2
Wada rozwojowa naczyń (2)
0/2
Naczyniak pericytarny (1)
0/1
Naczyniak z komórek
śródbłonkowych (1)
0/1
Guzowaty włókniakomięsak skóry (4)
0/4
Włókniakonerwiaki (6)
0/6
Pure germ cell tumors
Nasieniaki (35)
34/35
Raki zarodkowe (5)
1/5
Potworniaki niedojrzałe i dojrzałe (1)
0/1
Mieszane guzy zarodkowe
Nasieniaki (12)
12/12
Raki zarodkowe (21)
17/21
Potworniaki niedojrzałe i dojrzałe (16)
5/16
Rak z pęcherzyka Ŝółtkowego (4)
1/4
Nabłoniak kosmówkowy złośliwy (2)
0/2
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Kahn HJ, Marks A. A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary
tumors. Lab Invest 2002;82: 1255-7.
Kahn HJ, Bailey D, Marks A. Monoclonal antibody D2-40, a new marker of lymphatic endothelium, reacts
with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas. Mod Pathol 2002; 15:434-40.
Breiteneder-Geleff S, Soleiman A, Kowalski H, Horvat R, Amann G, Kriehuber E, et al. Angiosarcomas
express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker
for lymphatic endothelium. Am J Pathol 1999; 154:385-94.
Kalof AN and Cooper K. D2-40 Immunohistochemistry – So Far! Adv Anat Pathol 2009; 16:62-4.
Chu AY, Litzky LA, Pasha TL, Acs G, Zhang PJ. Utility of D2-40, a novel mesothelial marker, in the
diagnosis of malignant mesothelioma, Mod Pathol 2005, 18:105-110.
Yu H, Gibson JA, Pinkus GS, Hornick JL. Podoplanin (D2-40) is a novel marker for follicular dendritic cell
tumors. Am J Clin Pathol 2007; 128:776-82.
Marks A, Sutherland DR, Bailey D, Iglesias J, Law J, Lei M, et al. Characterization and distribution of an
oncofetal antigen (M2A antigen) expressed on testicular germ cell tumours. Br J Cancer 1999; 80:569-78.
IHC003 Report On File
Wydanie 07/12
(118653-002)
307710PL_002 str. 4/4