Wydzielanie i oczyszczanie PLE

Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
Rok akad. 2012/2013
Wydzielanie i oczyszczanie PLE
Esteraza z wątroby świńskiej (ang. – Pig Liver Esterase, PLE)
Esteraza z wątroby świńskiej (E.C. 3.1.1.1) jest esterazą typu serynowego. PLE jest mieszaniną
izoenzymów złożonych z trzech podjednostek α, β i γ, które wykazują różnice w specyficzności
substratowej, optimum pH i enancjoselektywności. Głównymi składnikami PLE są trimery
γγγ, αγγ, ααγ, ααα, które można wydzielić za pomocą elektroforezy w gradiencie pH. Frakcja I
składa się tylko z podjednostek γ i wykazuje aktywność cholinoesterazową (hydrolizuje
butyrylocholinę), natomiast frakcja V to podjednostki α i preferuje hydrolizę maślanu metylu.
Asp
His
Asp
Ser
His
Ser
O
R
C
O
H O
-
O
H N
R
O
1
R
N
O
C
O
OH
N
NH
O
O
-
1
R
1
- R OH
-RCONu
Asp
His
Asp
Ser
His
Ser
R
O
O
C
O H
N
N
H
Nu
O
-
O
O
O
C
OH
N
NH
R
Nu
-
Schemat 1. Mechanizm hydrolizy estrów
W centrum aktywnym hydrolaz typu serynowego występuje triada katalityczna aminokwasów:
seryny, histydyny i kwasu asparaginowego. Schemat działania tej klasy enzymów przedstawiony jest na
Schemacie 1. Istotą działania jest przeniesienie grupy acylowej (transacylacja) z cząsteczki estru na
cząsteczkę nukleofilowego akceptora, zgodnie z reakcjami:
1) RCOOR1 + H2O → RCOOH + R1OH
2) RCOOR1 + R2OH → RCOOR2 + R1OH
3) RCOOR1 + R2NH2 → RCONHR2 + R1OH
4) RCOOR1 + R2COOH → R(CO)O(CO)R2 + R1OH
5) RCOOR1 + H2O2 → RCOOOH + R1OH
1/9
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
Rok akad. 2012/2013
Jak widać z powyższych reakcji, PLE może katalizować reakcje hydrolizy, transesteryfikacji, tworzenia
amidów, bezwodników kwasowych, nadkwasów.
PLE charakteryzuje się dobrą stabilnością, stereoselektywnością, nie wymaga kofaktorów,
a ponadto może być używana zarówno w środowisku wodnym jak i organicznym. Preparat handlowy
PLE nie jest jednak tani, więc samodzielne wyodrębnienie enzymu z tkanki zwierzęcej pozwala na
zredukowanie kosztów prowadzenia badań. Wiąże się to jednak z koniecznością monitorowania
właściwości przy izolacji każdej nowej porcji preparatu, ponieważ parametry (aktywność,
selektywność) mogą się zmieniać w zależności od źródła materiału biologicznego (rasy, wieku, diety
itp.).
PLE nie jest enzymem uniwersalnym. Najlepiej katalizuje reakcje dyssymetryzacji związków
prochiralnych lub związków mezo. W wyniku tego typów reakcji z achiralnego substratu otrzymuje się
optycznie czynny produkt, o wysokim nadmiarze enancjomerycznym (stosowne definicje w dalszej
części instrukcji). Przykłady reakcji katalizowanych przez PLE przedstawione są na Schemacie 2.
COOEt
COOH
W = 90%
COOEt ee = 81%
COOEt
OAc
OAc
ee = 86%
OAc
OH
Schemat 2. Reakcje katalizowane przez PLE
Izolacja enzymów z materiału biologicznego
Enzymy, naturalne katalizatory reakcji chemicznych, mogą być izolowane z bardzo
różnorodnych źródeł, m. in. z mikroorganizmów (lipaza z Candida antarctica, lipaza z Pseudomonas
cepacia), roślin (lipaza z kiełków pszenicy, amylazy z jęczmienia) i tkanek zwierzęcych (esteraza
z wątroby świńskiej, lipaza z trzustki wieprzowej). Metody wydzielania enzymu z materiału
biologicznego różnią się w zależności od źródła i rodzaju biokatalizatora, można jednak z reguły
wyróżnić pewne etapy oczyszczania.
1. Rozbicie komórek w celu uwolnienia zawartych w nich białek.
2. Wydzielenie z lizatu frakcji białkowej.
3. Wydzielenie frakcji białek posiadających żądaną aktywność katalityczną.
4. Oznaczenie aktywności wydzielonych frakcji.
2/9
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
Rok akad. 2012/2013
Na każdym etapie wydzielania należy mieć na uwadze takie cechy enzymów jak nietrwałość
w pH poniżej 5.0 i powyżej 9.0, łatwość ulegania denaturacji cieplnej i wrażliwość na obecność metali
ciężkich. Enzymy w większości dobrze rozpuszczają się w wodzie i w buforach, niektóre rozpuszczają
się tylko w rozcieńczonych roztworach soli, kwasów i zasad. O rozpuszczalności decyduje przede
wszystkim zdolność do hydratacji, budowa chemiczna i parametry roztworu (obecne sole, pH).
W roztworze wodnym cząsteczki białka otoczone są płaszczem wodnym tzw. wodą hydratacyjną.
Hydratacja polega na elektrostatycznym oddziaływaniu dipoli wody z polarnymi łańcuchami bocznymi
aminokwasów oraz z atomami O i N w wiązaniu peptydowym. Ilość wody hydratacyjnej zależy od
natury białka i powoduje stabilizację struktury przestrzennej, ponieważ polarne łańcuchy boczne
znajdują się nie tylko na powierzchni, ale też są schowane pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi.
Woda hydratacyjna wpływa więc na właściwości i strukturę białek, a enzymy pozbawione otoczki
hydratacyjnej stają się nieaktywne. Część enzymów wymaga do działania niebiałkowych kofaktorów,
których utrata w procesie oczyszczania prowadzi do inaktywacji enzymu.
1. Rozbicie komórek w celu uwolnienia zawartych w nich białek
Enzymy mogą występować w komórkach w stanie wolnym, ale w większości przypadków są
związane z pewnymi strukturami komórkowymi. Metody stosowane do uwalniania enzymów muszą
skutecznie niszczyć komórki, ale jednocześnie powinny być na tyle delikatne, aby nie powodować ich
dezaktywacji. Stosuje się różne techniki w zależności od materiału biologicznego z którym mamy do
czynienia, najczęściej w przypadku tkanek jest to mechaniczna homogenizacja w młynkach
wysokoobrotowych ale może to też być liza osmotyczna, cykliczne zamrażanie i rozmrażanie oraz
rozbijanie ultradźwiękami.
Homogenizację tkanek przeprowadza się najczęściej w roztworach buforowych i po
odwirowaniu nierozpuszczalnych frakcji komórkowych otrzymuje się roztwór białek i innych
związków nazywany supernatantem. Ponieważ roztwory takie są dość nietrwałe, więc najlepiej
przechowywać je w stanie głębokiego zamrożenia (-78oC) z dodatkiem substancji krioochronnych
(np. glicerolu).
2. Wydzielenie frakcji białkowej
Wytrącenie frakcji białkowej uzyskuje się najczęściej poprzez wytrącanie z roztworów
wodnych za pomocą rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą, takich jak aceton lub
etanol. Dodanie tych rozpuszczalników zmniejsza rozpuszczalność białek w wodzie i powoduje ich
wytrącanie. Jednak długotrwały wpływ rozpuszczalnika organicznego w temperaturze pokojowej
i powyżej powoduje denaturację białka, dlatego wytrącanie prowadzi się w obniżonej temperaturze, za
3/9
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
pomocą
uprzednio
Rok akad. 2012/2013
schłodzonych
rozpuszczalników,
minimalizując
czas
kontaktu
białek
z rozpuszczalnikiem.
Można połączyć dezintegrację materiału biologicznego z wytrąceniem frakcji białkowej
w jeden etap i homogenizację przeprowadzić w polarnych rozpuszczalnikach organicznych
mieszających się z wodą. Rozpuszczalnik usuwa wodę z układu i preparat enzymatyczny otrzymuje się
w formie suchego proszku (np. homogenizacja w acetonie daje tzw. proszek acetonowy). Metoda ta
pozwala wstępnie oczyścić
preparat z
substancji
lipidowych i
innych
rozpuszczalnych
w rozpuszczalnikach organicznych.
3. Wydzielanie frakcji białek posiadających żądaną aktywność katalityczną
Najczęściej stosowane metody, to:
Frakcjonowanie roztworami soli. Dodatek soli w małym stężeniu wpływa korzystnie na
rozpuszczalność białek w buforach. Duże stężenie soli, szczególnie tych łatwo tworzących wodziany
(na przykład siarczan(VI) amonu, sodu lub magnezu) powoduje zmniejszenie rozpuszczalności
i wytrącenie białka – proces ten nazywa się wysalaniem. Proces ten jest odwracalny i nie powoduje
denaturacji białka. Stężenie soli potrzebne do wytrącenia białka zależy od właściwości danego białka
i od pH środowiska. Najmniejszą rozpuszczalność ma białko w punkcie izoelektrycznym (pH,
w którym wypadkowy ładunek białka jest równy zero). Dodatkowo można oczyścić wysolone białko
od soli w procesie dializy lub filtracji żelowej.
Metody chromatograficzne. Najbardziej użyteczna w frakcjonowaniu białek jest chromatografia
kolumnowa. W zależności od metody wykorzystuje się różnice w wielkościach cząsteczek, ich ładunku
oraz zdolności wiązania ze specyficznymi związkami.
a) Chromatografia jonowymienna. Wykorzystuje się zdolność białka obdarzonego ładunkiem elektrycznym
do wiązania się z wymieniaczem jonowym (na przykład anionit DEAE-Sephadex lub kationit
CM-Sephadex). Im większy jest wypadkowy ładunek białka, tym silniej wiąże się ono z fazą
stacjonarną i tym później wymywane jest z kolumny za pomocą roztworu NaCl o wzrastającym
gradiencie.
b) Chromatografia powinowactwa. Wykorzystuje się powinowactwo białka do ligandu osadzonego
(immobilizowanego) na fazie stacjonarnej. Ligandem dla enzymu może być substrat lub inhibitor.
Metoda ta pozwala na bardzo dokładne oczyszczenie wymaganego enzymu.
c) Filtracja żelowa. Rozdział białek wykorzystujący różnice w ich budowie i kształcie. Fazę stacjonarną
stanowi porowate wypełnienie (na przykład poliakryloamid, dekstran lub agaroza). Mniejsze cząsteczki
dyfundują w pory żelu i są wymywane z kolumny później niż większe. Dostępne są wypełnienia
o różnej wielkości porów, co pozwala na dokładne dobranie warunków rozdziału.
4/9
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
Rok akad. 2012/2013
4. Oznaczenie aktywności wydzielonych frakcji
Jeżeli dla danego enzymu możemy dobrać modelowy związek, który w wyniku przekształcania
przez enzym daje produkt o innych właściwościach spektroskopowych (maksimum absorbancji,
współczynnik ekstynkcji molowej) to do oznaczenia aktywności można wykorzystać metody
spektrofotometryczne. Dla enzymów hydrolitycznych dobrymi substratami modelowymi są estry
p-nitrofenolu (Schemat 3, substrat jest bezbarwny, zaś produkt jego hydrolizy jest żółty
(λmax = 410 nm)).
O
OH
O
R
O
Enzym
+
R
OH
NO2
NO2
barwny
Schemat 3. Hydroliza estrów p-nitrofenolu
Ważne pojęcia:1
Nadmiar enancjomeryczny (ee, enantiomeric excess) – miara czystości optycznej związku
wyrażona w procentach. Wielkość określająca nadmiar (ilościowy) jednego enancjomeru w stosunku
do drugiego. Przyjmuje się, że ma zawsze wartość dodatnią i definiuje się jako stosunek różnicy
zawartości poszczególnych enancjomerów do ich sumy.
eeR =
[ R] − [ S ]
⋅ 100%
[ R] + [S ]
eeS =
[S ] − [ R]
⋅ 100%
[ R] + [S ]
Nadmiar enancjomeryczny może być wyznaczony metodami:
1) porównanie wartości skręcalności właściwych, jednak konieczna jest znajomość wartości
skręcalności właściwej dla czystych enancjomerów:
ee =
D
[α ]bad
− 41°
⋅ 100% np. jeżeli [α]Dlit=-47o dla (S), a [α]Dbad=-41o, to ee S =
⋅ 100% = 87,2%
D
− 47°
[α ]lit
2) chromatografia cieczowa HPLC lub gazowa na kolumnach z chiralnym wypełnieniem, które
różnie oddziaływuje z enancjomerami i powoduje różnicowanie ich czasów retencji.
3) spektrometria 1HNMR z dodatkiem odczynnika przesunięcia chemicznego np. kompleksu
europu, który powoduje tworzenie diastereoizomerycznych kompleksów z enancjomerami, a tym
samym różnicowanie sygnałów protonów pochodzących od poszczególnych izomerów.
1
Widmo 1HNMR do wyznaczanie ee podane zostało tylko jako ciekawostka. Nie oczekuje od Państwa znajomości
zasad interpretacji widm, ale oczywiście jeżeli ktoś będzie chętny zaznajomić się z metodyką to policzone będzie jako
plus. Natomiast metoda wyznaczania ee za pomocą skręcalności i HPLC jak najbardziej obowiązuje i można
spodziewać się stosownego pytania.
5/9
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
Rok akad. 2012/2013
Schemat 4. Chromatogramy HPLC mieszaniny racemicznej i optycznie czynnego związku
Schemat 5. Widma 1HNMR N-metylofenyloaminy i N-fenylometyloaminy z dodatkiem
odczynnika przesunięcia chemicznego (kompleks europu)
6/9
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
Rok akad. 2012/2013
Enancjoselektywność reakcji katalizowanej enzymatycznie – enzymy można traktować jako
bardzo szczególne chiralne katalizatory, które preferują szybsze przekształcanie tylko jednego
z enancjomerów. Im różnica w szybkościach jest większa, tym reakcja jest bardziej enancjoselektywna,
tzn. prowadzi do produktu o wyższym nadmiarze enancjomerycznym (w przypadku idealnym do
związku o ee=100%, czyli czystego enancjomeru). Miarą enancjoselektywności reakcji jest tzw.
współczynnik enancjoselektywności (E), który można wyznaczyć ze wzorem:
ln [ (1- ees) (
E=
ln [ (1+ ees) (
eep
eep + ees
eep
eep + ees
)]
)]
Jeżeli E jest z zakresu:
a) E<15, reakcja jest nieenancjoselektywna, produkty mają niskie nadmiary enancjomeryczne.
b) E=15-30, reakcja jest średnio-selektywna, a nadmiary enancjomeryczne produktów kształtują
się na poziomie ee=50-70%.
c) E>100, mamy do czynienia z reakcją bardzo enancjoselektywną, a uzyskiwane ee są rzędu
90-100%.
Związek prochiralny – związek achiralny zawierający kilka równocennych chemicznie grup,
z których jedna może ulegać reakcji, w końcowym efekcie dając związek chiralny np.
grupy prochiralne
COOEt
COOEt
COOEt
COOH
(R)
związek prochiralny
Część doświadczalna
1. Wydzielanie preparatu enzymatycznego PLE (część pokazowa)
Sprzęt i odczynniki: młynek (homogenizator) wysokoobrotowy, lejek Schotta, kolba
ssawkowa, schłodzony aceton (500 ml), schłodzony chlorek metylenu (200 ml).
Procedura: Posiekaną wątrobę wieprzową (100 g) homogenizuje się w młynku (22000
obr/min) w acetonie (300 ml) przez 40 s. Otrzymaną zawiesinę należy przesączyć przez lejek Schotta.
Brunatny osad ponownie homogenizuje się (22000 obr/min) w acetonie (150 ml) przez kolejne 40 s.
Po ponownym przesączeniu osad homogenizuje się w chlorku metylenu (150 ml) przez 20 s.
7/9
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 1
Rok akad. 2012/2013
Odsączony osad umieszcza się w eksykatorze i najpierw suszy pod zmniejszonym ciśnieniem (pompka
wodna), a później pod próżnią (pompa olejowa). Należy zbadać aktywność hydrolityczną
otrzymanego preparatu.
2. Oczyszczanie PLE z preparatu enzymatycznego przez wysalanie
Sprzęt i odczynniki: wirówka, zlewki, mieszadło magnetyczne, łaźnia lodowa, preparat
enzymatyczny PLE, bufor fosforanowy pH 7.20, siarczan(VI) amonu.
Procedura: Do próbówki typu Falcone o poj. 15ml odważyć 1,20g surowego preparatu PLE
z wątroby świńskiej i 12 ml buforu fosforanowego pH 7,20. Próbkę wytrząsa się przez kilka minut
i ewentualnie dodatkowo umieszcza w płuczce ultradźwiękowej na kolejne 3 min. Otrzymaną
zawiesinę wiruje się przez 10 min przy 10000 obr/min. Supernatant zlewa się do skalowanej
próbówki, aby dokładnie zmierzyć objętość otrzymanego roztworu, a następnie przenosi do zlewki
zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne (wielkość zlewki zależy od stopnia wysolenia). Zlewkę
umieszcza się w łaźni z lodem i chłodzi zawartość przez 5 min. Następnie stopniowo dodaje się
odpowiednią objętość nasyconego roztworu siarczanu(VI) amonu, doprowadzając do zadanego
wysycenia roztworu (do samodzielnego wyliczenia, należy przyjąć, że rozpuszczalność siarczanu(VI)
amonu w wodzie w 4°C wynosi 70.6 g) Proces prowadzi się chłodząc przez 1 h. Później zawiesinę
wiruje się przez 10 min (10000 obr/min), a po zlaniu supernatanu, osad suszy się pod zmniejszonym
ciśnieniem.
3. Zadanie rachunkowe
W celu oczyszczenia preparatu enzymatycznego PLE student przygotował próbkę zawierającą
500 mg surowego preparatu enzymatycznego i 7 ml buforu fosforanowego o pH=7,2. Następnie
próbkę poddał działaniu ultradźwięków i wirowaniu w wyniku czego otrzymał 11 ml supernatantu.
Jaką objętość nasyconego roztworu (NH4)2SO4 należy dodać do supernatantu, aby stopień wysycenia
siarczanem (VI) amonu otrzymanego roztworu wynosił 70% (rozpuszczalność (NH4)2SO4 w H2O w
4oC wynosi 70.6g/100g, d=1,244 g/ml)?
Literatura:
„Krótkie wykłady: biochemia” B.D. Hames, N.M. Hooper, J.D. Houghton, PWN, 2001
„Ćwiczenia z biochemii” praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko-Stefanowicz, PWN,
2003
"Biochemia - ćwiczenia praktyczne dla studentów wydziału farmaceutycznego" pod redakcją
Lidii Włodek, Wydawnictwo UJ, Kraków, 2000
8/9
Bilans oczyszczania PLE
Grupa
Wysolenie [%]
Masa preparatu surowego [g] / wysolonego [g]
PLEsur: Ilość białka [mg/g preparatu]
PLEwys: Ilość białka [mg/g preparatu]
PLEsur: Ilość białka całkowita [mg]
PLEwys: Ilość białka całkowita [mg]
PLEsur: Aktywność [µmol/min*mg prepar.]
PLEwys: Aktywność [µmol/min*mg prepar.]
PLEsur: Aktywność właściwa [µmol/min*mg białka]
PLEwys: Aktywność właściwa [µmol/min*mg białka]
PLEsur: Ogólna liczba jednostek [µmol/min]
PLEwys: Ogólna liczba jednostek [µmol/min]
Wydajność oczyszczenia [%]
Stopień oczyszczenia
9/9