Oczyszczanie oligonukleotydów: odsalanie, elektroforeza czy HPLC?

Oczyszczanie oligonukleotydów:
odsalanie, elektroforeza czy HPLC?
Gdy zamawiamy oligonukleotydy, stajemy przed wyborem metody ich
oczyszczenia. Do wyboru zwykle są opcje odsalania i HPLC, chociaż
niektóre firmy oferują także mniej wydajną od HPLC chromatografię
odwróconej fazy lub sprawdzenie wydajności syntezy poprzez elektroforezę
PAGE. Najtańsze jest odsalanie, czy jednak jest ono wystarczające? Którą
opcję wobec tego wybrać?
Oligonukleotydy są syntezowane automatycznie przez syntetyzery sterowane
komputerowo. Nić DNA jest w nich „produkowana” w kierunku 3’ ⇒ 5’, każda
zasada dołączana jest poprzez serię następujących po sobie reakcji chemicznych.
Musimy wiedzieć, że jak to w chemii bywa, żadna synteza nie jest w 100%
wydajna. Dlatego otrzymany oligonukleotyd o zadanej długości to tylko jeden z
produktów końcowych- synteza powoduje też powstanie niedokończonych,
krótszych oligo.
Zwykle na każdym etapie przyłączania nukleotydu do rosnącego łańcucha ok. 1%
reakcji przebiega nieprawidłowo. W związku z tym produkt syntezy 30-merowego
oligonukleotydu w efekcie stanowi mieszaninę poprawnie zsyntezowanych
łańcuchów (54%-74%), a resztę stanowią produkty uboczne reakcji : 29-merowe,
28-merowe itd. Im dłuższy łańcuch, tym mniejsza zawartość prawidłowego
produktu syntezy.
Produkty uboczne reakcji mogą współzawodniczyć z pełnymi oligonukleotydami o
matrycę reakcji, obniżając wydajność amplifikacji lub skutkując niespecyficzną
amplifikacją. Dlatego właśnie czasami niezbędne jest dobre oczyszczenie
oligonukleotydu, jeżeli korzystamy np. z czułych metod allelospecyficznych, albo
jeżeli potrzebne nam są sondy molekularne, lub długie oligo (>40pz).
Istnieje pięć głównych metody oczyszczania: odsalanie, chromatografia
odwróconej fazy („Cartdridge”) , wysokoprężna chromatografia cieczowa
(HPLC), oczyszczanie żelowe na akrylamidzie (PAGE), oraz filtracja żelowa
*
Podczas odsalania roztwór oligonukleotydu jest przepuszczany przez prostą
kolumnę chromatograficzną, z której odpłukiwane są sole, natomiast produkty
uboczne syntezy nie są usuwane. Odsalanie jest standardowym wyborem dla
starterów tradycyjnych PCR, oraz dla większości starterów do reakcji qPCR.
*
Metoda chromatografii odwróconej fazy w kardridżu wymywa oprócz
soli także część produktów niespecyficznych, pozwalając na otrzymanie frakcji ok.
80-90% żądanego oligonukleotydu. Ustępuje skuteczności HPLC, zapewnia też
niższy odzysk oligonukleotydu więc jest dobra tylko dla małych skal syntezy.
Metoda nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt).
*
Wspomniana już wyżej technika HPLC to najwydajniejsza metoda
oczyszczania (ale też najdroższa). Pozwala ona na oczyszczenie nawet dużych
ilości oligonukleotydów w najwyższej skali syntezy, o dużej czystości (90-97%).
Metoda tak jak poprzednia, nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt).
*
Rozdział żelowy PAGE jest jedynym skutecznym sposobem oczyszczania
długich oligonukleotydów, którym nie podoła HPLC. Pozwala otrzymać bardzo
czyste (do 99% czystości) oligonukleotydy, jednakże ma poważną wadę: niski
odzysk z żelu znacząco zmniejsza ilość końcową czystego oligo. Tak oczyszcza się
aptamery i krótkie konstrukty syntetyczne.
*
Sączenie żelowe jest metodą z wyboru dla konstruktów zawierających
fofotioniany (tzw. s-oligo) w badaniach nad antysensem. Ma także zastosowanie
dla wszelkich oligonukleotydów podawanych do hodowli komórkowych, ponieważ
zapewnia najlepsze odpłukanie śladowych zanieczyszczeń chemicznych. Filtracja
żelowa pozwala podobnie jak PAGE na oczyszczenie dużych fragmentów DNA.
Jest wykorzystywana np. podczas oczyszczania sond do techniki FISH, doskonale
wymywając niezwiązany z sondą barwnik.
Marzena Wojtaszewska
Chromatografia czy sączenie żelowe?
wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań
Źródło:
Life Technologies
SigmaAldrich
Data publikacji: 09.12.2016r.