HPLC cz 1.

2015-12-30
Zaawansowane techniki
chromatograficzne cz.1
21 grudnia 2015
1
2015-12-30
Metody chromatograficzne
• Chromatografia
kolumnowa
• Chromatografia
cienkowarstwowa
(planarna)
• Zasada podziału
• Zastosowania
• Sprzęt
Metody zaawansowane
• Kolumna
– wypełnienie
– rozmiar
• Faza ruchoma
• Detekcja
• Obróbka danych
• Zasada podziału:
–
–
–
–
–
różnica hydrofobowości
dysocjacja
wielkość
powinowactwo
dopasowanie (*)
2
2015-12-30
CHROMATOGRAFIA
CIECZ
GAZ
PLANARNA
KOLUMNOWA
bibuła
krzemionka
alumina
upakowana
adsorpcja
NORMALNY
UKŁAD FAZ
faza ruchoma
organizacja
kapilarna
podział
ODWRÓCONY
UKŁAD FAZ
podstawa rozdziału
NIEPOLARNE
POLARNE
analizowane substancje
rozpuszczalniki
organiczne
mieszanki
wodno-organiczne
HILIC
faza ruchoma
Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych
3
2015-12-30
Główne typy chromatografii
• gazowa
• cieczowa
–
–
–
–
–
adsorpcyjna
podziałowa*
jonowa
wykluczenia
powinowactwa
• fazy stacjonarne
• fazy ruchome
• typ oddziaływań
• sposób elucji
• zastosowania
4
2015-12-30
Metody zaawansowane
• Kolumna
• Faza ruchoma
– rodzaj rozpuszczalnika
– sposób przepływu
• Detekcja
• Obróbka danych
• Chromatografia
cieczowa
• Chromatografia gazowa
• Chromatografia
– analityczna
– preparatywna
• Chromatografia
– gradient
– izokrat
Metody zaawansowane
•
•
•
•
Kolumna
Przepływ fazy ruchomej
Detekcja
Obróbka danych
• Co chcemy zobaczyć
–
–
–
–
UV
elektrochemia
MS
refrakcja
• Czego nie widać
5
2015-12-30
Metody zaawansowane
•
•
•
•
Kolumna
Przepływ fazy ruchomej
Detekcja
Obróbka danych
• Wykres –
chromatogram
• dane jakościowe
• dane ilościowe
– kalibracja, liniowość
Statystyka
Metody zaawansowane
•
•
•
•
Kolumna
Przepływ fazy ruchomej
Detekcja
Obróbka danych
• Wybór metody
• Przygotowanie próbki
• Ocena wyniku
• Rozwiązywanie
problemów
6
2015-12-30
Zastosowania
• badanie składu mieszanin
• ocena czystości substancji
• potwierdzenie tożsamości
• wyodrębnianie składników
• śledzenie postępu reakcji
Zastosowania
•
•
•
•
•
skomplikowana próbka
seria pomiarów
mała ilość substancji
rutyna
regulacje prawne (normy, farmakopea)
7
2015-12-30
Chromatogram
6000
5000
intensywność
surowy
4000
oczyszczony
3000
2000
1000
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
czas retencji [min]
8
2015-12-30
HPLC
• wysoka sprawność
9
2015-12-30
Chromatogram
6000
5000
intensywność
surowy
4000
oczyszczony
3000
2000
1000
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
czas retencji [min]
HPLC
• wysoka sprawność
– wypełnienie kolumny – powierzchnia
– rodzaj wypełnienia
– przepływ fazy ruchomej
10
2015-12-30
HPLC
• wysoka sprawność
• detekcja
– różnorodność metod
– czułość
HPLC
• wysoka sprawność
• detekcja
• automatyzacja
– przebieg pomiaru
– wprowadzanie próbki
– zebranie frakcji
11
2015-12-30
Ważne w HPLC
• dobór warunków
– skład próbki
– zasada podziału
– detekcja
• przygotowanie próbki
• czystość (mechaniczna,
chemiczna faz)
• powtarzalność i
kontrola jakości
Podstawowy podział HPLC
Normalny układ faz - do rozdziału związków niepolarnych
polarne złoże (np. krzemionka)
niepolarny rozpuszczalnik
Odwrócony układ faz (RP): do rozdziału związków polarnych, w
tym aminokwasów, peptydów, białek, sacharydów
niepolarne złoże (np. krzemionka modyfikowana łańcuchami alkilowymi)
polarny rozpuszczalnik
HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) –
do rozdziału związków polarnych (jak RP, ale inna zmiana
fazy ruchomej)
12
2015-12-30
silyl-ether bonds: Si-O-CH2-R
R = oktadecyl (C18)
R = oktyl (C8)
R = butyl (C4)
R = etyl (C2)
13
2015-12-30
HPLC - ciśnienie
• kolumna 250 x 4,6 mm, ziarno 5 μm
– 1400 psi
1 atmosfera
1 bar ??? psi
1013 hPa
14
2015-12-30
Elucja
Zadanie domowe
• proszę znaleźć dowolną publikację, w której
zastosowano HPLC
• w części doświadczalnej proszę znaleźć opis
systemu i użytej metody
• proszę wyjaśnić opis systemu i metody
• w jaki sposób prezentowane są wyniki?
15