oferta nr 199 - Cittru - Uniwersytet Jagielloński

SPOSÓB OCZYSZCZANIA REKOMBINOWANEGO LUDZKIEGO BIAŁKA PCNA
NIE POSIADAJĄCEGO METKI FUZYJNEJ
(PROJEKT NR P-199)
Oferta dotyczy nowej metody oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej. Oferowane rozwiązanie, m.in. dzięki wysokiej czystości oraz aktywności biologicznej, pozwala na wydajną produkcję białka PCNA stosowanego w diagnostyce medycznej. PCNA (ang. proliferating cell nuclear antigen), czyli jądrowy antygen komórek proliferujących jest to niehistonowe białko jądrowe. PCNA jest markerem proliferacji komórkowej i stanowi wykładnik nasilenia proliferacji w różnych typach nowotworów. PCNA jest czynnikiem potrzebnym polimerazie DNA typu delta nie tylko w procesie replikacji DNA, ale także podczas naprawy DNA. PCNA może być wykorzystywany jako jeden z markerów do oceny potencjału nowotworowego komórek, a także w diagnostyce wybranych chorób autoimmunologicznych. Białka rekombinowane są to białka uzyskiwane metodami inżynierii genetycznej i wyprodukowane w heterologicznych układach ekspresyjnych. Produkcja rekombinowanych białek to często jedyna lub najtańsza metoda otrzymywania homogennego preparatu enzymu, białka czy peptydu, pozwalająca na zbadanie jego struktury i funkcji, często jedyny sposób, żeby enzym produkowany na potrzeby medycyny był dobrze scharakteryzowany. Jeśli rekombinowane białko w wyniku wprowadzenia pożądanych zmian zachowuje prawidłową strukturę i funkcję wtedy może stanowić narzędzie w przemyśle, rolnictwie, przetwarzaniu żywności oraz biologii molekularnej. Żeby osiągnąć powyższe cele należy wyprodukowane w kontrolnych warunkach białko oczyścić jak najszybciej i z jak największą wydajnością. W znanych heterologicznych systemach ekspresyjnych wykorzystywanych do nadekspresji oraz pozyskiwania białek rekombinowanych wykorzystywane są wektory posiadające metki fuzyjne np. His, GST lub MBP wykazujące powinowactwo odpowiednio do: jonu metalu (np. niklu), glutationu lub amylozy. Zastosowanie wymienionych metek umożliwia łatwe oraz szybkie uzyskanie pożądanego preparatu białkowego charakteryzującego się zazwyczaj wysokim stopniem czystości. Podejście takie z powodzeniem jest stosowane dla wielu białek m.in. dla białka PCNA. Niejednokrotnie specyfika prowadzonych badań wymaga korzystania z białka, które nie zawiera metki fuzyjnej. W takim przypadku możliwe są co najmniej dwa rozwiązania: odcięcie metki fuzyjnej, które nie jest zawsze możliwe albo oczyszczanie białka pozbawionego metki fuzyjnej klasycznymi metodami chromatograficznymi. Dostępne obecnie metody oczyszczania białka PCNA bez metki fuzyjnej opisują konieczność zastosowania co najmniej dwóch różnych złóż chromatograficznych np. hydrofobowego i jonowymiennego, fosfocelulozowego i jonowymiennego lub jonowymiennego i heparynowego. Przedmiotem oferty jest metoda oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej i poddanego nadekspresji w komórkach E. coli. Kolejnym etapem metody jest wysalanie białka siarczanem amonu z roztworu uzyskanych białek wewnątrzkomórkowych, a następnie rozdział wysolonej frakcji białkowej metodą chromatografii jonowymiennej. Podstawowe zalety proponowanej metody oczyszczania białka PCNA to: 
uproszczona metodyka realizacji ponieważ bazując na dużej rozpuszczalności białka metoda ta wykorzystuje technikę wysalania siarczanem amonu, a następnie chromatografię na kolumnie jonowymiennej Q; 
wysoka wydajność; 
wysoka czystość i aktywność uzyskiwanego preparatu białkowego; 
zmniejszenie kosztów oraz czasu metody. Oferowana metoda oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej stanowi przedmiot zgłoszenia patentowego. Dalsze prace nad jej rozwojem prowadzone na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ, a Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu poszukuje podmiotów zainteresowanych komercyjnym wykorzystaniem wynalazku. Dalsze informacje:
dr Klaudia Polakowska
Specjalista ds. Transferu Technologii
CITTRU, Uniwersytet Jagielloński
www.cittru.uj.edu.pl
tel. 12 663 3832, fax: 12 663 3831
e-mail: [email protected]