UniversalScript RT Kit

kolumienki.pl
syngen.pl
UniversalScript RT Kit
Procedura
Zawartość opakowania i warunki przechowywania
UniversalScript RT Kit
5x UniversalScript RT Mix
20x UniversalScript RTase
+ RNase Inhibitor
SY590521
2 x 100 ul
2 x 25 ul
SY590522
2 x 400 ul
2 x 100 ul
UniversalScript RT Kit transportowany jest w
warunkach chłodniczych, bez suchego lodu.
Standardowe
przechowywanie
przebiega
w
temperaturze -20°C. Enzym wytrzymuje do 30 cykli
zamrażania i rozmrażania bez utraty aktywności. Aby
ułatwić pracę w przypadku używania kitu dzień po dniu,
możliwe jest przechowywanie go do 1 miesiąca w
temperaturze +4°C.
Opis komponentów
UniversalScript RT Kit składa się z dwóch miksów:
- 20x UniversalScript RTase + RNase Inhibitor
- 5x UniversalScript RT Mix
Miks 20x UniversalScript RTase + RNase Inhibitor zawiera
modyfikowaną genetycznie odwrotną transkryptazę MMLV, będącą wysoce aktywną polimerazą DNA zależną
od RNA - UniversalScript Reverse Transcriptase. Enzym
syntetyzuje komplementarną nić cDNA na matrycy
RNA, począwszy od uniwersalnych primerów.
Dodatkowo miks zawiera inhibitor RNaz, co zapobiega
ewentualnej degradacji RNA i pozwala na uzyskanie
pełnowymiarowego cDNA w dużej ilości. Enzym
utrzymuje
formę
płynną
w
temperaturze
-20°C
dzięki
specjalnemu
buforowi
do
przechowywania.
1. Wszystkie składniki należy całkowicie rozmrozić (o
ile przechowywano je w -20°C), zworteksować i
zwirować.
2. Do probówek reakcyjnych 0,2 ml dodać poniższe
składniki według podanej kolejności:
Do probówki 0,2 ml
dodać kolejno:
5x UniversalScript RT Mix
20x UniversalScript RTase
+ RNase Inhibitor
Matrycowe RNA
Woda do PCR
Objętość końcowa
Objętość
4 ul
1 ul
Stężenie w
reakcji
1x
1x
- 4 pg – 100 ng
dopełnić
do 20 ul
20 ul
3. Zamknąć probówki, umieścić w termocyklerze
i inkubować w temperaturze 42°C przez 30 minut.
Jeśli zawartość par GC przekracza 65%, można
podnieść temperaturę inkubacji do 55°C.
4. Inkubować w temperaturze 85°C przez 10 minut,
aby zdenaturować enzym.
Do dalszych reakcji PCR stosować 4 ul powstałego
cDNA na reakcję w 20 ul.
Miks 5x UniversalScript RT Mix zawiera bufor reakcyjny
UniversalScript,
skomponowany
tak,
aby
zoptymalizować wydajność i specyficzność procesu
odwrotnej transkrypcji. W skład miksu wchodzi MgCl2
w stężeniu 15mM, które jest optymalne dla tego
układu. Nie polecamy stosowania dodatkowych porcji
magnezu. Zawartość 5mM dNTP-ów eliminuje
konieczność dodawania własnych nukleotydów, co jest
częstym źródłem zanieczyszczeń RNazami. Miks
zawiera uniwersalne primery oligo-dT a także randomheksamery, co zapewnia przepisanie na cDNA całego
RNA, nawet będącego w złym stanie.
Mastermiks
Aby uniknąć pipetowania objętości rzędu 1 ul, można
sporządzić mastermiks reakcyjny składający się z obu
miksów. Przed dodaniem wody do mastermiksu należy
uwzględnić zakres stężeń matrycowego RNA, które
zamierzamy
przepisywać.
Mastermiks
należy
przygotowywać „na świeżo” i zużyć w ciągu jednego
eksperymentu, nie można go przechowywać.
Producent
Syngen Biotech Sp. z o.o. Sp. k.
54-116 Wrocław, ul. Ostródzka 13
tel. 71 349 70 13, 71 349 91 66, 71 349 61 67, faks 71 349 70 33
kolumienki.pl, syngen.pl, [email protected]