HPLC cz.1 HPLC ? Analiza chromatograficzna

HPLC ?
HPLC cz.1
ver. 1.0
•
•
Literatura:
1.
Witkiewicz Z. „Podstawy chromatografii”
2.
Szczepaniak W., „Metody instrumentalne w analizie chemicznej”
3.
Snyder L.R., Kirkland J.J., Glajch J.L. „Practical HPLC Method
Development”
4.
Google (np. strony producentów aparatury i akcesoriów
chromatograficznych)
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (high performance liquid
chromatography)
WysokociĞnieniowa chromatografia cieczowa (high pressure liquid
chromatography)
Chromatografia = Rozdział + Detekcja
Schemat zestawu do HPLC
1
2
Klasyfikacja metod
chromatograficznych
Analiza chromatograficzna
•
•
•
•
3
Informacje jakoĞciowe (co?) i iloĞciowe (ile?)
Sygnał (powierzchnia pod pikiem) czĊsto jest proporcjonalny do stĊĪenia
analitu
„Czas” pojawienia siĊ piku (czas retencji) jest charakterystyczny dla danej
substancji (uwaga na pokrywające siĊ piki!)
Wynik analizy = chromatogram tj. wykres XY, sygnał od czasu (objĊtoĞci
eluentu)
4
Zestaw do HPLC - szczegóły
Aparatura
•Zbiornik eluentu (+ filtr, + system
odgazowania)
•Pompa(y) – stały, ĞciĞle okreĞlony
przepływ (bez pulsacji). CiĞnienie
eluentu jako funkcja temp., przepływu i
lepkoĞci. Skoki ciĞnienia – przyczyny.
•Dozownik (zawór z pĊtlą)
Schemat blokowy chromatografu cieczowego. 1,2 - zbiorniki eluentów, 3 pompa, 4 - manometr, 5 - dozownik, 6 - przedkolumna, 7 – kolumna
chromatograficzna, 8 - termostat kolumny, 9 - przepływomierz, 10 detektor, 11 - kolektor frakcji, 12 - rejestrator lub komputer
•Kolumny (+ termostat – piec)
NajwaĪniejsze: eluent (faza ruchoma), kolumna i detektor
5
Aparatura - kolumny
6
Fazy ruchome HPLC - eluent
•KompatybilnoĞü z detektorem (nie przeszkadza w detekcji)
•ReaktywnoĞü rozpuszczalnika (THF, reakcje z próbką)
•Temp. wrzenia i lepkoĞü
•MieszalnoĞü (układy dwu lub wielorozpuszczalnikowe)
•BezpieczeĔstwo
Kolumny – rurki ze stali nierdzewnej dł. 5-35cm, Ğrednicy wewnĊtrznej
2-30mm, wypełnione specjalnego typu stałym noĞnikiem
Jak obchodziü siĊ z kolumnami?
• UĪywaü czystych chemicznie i mechanicznie rozpuszczalników
• Filtrowaü próbkĊ (filtr 0.5µm)
• UĪywaü prekolumn
• Zachowywaü zalecenia producenta co do ciĞnienia, pH i rodzajów
rozpuszczalników na których moĪe pracowaü kolumna
• Obchodziü siĊ z kolumną ostroĪnie (szok mechaniczny/termiczny),
przechowywaü zatkaną
• Kierunek przepływu eluentu powinien byü zgodny z zaznaczonym na
kolumnie
DostĊpny, czysty, tani, kompatybilny z detektorem, bezpieczny,
relatywnie niereaktywny (obojĊtny chemicznie w stosunku do próbki i
fazy stacjonarnej, trwały w warunkach analizy).
Rozpuszczalnik powinien dobrze rozpuszczaü próbkĊ. Najlepiej jeĞli
ma niską lepkoĞü i temp. wrzenia.
PolarnoĞü rozpuszczalnika – siła elucyjna (por. LC)
Normalny układ faz (rozpuszczalniki niepolarne np.
heksan+chloroform, heksan+dichlorometan) / odwrócony układ faz
(rozpuszczlniki polarne np. woda+metanol, woda+THF)
7
8
WłaĞciwoĞci rozpuszczlników
Elucja izokratyczna i gradientowa
•
•
Elucja izokratyczna – skład eluentu niezmienny podczas
analizy
Elucja gradientowa – skład eluentu zmienia siĊ w czasie
analizy (roĞnie stĊĪenie bardziej polarnego składnika)
9
10
Rozdział
Fazy stacjonarne
Budowa ziarna
11
12
Wypełnienia kolumn
Wypełnienia kolumn
Przykłady grup chemicznych
związanych na powierzchni ziarna
Krzemionka „surowa”
Charakter chemiczny powierzchni
Dobór wypełnienia kolumny do rodzaju próbki i eluentu
13
14
Detekcja
•
•
•
•
•
Detekcja – detektor UV
Minimalne/maksymalne stĊĪenie
analitu
Czynniki wywołujące szum/dryft
Obróbka wyników analiz
CzułoĞü i selektywnoĞü detektora
LiniowoĞü
Pomiar absorbancji w zakresie UV
(ok. 190-400 nm) eluatu
przepływającego przez celkĊ
pomiarową
•
•
•
•
Informacje ogólne
MoĪliwa bardzo duĪa czułoĞü (budowa chemiczna analitu)
Szeroki przedział liniowoĞci
MoĪliwa praca w trybie gradientowym rozdziału
Relatywnie mało czuły na wahania temperatury
NajwaĪniejsze typy detektorów
15
16
Detekcja – detektor RI
Pozostałe zagadnienia
•
•
•
•
•
•
Pomiar róĪnicy we współczynniku
załamania Ğwiatła (refractive
index) pomiĊdzy eluentem (celka
odniesienia) a eluatem (w celce
pomiarowej)
•
•
•
•
Niezwykle uniwersalny (polimery, związki małocząsteczkowe,
niezaleĪnie od budowy chemicznej)
Stosunkowo mało czuły (nie nadaje siĊ do analizy Ğladowej)
BezuĪyteczny w trybie gradientowym rozdziału
Czuły na wahania temperatury
GPC – zasada rozdziału, kalibracja, obliczenia
Analiza jakoĞciowa – krok po kroku
Analiza iloĞciowa – krok po kroku
Przygotowanie próbek do analiz chromatograficznych
Zastosowania HPLC/GPC
Przykładowy problem do rozwiązania
= HPLC cz. 2
NajwaĪniejsze typy detektorów
17
18