FLEX Monoclonal Mouse Octamer-Binding Transcription

FLEX
Monoclonal Mouse
Octamer-Binding Transcription Factor 3/4
Clone N1NK
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR092
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Preparat Monoclonal FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding Transcription Factor 3/4, Clone
N1NK, Ready-to-Use (Link) jest przeznaczony do stosowania w immunohistochemii. Przeciwciała przeciwko
czynnikowi transkrypcji sekwencji oktamerowej 3/4 (Oct3/4) znajdują zastosowanie w identyfikacji określonych
podtypów guzów zarodkowych, w tym nasieniaka, raka zarodkowego oraz niesklasyfikowanej
wewnątrzprzewodowej neoplazji komórek zarodkowych (IGCNU) (1-4). Interpretacja kliniczna wystąpienia
barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób
kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby
pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
Białko wiąŜące sekwencję oktamerową 3 (Oct3), czynnik transkrypcji sekwencji oktamerowej 3 (Otf3), białko
wiąŜące sekwencję oktamerową 4 (Oct4), czynnik transkrypcji sekwencji oktamerowej 4 (Otf4), POU5F1 (1-3, 5,
6).
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Alternatywny splicing powoduje powstanie dwóch wariantów mRNA ludzkiego genu Oct4 zlokalizowanego na
chromosomie 6, zwanych pierwotnie Oct3A oraz Oct3B (7), które ostatecznie przyjęły nazwę Oct3/4. Izoformy
Oct3A i Oct3B składają się odpowiednio z 360 i 265 aminokwasów, z których 225, zlokalizowanych w obrębie Ckońca sekwencji, jest identycznych. Czynnik Oct3/4 naleŜy do rodziny czynników transkrypcji POU (Pit-Oct-Unc)
aktywujących ekspresję swoich genów docelowych przez wiązanie sekwencji oktamerowej AGTCAAAT (6).
Oct3/4 ulega ekspresji w komórkach embrionalnych oraz komórkach zarodkowych (1) i pełni kluczową rolę w
układzie regulacji transkrypcyjnej odpowiedzialnym za samoodnowę, zdolność do wielokierunkowego
róŜnicowania się, a takŜe przynaleŜność do linii embrionalnych komórek macierzystych oraz komórek
macierzystych ze zdolnością do wielokierunkowego róŜnicowania się (5). Ekspresja Oct3/4 występuje równieŜ w
określonych podtypach guzów zarodkowych, takich jak nasieniaki, rozrodczaki, dysgerminoma, rak zarodkowy,
komórki zarodkowe gonadoblastomów oraz IGCNU (1, 2, 4).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC.
Odczynnik
dostarczony
Mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci nadsączu hodowli komórkowej w buforze Tris-HCl o
stęŜeniu 0,05 mol/l, zawierającym azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/l, o pH 7,2. Produkt zawiera białko
stabilizujące.
Klon: N1NK. Izotyp: IgG1.
Immunogen
Białko rekombinowane odpowiadające 147 aminokwasom na N-końcu ludzkiego białka Oct3/4.
Swoistość
W testach Western blot lizatów komórkowych hES-TW1 przeciwciało anty-Oct3/4, klon N1NK, rozpoznaje pasmo
o masie cząsteczkowej ok. 40 kDa odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej białka Oct3/4 (8).
Środki ostroŜności
1.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
2.
Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
Przechowywanie
(123656-001)
Przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego
na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne.
P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 1/4
W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
Skrócona instrukcja
uŜytkownika
Krok
Komentarze
Utrwalanie
Obróbka wstępna
Formalina
EnVision FLEX™, High pH (nr kat. K8004)
ND
20 min HIER, 3 w 1 z uŜyciem PT Link
i PT Link Rinse Station
Rozcieńczenie
Bufor
rozcieńczenia
Kontrola ujemna
Wizualizacja
Produkt gotowy do uŜycia
Produkt rozcieńczony fabrycznie
Inkubacja 20 min
ND
FLEX Negative Control, Mouse (nr kat. IR750)
EnVision™ FLEX+, High pH (nr kat.
K8002/K8012)
Inkubacja 20 min
Inkubacja 20 min, inkubacja w
odczynniku Mouse (LINKER) 15 min,
inkubacja w odczynniku DAB+ 2x5
min
Barwnik
kontrastowy
Tkanka kontrolna
EnVision™ FLEX Hematoxylin (nr kat.
K8008/K8018)
Nasieniak
Inkubacja 5 min
Szkiełka
FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020)
Zaleca się stosowanie w celu
uzyskania lepszego przylegania
skrawków tkankowych do szkiełek.
Zatapianie
preparatu
Wymagane niewodne, trwałe zatapianie
preparatów
Po przeprowadzeniu barwienia,
skrawki muszą być odwodnione,
oczyszczone i zakryte za pomocą
środka do trwałego zatapiania.
Oprzyrządowanie
Autostainer Link 48 i Autostainer Plus
NaleŜy stosować fiolki dostosowane
do aparatu (nr kat. SK200-SK203 i
S3425)
Odczyn jądrowy Odczyn
cytoplazmatyczny w obecności silnego
odczynu jądrowego jest akceptowalny.
*UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje
przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem.
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków
zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm.
Obróbka wstępna: Wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się po wstępnej obróbce
tkanek metodą HIER przy uŜyciu rozcieńczonego roztworu EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie antygenu (HIER) moŜna
przeprowadzić z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja
uŜytkownika aparatu PT Link (PT Link User Guide). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące
parametry: Temperatura ogrzewania wstępnego: 65°C; temperatura i czas odmaskowania antyge nu: 97°C przez
20 (±1) minut; ochłodzić do 65°C. Wyj ąć stojak na szkiełka ze zbiornika PT i niezwłocznie zanurzyć szkiełka w
słoju lub zbiorniku (np. PTLinkRinseStation, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision™
FLEXWashBuffer (20x) (nr kat. K8007) w temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na
1-5 minut.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia, skrawki muszą być
odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
Procedura barwienia
Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, High pH (nr kat. K8002/K8012) łącznie z
EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (nr kat. K8021/K8022) przy stosowaniu trwającego 20 minut okresu inkubacji
w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (nr kat. K8021/K8022) wynosi 15
minut w temperaturze pokojowej. Postępować zgodnie z procedurą dostarczoną z wybranymi systemami do
wizualizacji.
Program: W systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana
objętość uŜytego odczynnika to 1 x 200 µl lub 2 x 150 µl na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące
wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer
Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer Link, naleŜy skontaktować się z działem
wsparcia technicznego firmy Dako. Program instalacyjny oprogramowania Autostainer Link moŜna znaleźć pod
adresem www.dako.com\Installer. Ten program instalacyjny uzupełni oprogramowanie DakoLink o dane
protokołu i odczynnika Anti-Human Oct3/4, Clone N1NK. Krótka nazwa protokołu przeciwciała to Oct3/4.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Barwienie kontrastowe: Zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (nr
kat. K8008). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do
zatapiania.
(123656-001)
P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 2/4
Kontrole: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i
ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować
nasieniaka lub raka zarodkowego, natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki, jak
opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative
Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Charakterystyka
działania
Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Rozsiany odczyn cytoplazmatyczny w obecności silnego odczynu jądrowego
jest akceptowalny.
.
Tkanki prawidłowe:
Przeciwciała anty-Oct3/4 nie wykazywały reaktywności w jądrze komórkowym w Ŝadnej z przebadanych
prawidłowych tkanek (9).
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Nadnercza (3)
Szpik kostny (3)
Gruczoły sutkowe (3)
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
MóŜdŜek (3)
0/3
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Trzustka (3)
Przytarczyce (3)
Przysadka mózgowa
(3)
Gruczoł krokowy (3)
Mózgowie (3)
0/3
Ślinianki (3)
Szyjka macicy (3)
0/3
Mięśnie szkieletowe
0/3
Jelito grube (3)
0/3
Skóra (3)
0/3
Przełyk (3)
0/3
Jelito cienkie (3)
0/3
Serce (3)
0/3
Śledziona (3)
0/3
Nerki (3)
0/3
śołądek (3)
0/3
Wątroba (3)
0/3
Jądra (3)
0/3
Płuca (3)
0/3
Grasica (3)
0/3
Komórki
międzybłonka (3)
Nerwy obwodowe (3)
0/3
Tarczyca (3)
0/3
0/3
Migdałki (3)
0/3
Jajniki (3)
0/3
Macica (3)
0/3
0/3
0/3
0/3
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
Uwaga: zaobserwowano słabo dodatni odczyn immunohistochemiczny w cytoplazmie komórek nabłonka w 3
róŜnych prawidłowych typach tkanek. Składniki wykazujące reakcję obejmują komórki nabłonkowe jądra (2/3),
Ŝołądka (1/3) oraz jelita cienkiego (2/3). Słabo dodatni odczyn był obecny w części komórek nabłonkowych jądra
(10-20%), Ŝołądka (50%) i jelita cienkiego (20%).
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
(123656-001)
Cheng L. Establishing a germ cell origin for metastatic tumors using OCT4 immunohistochemistry. Cancer
2004;101:2006-10.
Jones TD, Ulbright TM, Eble JN, Cheng L. OCT4: A sensitive and specific biomarker for intratubular germ
cell neoplasia of the testis. Clin Cancer Res 2004;10:8544-47.
Ulbright TM. Germ cell tumors of the gonads: a selective review emphasizing problems in differential
diagnosis, newly appreciated, and controversial issues. Modern Path 2005;18:S61-79
Hoei-Hansen CE, Kraggerud SM, Abeler VM, Karen J, Meyts ERD, Lothe RA. Ovarian dysgerminoma are
characterised by frequent KIT mutations and abundant expression of pluripotency markers. Molecular
Cancer 2007;6:12
Bhartiya D, Kasiviswanathan S, Unni SK, Pethe P, Dhabalia J, Patwardhan S i inni Newer insights into
premeiotic development of germ cells in adult human testis using Oct-4 as a stem cell marker. J Histochem
Cytochem 2010;58:1093-1106.
Pan GJ, Chang ZY, Pei D. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res 2002;12:321-9.
Takeda J, Seino S, Bell GI. Human Oct3 gene family: cDNA sequences, alternative splicing, gene
organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult tissues. Nucleic Acids Res
1992;20:4613–20.
Yu J. Mouse Monoclonal Anti-Oct3/4: A test of the specificity of Anti-Oct3/4 clone N1NK by Western blotting.
2013;D15899.
Yu J. Report of normal tissue immunohistochemical testing using mouse anti-human Octamer-binding
transcription factor (Oct3/4), Clone N1NK. 2013;D13564.
P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 3/4
Wydanie 08/13
(123656-001)
P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 4/4