prof. dr hab. Hanna Rokita

UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI
W KRAKOWIE
WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII
PRACOWNIA GENETYKI MOLEKULARNEJ I WIRUSOLOGII
KIEROWNIK
PROF. DR HAB. HANNA ROKITA
12 marca 2012 r.
Recenzja
pracy doktorskiej p. mgr Rafała Kamińskiego
pt „The analysis of the interactions between HIV-1 protein Rev,
viral RRE RNA and a host celi factor Pura"
Tematyka przedstawionej do recenzji pracy doktorskiej dotyczy analizy
oddziaływań białka Rev wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) z
cząsteczkami wirusowego RNA, zawierającymi sekwencje odpowiedzialne za
wiązanie białka Rev, oraz z białkiem komórkowym Pura.
Pomimo prawie 30-tu lat badań, wirus niedoboru odporności HIV-1
stanowi spore wyzwanie dla badaczy i lekarzy. Niewątpliwym postępom w
leczeniu zakażeń wirusem HIV-1 towarzyszy nieustanne poszukiwanie
nowych sposobów zwalczania skutków infekcji tym stale mutującym
lentiwirusem powodującym powstawanie oporności na kolejne leki
przeciwwirusowe.
Praca doktorska p. mgr Kamińskiego jest kontynuacją wcześniejszych
badań prowadzonych w zespole ko-promotora rozprawy, prof. K. Khalili z
Uniwersytetu Temple w Filadelfii w USA. W badaniach tych udowodniono,
że białko komórkowe Pum wiąże się z ważnym białkiem regulatorowym
wirusa, Tat (ang. transactivator of transcription), zmieniając jego funkcję w
zakażonej wirusem komórce. Wyniki opisane przez Autora w przedstawionej
do recenzji rozprawie doktorskiej dotyczą innego białka wirusa HIV-1, Rev
(ang. regulator of expre-ssion of virion proteins), ważnego regulatora cyklu
życiowego wirusa. Białko Rev wiąże się specyficznie do sekwencji RRE
(ang. Rev responsive element) znajdującej się w drugim intronie w genie env
i umożliwia transport cząsteczek mRNA zawierających introny do
cytoplazmy. W ten sposób możliwa jest translacja wirusowych białek i
enkapsydacja pełnych (zawierających introny) transkryptów. Zdolność białka
Pura do rozpoznawania i wiązania powtórzonych sekwencji typu GGN w
UL GRONOSTAJOWA
30-387 KRAKÓW
TEL. +48 (12) 664 6337
EMAIL:[email protected]
2
RRE, skłoniła Autora do próby wyjaśnienia roli tego białka w transporcie
wirusowego mRNA zawierającego introny.
Chociaż jak sam Autor podkreś la, jego praca nie pokazuje wpływu
badanego białka komórkowego na przebieg zakażenia wirusem HIV-1 czy
zmiany ekspresji biał ek wirusowych w zakażonych komórkach, jest to
niewątpliwie ważna praca, gdyż jej wyniki mogą stać się podstawą
opracowania skutecznych inhibitorów cyklu życiowego wirusa HIV-1 w
komórkach poprzez celowanie do komórkowych kofaktorów białek
wirusowych, jakim jest np. białko Pum. Wyniki zawarte w rozprawie zostały
już opublikowane w postaci dwóch prac oryginalnych w J Cell Biochem i
Cancer Biol Ther o łącznym IF ok. 6,0 w 2008 r. i co ważne w obu p. Rafał
Kamiński jest pierwszym autorem.
Przedstawiona do recenzji praca doktorska, napisana w języku
angielskim z racji miejsca wykonania doświadczeń, jest niezbyt obszerna
(liczy łącznie 71 stron), ale zawiera wszystkie wymagane części i jest
zwięzła. W 15-stronicowym starannie opracowanym wstępie opisano samego
wirusa HIV-1, jego cykl życiowy, ważne wirusowe białka oraz eksport
cząsteczek wirusowego RNA z jądra do cytoplazmy. Autor opisuje także
funkcje białka komórkowego Pum oraz komórkowy eksport jądrowocytoplazmatyczny. Moja uwaga krytyczna do tego rozdział u dotyczy danych
zebranych w Tabeli 1 (str. 19-20), w której chyba tylko z powodu zbytniej
skromności (bo wyniki zostały już opublikowane) Autor nie umieścił
badanego przez siebie białka Pum jako czynnika komórkowego, dla którego
wykazano oddziaływanie z białkiem wirusowym Rev. W rozdziale tym
cytowana jest praca Levy 2007 (str. 11), której brak w spisie piśmiennictwa a
także nie zamieszczono pełnego cytowania danych bibliograficznych
(Stoltzfus, str. 14, wiersz 7 od dołu).
Rozdział „Materiały i Metody" jest napisany dość skrótowo na 8
stronach więc niekiedy można odnieść wrażenie, że Autor stosował
powszechnie znane techniki. Tymczasem poza hodowlą komórkową,
immunoblottingiem czy izolacją białek oraz RNA, są to dość skomplikowane
metody, jak np. klonowanie szeregu konstruktów genetycznych dla uzyskania
ekspresji pełnych i zmutowanych biał ek, transformacja bakterii plazmidowym
DNA, mutageneza ukierunkowana, transfekcja ludzkich komórek
plazmidowymi wektorami, wyciszanie ekspresji genów z wykorzystaniem
siRNA, izolacja biał ek fuzyjnych z ekspresji w bakteriach, reakcja odwrotnej
transkrypcji, reakcja łańcuchowa polimerazy DNA, metoda hybrydyzacji typu
Northern, immunoprecypitacja RNA (RIP) i koimmunoprecypitacja białek
oraz analiza białek oddziałujących z badanym RNA metodą EMSA
(Electrophoretic Mobility Shift Assay). W rozdziale tym jest sporo błędów
3
literowych i językowych, ale przede wszystkim brak wyjaśnienia powodu
wyboru linii komórkowej glejaka U87MG do badania interakcji białek
wirusowych i RNA wirusowego z białkiem komórkowym Pura. Zastosowana
linia komórek nowotworowych nie jest naturalnym miejscem rozwoju wirusa
HIV-1, gdyż są nimi ludzkie limfocyty T pozytywne pod względem receptora
CD4 i makrofagi.
Wyniki badań stanowią najobszerniejszy rozdział pracy, zostały
przedstawione na 20 stronach w postaci 13 złożonych rycin. W pierwszej
ka Pura na
części badań opisanych w rozprawie zanalizowano wpływ biał
funkcję wirusowego białka Rev transfekując komórki U87-MG plazmidem
reporterowym oraz plazmidami ekspresyjnymi dla białek Rev i Pura. Stosując
dwa układy oparte na aktywności genów reporterowych (acetylotransferazy
chloramfenikolu i lucyferazy) zależnej od sekwencji RRE wiążącej białko
Rev udowodniono, że nadekspresja białka Pura zwiększa stymulujący efekt
białka Rev na ekspresję genów reporterowych. Co ciekawe, nadekspresja
samego białka Pura także podnosiła w cytoplazmie zawartość RNA, które
zawierało introny. Zastosowanie inhibitora eksportyny 1, antybiotyku
leptomycyny B, pozwoliło zahamować wpływ biał ka Rev na aktywność
lucyferazy i w ten sposób wykazać specyficzność efektu Pura na aktywność
białka Rev. Zastosowanie zjawiska interferencji RNA do wyciszenia
endogennej ekspresji białka Pura na poziomie jego transkryptu pozwoliło
pokazać spadek ekspresji genu lucyferazy w przypadku sekwencji
regulatorowej RRE. Dla tego wyniku brakuje próby interpretacji
zaobserwowanego znacznego niemal 10-krotnego obniżenia zawartości białka
Pura w komórkach skutkującego tylko ok. 20% spadkiem aktywności
reporterowego genu (Fig. 3). Wydaje się, że taki wynik wyklucza wyłączną
rolę Pura w aktywacji białka Rev. Użycie serii mutantów delecyjnych obu
nej
białek Rev i Pura pozwoliło pokazać ważny wynik, że tylko biał ka o peł
ści
długości zawierające wszystkie funkcjonalne domeny zwiększały aktywno
stosowanych genów reporterowych. Z kolei próba koekspresji obu badanych
białek wykazała, że białko Pura zwiększa zawartość transportowanych przez
tpliwie
Rev cząsteczek mRNA z sekwencją RRE w cytoplazmie a więc niewą
posiada bezpośredni wpływ na transport mRNA z udziałem białka Rev.
W drugiej części badań zgromadzono dane wskazujące na wzajemne
mikroskopii
wiązanie się białek Rev i Pura. Najpierw metodą
fluorescencyjnej udowodniono wspólną lokalizację białek Rev i Pura w
komórce. Uzyskane w wyniku ekspresji z odpowiednio skontruowanych
plazmidów białka fuzyjne wykazujące zieloną (dla Pura) i czerwoną (dla
Rev) fluorescencję wykryto w rejonie okołojądrowym choć samo białko Rev
występuje też w jąderku a Pura także w cytoplazmie. Następnie w teście
wiązania białek fuzyjnych z transferazą S glutationową (GST) GST-Rev i
4
GST-Pura oraz ich mutantów delecyjnych z białkami komórek
transfekowanych plazmidami ekspresyjnymi dla białka Pura lub Rev
ugości ale szczególnie
pokazano, że Pum wiąże się z białkiem Rev o pełnej dł
cy aminokwasy 18-50, w którym
ważny w białku Rev jest rejon obejmują
ążąca RNA (RBD)
znajduje się sygnal lokalizacji jądrowej (NLS), domena wi
oraz domena odpowiedzialna za powstawanie multimerów Rev (MD). Z kolei
ą rolę aminokwasów 73dla biał ka Pum w podobnym teście wykazano istotn
ko-immunoprecypitacji
123 w wiązaniu z białkiem Rev. Ponadto metodą
pokazano obecność i lokalizację głównie w cytoplazmie kompleksów
Pura/Rev w komórkach stransfekowanych plazmidem reporterowym
zawierającym sekwencję RRE oraz plazmidami ekspresyjnymi dla
c-myc i His).
rekombinowanych biał ek Pura (z metką T7) i Rev (z metką
W trzeciej (ostatniej) serii doświadczeń Autor zgromadził dowody na
łek. Dzięki
udział sekwencji RNA w oddziaływaniach obu badanych bia
elu — EMSA z RNA
zastosowaniu testu opóźnienia wędrówki w ż
łkami Rev i
zawierającym region RRE jako sondą i rekombinowanymi bia
ącym
Pum (w fuzji z GST), pokazał, że Pura wiąże się nie tylko z istniej
że wiązać
kompleksem Rev/RRE i zwiększa ich zawartość, ale także samo mo
ęści wyników można
się z sekwencjami RNA niezwiązanymi z Rev. Do tej cz
ek fuzyjnych a nie czystych, gdyż
mieć zastrzeżenia wynikające z użycia biał
zanie z wyznakowanym
trudno ocenić wpływ „metki" w postaci GST na wią
RNA. Ponadto, jak wynika z Fig, 11 i 12, część próbek białek była
inkubowana przy niedomiarze sondy (np. ścieżki 3-5 i 8-10 — Fig. 11A).
Wreszcie test immunoprecypitacji RNA pozwolił pokazać, że wiązanie Pum z
Rev i RNA z sekwencją RRE ma miejsce w cytoplazmie komórek w hodowli
podkreślić, że we
in vitro. Podsumowując opisane w rozprawie wyniki należy
ciwych kontroli, co
wszystkich doświadczeniach zadbano o włączenie właś
wymagało np. przygotowania serii plazmidów kontrolnych. Nie wskazano
. W tym rozdziale
natomiast liczby powtórzeń poszczególnych doświadczeń
łkowo
brak numeracji ścieżek w Fig. 1B i 1C, Fig. 2B, 6C, 10 a Fig. 13 pomy
oznaczono jako 14. W Fig. 6C (str. 43) pomylono położenie produktów
hybrydyzacji z sondą CAT.
Dyskusja pracy została napisana w sposób bardzo ciekawy i poparta
wieloma danymi z opublikowanego pi śmiennictwa. Autor wiele miejsca
ści do wiązania się do
poświęca roli biał ka Pum w komórce, jego zdolno
mRNA i rybosomowego RNA, co wyraźnie sugeruje jego rolę w kierowaniu
transkryptów do miejsc translacji. Bardziej dogłę bna analiza wiązania się
Pum do specyficznych sekwencji w RNA i białku wirusowym Rev skłoniła
Autora do wysnucia hipotezy, że biał ko Pum pomaga helikazom RNA tak
liwa jest jego translokacja
przekształcić „ładunek" w postaci mRNA, że moż
że bez komentarza
przez pory jądrowe do cytoplazmy. Nie pozostawiono tak
5
ania tego
zdolności białka Pura do wiązania się do DNA oraz współdział
co omówiono
białka z innym biał kiem regulatorowym wirusa, Tat. Interesują
również ogólny zarys potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genomu
retrowirusów. Niewątpliwie ciekawa a niewyjaś niona dotychczas byłaby rola
cych introny
białka Pura w eksporcie transkryptów wirusowych posiadają
drowego,
niezależnie od białka Rev, w obecności inhibitora eksportu ją
leptomycyny B. Niekoniecznie był oby to przekierowanie mRNA na inne
szlaki eksportu jądrowego a być może efekt nadekspresji białka Pura.
W streszczeniach angielsko- i polsko-języcznym, które są poprawnie
zredagowane, znalazła się nieścisłość dotycząca transportu jądrowocytoplazmatycznego (strony odpowiednio 6 i 8), niesłusznie sugerująca, że
eksport z jądra komórkowego dotyczy jedynie cząsteczek rRNA. W
że
streszczeniu polskojęzycznym trudno zgodzić się ze stwierdzeniem,
„zwiększenie różnorodności cząsteczek mRNA (przez alternatywny splicing)
powoduje zwiększenie pojemności genetycznej genomu wirusa". Chodzi tu
na pewno o zwiększenie „pozornej" pojemności genomu, gdyż fizycznie
genom nie powiększa się.
Poza dyskusją Autor załączył rozdział „Wnioski", w których w 4
punktach krótko podsumowuje uzyskane wyniki.
Praca jest napisana poprawnie, dobrze zredagowana i ilustrowana, choć
ą
niektóre schematy są zbyt pomniejszone (Fig. 4A, 5A i 7). Legendy rycin s
napisane bardzo szczegółowo z podaniem wszystkich istotnych informacji.
łki, które
Poza błędami literowymi i interpunkcyjnymi znaleziono pomy
omówiono przy poszczególnych rozdziałach pracy.
do
Niezależnie od wspomnianych powyżej drobnych uwag wnoszę
Rady Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu
do następnych
Jagiellońskiego o dopuszczenie p. mgr Rafała Kamińskiego
etapów przewodu doktorskiego.
o (A A
Hanna Rokita