Verte KIT random primers

Novazym Products
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10,
39 11, email [email protected]
fax +48 0 61 610
Zestaw Verte KIT random primers (100 reakcji)
W skład zestawu wchodzi odwrotna transkryptaza Verte M-MLV będąca produktem genu pol mysiego wirusa leukemii
Moloneya. Ze względu na swoją aktywność polimerazy DNA zależnej od RNA pozwala na syntezę cDNA
(complementary DNA) o długości do 5 000 pz. W przeciwieństwie od odwrotnej transkryptazy AMV (Avian Mieloblastosis
Virus) odwrotna transkryptaza M-MLV posiada tylko szczątkową aktywności RNazy H.
Aktywność RNazy H – przejawia się specyficzną degradacją nici RNA w hybrydach RNA:DNA. Aktywność RNazy H może nie
wywierać znaczącego wpływu na ilość DNA, jeżeli całość syntezy komplementarnej nici DNA jest większa niż degradacja RNA
2+
związana z jej aktywnością. Reakcja odwrotnej transkrypcji może zachodzić jedynie w obecności jonów Mg .
SKŁAD ZESTAWU
Verte KIT - startery random primers
ILOŚĆ
50 µl
M-MLV odwrotna transkryptaza
10 000 U, 200 U/µl
5x bufor reakcyjny M-MLV
600 µl
dNTPS MIX, 10 mM
100 µl
Startery random primers
DTT
Woda wolna od RNaz
100 µl
200 µl
2 000 µl
Skład buforu reakcyjnego odwrotnej transkryptazy M-MLV (5x):
700 mM Tris-HCl, pH 8.3 / 25 °C, 166 mM (NH4)2SO4, 75 mM MgCl2
Przechowanie: - 20 °C
Lot. Nr 01-261112-1110 Exp. date 26.11.2013
Ograniczenia w zastosowaniu: Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został
przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów
związanych z produkcją leków.
UWAGA! Pewne składniki buforu reakcyjnego oraz buforu służącego do przechowywania mogą działać silnie drażniąco.
Radzimy podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP
9721099648, email [email protected], www.novazym.com
Verte KIT random primers
Protokół reakcji
Proponowany przez nas protokół odwrotnej transkrypcji zawiera przepis przeprowadzania reakcji
odwrotnej transkrypcji w warunkach optymalnych do syntezy większości cDNA. Jednakże, w zależności od
Novazym Polska
ul. Żywokostowa
23, 61-680
indywidualnej charakterystyki reakcji możliwe jest wprowadzanie odpowiednich
modyfikacji
i dostosowanie
Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610
poniższej procedury do indywidualnych potrzeb.
39 11, email [email protected]
1.
W probówce umieszczonej w lodzie zmieszać następujące składniki reakcji:
PROTOKÓŁ
SKŁADNIKI REAKCJI
MATRYCA RNA
ILOŚĆ
Total RNA
Specyficzny RNA
LUB
1 µg
5 – 100 ng
STARTERY
LUB
1 µL
Losowe 6-nukleotydowe
(Random Primers) 10-100 pmol/µl
Oligo(dT)15 10-100 pmol/µl
WODA (DEPC, wolna od RNaz, DNaz)
zmienna*
*zależy od objętości pozostałych składników reakcji.
2.
Składniki reakcji starannie wymieszać, a następnie zwirować.
3.
Mieszaninę inkubować 10 min w 65 °C, następnie natychmiast umieścić probówkę na lodzie. Po
schłodzeniu zwirować (spin).
4.
Umieścić probówkę w lodzie i dodać następujące składniki reakcji:
PROTOKÓŁ c.d.
SKŁADNIKI REAKCJI
M-MLV Buffer (5x)
100 mM DTT
dNTPs MIX, 10 mM
RNase inhibitor
M-MLV odwrotna transkryptaza
ILOŚĆ
4 µl
2 µl
1 µl
20 units
0.5 µl *
*w przypadku prowadzenia reakcji powyżej 40 ⁰C zalecamy dodać 1 µL M-MLV odwrotnej transkryptazy
Końcowa objętość po zmieszaniu wszystkich składników reakcji 20 µl!
5.
Inkubować mieszaninę 60 min w 37 °C – 42 °C
6.
W celu zakończenia reakcji mieszaninę inkubować 10 min w 70 °C, następnie umieścić probówkę w lodzie.
Zalecenia:
Wykorzystanie poli(A) RNA zamiast całkowitego RNA pozwala istotnie podnieść specyficzność
i efektywność reakcji syntezy cDNA.
Startery oligo (dT) 15 w przeciwieństwie do starterów losowych nie wymagają szczególnej optymalizacji
warunków reakcji.
Należy zwrócić uwagę na współzależność pomiędzy stężeniem starterów losowych , a ilością matrycy,
od której zależy długość uzyskiwanego cDNA. Zwiększenie stężenia losowych starterów pro wadzi do
syntezy krótkich (około 600 nukleotydowych) cDNA, natomiast zmniejszenie ich stężenia będzie
sprzyjać syntezie dłuższych odcinków cDNA.
Problemy związane z obecnością w RNA struktur drugorzędowych oraz sekwencji bogatych w G i C
można zmniejszyć poprzez podniesienie temperatury reakcji do 45 ⁰C (zamiast 37 °C) lub poprzez
dodanie DMSO do mieszaniny reakcyjnej. Należy jednak pamiętać, że może to prowadzić do
zmniejszenia wydajności syntezy cDNA.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP
9721099648, email [email protected], www.novazym.com
Verte KIT random primers
Protokół reakcji
Proponowany przez nas protokół odwrotnej transkrypcji zawiera przepis przeprowadzania reakcji
odwrotnej transkrypcji w warunkach optymalnych do syntezy większości cDNA. Jednakże, w z ależności od
indywidualnej charakterystyki reakcji, możliwe jest wprowadzanie odpowiednich modyfikacji i dostosowanie
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680
poniższej procedury do indywidualnych potrzeb.
1.
Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610
39 11, email [email protected]
W probówce umieszczonej w lodzie zmieszać następujące składniki reakcji:
PROTOKÓŁ
SKŁADNIKI REAKCJI
MATRYCA RNA
LUB
ILOŚĆ
Total RNA
Poli(A) RNA
0.1 – 5 µg
0.5 - 10 ng
Specyficzny RNA
≤ 0.01 pg
STARTERY
1 µl
Specyficzne 15-20 pmol/µl
Losowe 6-nukleotydowe
(Random Primers) 0.5 µg/mL
Oligo(DT)15 0.5 µg/mL
LUB
WODA
do 15.5 µL
2.
Składniki reakcji starannie wymieszać, a następnie zwirować.
3.
Mieszaninę inkubować 5 min w 70 °C, następnie umieścić próbówkę w lodzie. Po schłodzeniu zwirować.
4.
Umieścić probówkę w lodzie i dodać następujące składniki reakcji:
PROTOKÓŁ c.d.
SKŁADNIKI REAKCJI
M-MLV Buffer (5x)
dNTPs MIX, 10 mM
M-MLV odwrotna transkryptaza
5.
ILOŚĆ
5 µl
1 µl
0,5 µl
Inkubować mieszaninę 60 min w 37 °C.
W przypadku zastosowania starterów losowych (random primers) należy w pierwszej kolejności
przeprowadzić inkubację wstępną przez 10 min w 25 °C, a następnie 60 min w 37 °C.
6.
W celu zakończenia reakcji mieszaninę inkubować 10 min w 70 °C, następnie umieścić probówkę w lodzie.
Zalecenia:
Wykorzystanie poli(A) RNA zamiast całkowitego RNA pozwala istotnie podnieść specyficzność
i efektywność reakcji syntezy cDNA.
Startery oligo (dT) 15 w przeciwieństwie do starterów losowych nie wymagają szczególnej optymalizacji
warunków reakcji.
Należy zwrócić uwagę na współzależność pomiędzy stężeniem starterów losowych a ilością matrycy,
od której zależy długość uzyskiwanego cDNA. Zwiększenie stężenia losowych starterów prowadzi do
syntezy krótkich (około 600 nukleotydowych) cDNA, natomiast zmniejszenie ich stężenia będzie
sprzyjać syntezie dłuższych odcinków cDNA.
Problemy związane z obecnością w RNA struktur drugorzędowych oraz sekwencji bogatych w G i C
można zmniejszyć poprzez podniesienie temperatury reakcji do 45 °C (zamiast 37 C) lub poprzez
dodanie DMSO do mieszaniny reakcyjnej. Należy jednak pamiętać, że może to prowadzić do
zmniejszenia wydajności syntezy cDNA.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP
9721099648, email [email protected], www.novazym.com