Streszczenie

Streszczenie
Wstęp. Syntetyczne glikokortykosteroidy jak prednizon czy deksametazon, są standardem w
chemioterapii indukującej ostrej białaczki limfoblastycznej (OBL) od wielu dekad, a oporność
na steroidoterapię stanowi niekorzystny rokowniczo czynnik. Ostatnie badania mające na celu
wyjaśnienie toksycznego mechanizmu działania glikokortykosteroidów (GKS) wykazały, że
hormony te w komórkach białaczkowych prowadzą do indukcji autofagii, która wymagana
jest do zainicjowania apoptotycznej śmierci komórki. Celem niniejszej pracy była
identyfikacja mechanizmów oporności na leczenie oraz scharakteryzowanie potencjału
terapeutycznego farmakologicznej ingerencji w układy sygnałowe związane z fenotypem
lekooporności.
Materiały i Metody Do analizy profilu ekspresji genów wykorzystano dostępne dane oraz
program GenePattern. Linie komórkowe OBL GKS-oporne (SEMK2), GKS-wrażliwe
(RS4;11) oraz pierwotne blasty OBL inkubowano z deksametazonem (DEX 0.05, 2 lub 30
µg/ml) w obecności lub przy braku inhibitora MEK1, selumetinibu (SEL, 200nM). Apoptozę
mierzono poprzez barwienie komórek aneksyną wraz z jodkiem propidyny z użyciem analizy
FACS. Aktywność ERK1/2, RSK i 4E-BP1 określono metodą Western blot. Proces autofagii
monitorowano poprzez ocenę akumulacji białka LC3II metodą Western blot, za pomocą
barwienia MDC (monodansylkadaweryna) oraz oceny dystrybucji GFP-LC3. Wyciszenie
Bekliny-1 (BCN-1), genu niezbędnego dla inicjacji powstawania autofagosomów uzyskano
poprzez shRNA i infekcję retrowirusową komórek SEMK2.
Wyniki. Do porównania profilu ekspresji genów w blastach GKS- opornych i GKSwrażliwych i identyfikacji mechanizmu lekooporności wykorzystano algorytm GSEA.
Wykazano, że komórki lekooporne charakteryzują się nadekspresją kaskady sygnałowej
MAPK/ERK (p<0.001, FDR=0.17). W linii GKS- opornej (SEMK2) selumetinib zahamował
aktywność szlaku MAPK/ERK i dwukrotnie zwiększył wrażliwość na deksametazon.
Uwrażliwienie obserwowano również w części badanych blastów pochodzących od
pacjentów z OBL. Wprowadzenie konstytutywnej kinazy MEK1 (MEK-DD) do komórek
GKS- wrażliwych (RS4;11) prowadziło do indukcji oporności na deksametazon. Ponieważ
GKS w komórkach GKS- wrażliwych indukują autofagię, niezbędną do zainicjowania
apoptozy, oceniono następnie poziom autofagii w odpowiedzi na DEX, SEL lub kombinację
leków w komórkach GKS- wrażliwych i -opornych. W tym celu wykorzystano metodę
western blot oceniającą poziom białka LC3II, a także barwienie MDC oraz ocenę dystrybucji
GFP-LC3. Zgodnie z obserwowanym uwrażliwieniem, znaczącą indukcję autofagii w
komórkach GKS- opornych obserwowano dopiero po połączeniu deksametazonu z
inhibitorem szlaku MAPK/ERK. Po zastosowaniu kombinacji leków w komórkach tych
obserwowano również spadek fosforylacji białka 4E-BP1, będącego substratem kinazy
mTORC1, kontrolującej autofagię. Molekularny mechanizm odpowiadający za spadek
aktywności mTORC1 wskutek działania selumetinibu obejmuje zahamowanie substratu
ERK1/2, kinazy p90RSK, która reguluje działanie kompleksu TSC2/1. Następnie w
komórkach GKS- opornych wyciszono gen BCN-1 i oceniono wrażliwość na połączenie
DEX/SEL. Komórki z defektem autofagii charakteryzowała niższa odpowiedź apoptotyczna
na zastosowanie kombinacji leków.
Wnioski Inhibitor kinazy MEK1, selumetinib, uwrażliwia komórki OBL oporne na GKS.
Uwrażliwienie to wynika z zahamowania aktywności kinazy mTORC1 i indukcji autofagii,
niezbędnej do apoptotycznej śmierci komórki.