1 Warszawa, 3 grudnia 2016 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr

Prof. dr hab. Andrzej Kutner
Instytut Farmaceutyczny, Zakład Farmakologii
ul. Rydygiera 8; 01-793 Warszawa
http://ifarm.eu/pl/firma/prof-dr-hab-andrzej-kutner
[email protected]; tel. 22 456 3861; kom. 605-586-519
Współkoordynator FP7-PEOPLE 2012-2017 ITN DECIDE
http://www.birmingham.ac.uk/generic/decide/index.aspx
Warszawa, 3 grudnia 2016
Recenzja
rozprawy doktorskiej mgr Alberta Stankiewicza
pt.: „Ocena stanu zanieczyszczenia wód powierzchniowych
substancjami działającymi na układ sercowo-naczyniowy i ich metabolitami
na przykładzie Wisły w rejonie Warszawy”
Recenzowana praca na stopień doktora nauk farmaceutycznych została wykonana w
Zakładzie Bioanalizy i Analizy Leków Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny
Laboratoryjnej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Promotorem pracy jest prof. dr
hab. Piotr Wroczyński, a promotorem pomocniczym dr Joanna Giebułtowicz. Jak widać,
recenzowana praca doktorska powstała w środowisku naukowym doświadczonych badaczy, a
tematyka pracy wpisuje się w wieloletnie badania naukowe tego zespołu. Istotny wkład
naukowy doktoranta do badań zespołu został przedstawiony w postaci trzech spójnych
tematycznie publikacji, w specjalistycznych czasopismach międzynarodowych, o względnie
wysokim współczynniku oddziaływania. Zrozumiałe jest więc, że praca doktorska została
przygotowana w nowym trybie, w postaci komentarza do zestawu opublikowanych już
artykułów. Doktorant jest pierwszym autorem pracy przeglądowej i pierwszej pracy
eksperymentalnej oraz drugim autorem drugiej pracy. Nie ulega wątpliwości, że
przedstawiona w ten sposób praca doktorska spełnia odpowiednie kryteria Wydziału
Farmaceutycznego, dotyczące formy rozprawy doktorskiej (Uchwała Rady Wydziału z dnia
22 kwietnia 2015 r.), jako „cykl spójnych tematycznie prac, (co najmniej 3) opublikowanych
lub przyjętych do druku publikacji z sumarycznym IF, co najmniej 3 w tym 1 praca
przeglądowa”, w których „doktorant powinien być pierwszym autorem, co najmniej 2 prac”.
Zgodnie z wymaganiami, dla wybranej przez doktoranta formy pracy doktorskiej (zbiór
spójnych tematycznie publikacji), do dysertacji zostały dołączone oświadczenia wszystkich
współautorów dotyczące wkładu merytorycznego do publikacji, które stanowią przedmiot
1
pracy doktorskiej, w postaci opisowej i procentowej. Według oświadczeń współautorów,
doktorant jest głównym autorem pracy przeglądowej oraz jednym z dwóch głównych autorów
prac eksperymentalnych.
Dysertacja, w formie komentarza o objętości ponad trzydziestu stron, zawiera
Streszczenie pracy w języku polskim i angielskim, z podaniem celu pracy i sposobu jego
realizacji oraz przedstawia główne osiągnięcia naukowe doktoranta. Dalej następuje w
dysertacji Wstęp, przedstawiający tło naukowe i istotę badanego problemu, Cel pracy,
stosowane Materiały i metody, uzyskane Wyniki i ich dyskusję, a także Podsumowanie i
podane w punktach główne osiągnięcia. Na końcu komentarza podano trzydzieści pozycji
Piśmiennictwa. Komentarz jest uzupełniony o kopie opublikowanych artykułów oraz, co
istotne, również o obszerne dane uzupełniające do artykułów (tzw. Supplementary data).
Dane te zawierają, w przypadku artykułu przeglądowego, bardzo obszerne, szczegółowe i
kompleksowe wyniki eksperymentalne do opisanych w literaturze metod analitycznych,
stosowanych w badaniu leków, podawanych w chorobach układu sercowo-naczyniowego
(Appendix A), wartości odzysku i odchyleń standardowych dla badanych substancji
farmaceutycznych w matrycach badanych próbek wody (Appendix B) oraz wartości LOQ i
stężania badanych substancji w różnych matrycach (Appendix C). W przypadku drugiej pracy
eksperymentalnej doktoranta materiał ten uzupełnia część publikacji p.t. „Materiały i metody”
i zawiera dane dotyczące pobranych próbek (Tabele S1, S2 i S3), warunki oznaczeń MS/MS
dla obszernej grupy badanych substancji farmaceutycznych (Tabela S4), parametry
fizykochemiczne badanych próbek wody (Tabele S5, S6 i S7) oraz dane wykazujące
skuteczność opracowanych metod analitycznych (Tabela S8). W ten sposób, dołączony
materiał dodatkowy, dostępny w formie elektronicznej przy opublikowanych artykułach, w
pełni zastępuje tradycyjny rozdział dysertacji doktorskich, zatytułowany zwykle „Materiały i
metody”. W podsumowaniu, przedstawiony komentarz i dołączone do niego artykuły oraz
materiały dodatkowe w pełni przedstawiają badania wykonane przez mgr Stankiewicza i
stanowią odpowiednią podstawę do oceny jego pracy doktorskiej.
W Streszczeniu doktorant przedstawił pokrótce konsekwencje chorób sercowonaczyniowych dla stanu zdrowia społeczeństwa oraz drogi przenikania leków z tej grupy do
środowiska. Opisane zostały negatywne skutki występowania substancji czynnych leków i ich
metabolitów w wodach gruntowych i wodociągowych. Doktorant przedstawił jasno cele pracy
i wybór sposobu ich realizacji. W punktach przedstawione zostały osiągnięcia doktoranta, ich
znaczenie naukowe oraz ewentualne skutki społeczne. Opis tych osiągnięć został następnie w
znacznej mierze przytoczony w końcowej części „Podsumowanie i główne osiągnięcia”.
Wersja angielska Streszczenia przygotowana jest bardzo profesjonalnie. W krótkim
Wstępie doktorant przedstawił uzasadnienie wyboru tematyki badawczej, a w szczególności
podjęcie badań tej właśnie grupy leków. Opisał bardziej szczegółowo stan zachorowalności
na choroby sercowo-naczyniowe w kraju, na tle sytuacji światowej. Przedstawione zostały
pokrótce wyniki badań innych autorów dotyczące podobnych zagadnień oraz
przedyskutowano ewentualne konsekwencje środowiskowe i społeczne braku danych na
temat występowania badanej grupy związków w badanych materiałach.
Cel pracy i sposób jego realizacji został przedstawiony precyzyjnie. Zasadniczym
celem pracy jest opracowanie, optymalizacja i walidacja metod analitycznych oznaczania
obszernej grupy substancji czynnych leków oraz ich głównych metabolitów. Wykonanie
2
pracochłonnej walidacji pozwoliło na zastosowanie opracowanych metod do materiału
rzeczywistego, a następnie na wyciagnięcie wniosków nie tylko naukowych, ale i
praktycznych. „Materiały i metody” przedstawiono wystarczająco szczegółowo. W Tabeli
podano wszystkie badane substancje farmaceutyczne (30) oraz główne metabolity niektórych
z nich (4). Wskazano na konieczność opracowania metod o niezwykle wysokiej czułości, ze
względu na bardzo niskie, nanogramowe stężenia badanych związków w próbkach
środowiskowych. Do wykonania swoich badań doktorant wybrał odpowiednią technikę
jonizacji (elektrorozpraszanie), w wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej z
tandemową spektrometrią mas. Opisał pobieranie materiału do badań i sposób zapewnienia
wiarygodności otrzymanych wyników. Ze względu na bardzo niskie stężenia analitów
przeprowadził wstępne ich zagęszczenie, zgodnie z regułami w sztuce, metodą ekstrakcji do
fazy stałej, z wykorzystaniem gotowych kolumienek. Doktorant wykonał pełną walidację
opracowanych metod analitycznych, dzięki czemu uzyskane wyniki można uznać za
wiarygodne. Opisane zostały miejsca poboru próbek wody wraz z ich dokładną lokalizacją i
jej uzasadnieniem.
W części „Wyniki i dyskusja” doktorant przedstawił kolejne wyniki badań i prac
literaturowych wchodzących w zakres pracy. W pracy przeglądowej (D1) dokonał
szczegółowej i kompletnej analizy dostępnych danych literaturowych, dotyczących
zawartości substancji farmaceutycznych w wodach powierzchniowych, w okresie ostatnich
dziesięciu lat. Zasadniczym celem pracy było wybranie takiej metody analitycznej, która
może być, w sposób wiarygodny, zastosowana do badania próbek wód powierzchniowych,
zawierających badane substancje farmaceutyczne w bardzo niskich i silnie zróżnicowanych
stężeniach. Doktorant przedyskutował kryteria doboru odpowiednich standardów
wewnętrznych, zagadnienie odzysku bezwzględnego, efekt matrycowy oraz sposób uzyskania
wymaganych limitów detekcji i oznaczalności.
W pracy eksperymentalnej (D3) doktorant dokonał optymalizacji i walidacji metody
analitycznej, wybranej w wyniku badań literaturowych i przedstawionej w pracy
przeglądowej (D1). Doktorant przeprowadził wszystkie etapy standardowej walidacji metody
analitycznej i wyznaczył zakres liniowości metody, stabilność próbek w czasie wykonania
analizy, limit detekcji i oznaczalności, odzysk bezwzględny, efekt matrycowy i precyzję, w
tym powtarzalność i odtwarzalność metody. W wyniku przeprowadzonych badań doktorant
wykazał, że opracowana metoda może być z powodzeniem zastosowana do oznaczania
wszystkich badanych substancji farmaceutycznych i ich wygenerowanych metabolitów w
próbkach rzeczywistych. Obecność lub brak występowania niektórych substancji w próbkach
środowiskowych doktorant przekonująco wyjaśnił kinetyką ich metabolizmu, skalą ich
stosowania w lecznictwie krajowym albo skutecznością procesu oczyszczania ścieków
komunalnych, a także innymi czynnikami środowiskowymi, takimi jak efektywność procesu
biodegradacji i zależna od temperatury i natlenienia fotoliza. Według prawidłowej opinii
doktoranta, poziomy substancji farmaceutycznych w poszczególnych punktach pomiarowych
były zgodne z oczekiwaniem, opartym o ich lokalizację. Wyniki oznaczeń w wodach
powierzchniowych z okolic Warszawy doktorant porównał z analogicznymi wynikami
opisanymi dla innych krajów europejskich oraz wskazał na substancje, których poziom
występowania jest podobny oraz specyficzny dla kraju. Niektóre z badanych substancji
farmaceutycznych zostały wykryte przez doktoranta w próbkach środowiskowych po raz
3
pierwszy na świecie, poziom innych okazał się najwyższy na świecie. Ciekawe wyniki
uzyskał doktorant w badaniu ekstremalnie niskich stężeń substancji farmaceutycznych w
próbkach wody wodociągowej. Potwierdzony został, niestety, fenomen fenofibratu jego
nieskutecznego usuwania w procesie oczyszczania wody i jego porównywalnych stężeń w
wodzie powierzchniowej i wodociągowej. Uzyskane przez doktoranta wyniki badań wskazują
na niepokojące i względnie wysokie poziomy sartanów i diuretyków i wymagają pewnie w
kraju stałego monitorowania. Na podstawie uzyskanych wyników doktorant porównał
przewidywane i zmierzone wartości stężeń badanych substancji farmaceutycznych. Poza
wynikami badań analitycznych uwzględnił również dane rynkowe dotyczące wielkości
sprzedaży odpowiednich leków sercowo-naczyniowych. Doktorant słusznie sugeruje
konieczność przeprowadzenia oceny ryzyka zagrożenia środowiska substancjami
farmaceutycznymi, ze względu na wielokrotne przekroczenie limitów środowiskowych,
ustalonych przez EMA. W swojej pracy doktorant, w sposób bardzo odpowiedzialny,
wykracza poza naukowe aspekty swoich badań i zwraca uwagę na ryzyko akumulacji w
środowisku substancji farmaceutycznych nie tylko o wysokiej przewidywanej wartości
stężenia, ale i o specyficznych właściwościach fizykochemicznych, wpływających na
skuteczność procesu oczyszczania wód, takich jak współczynnik podziału.
Bardzo skrótowo, natomiast, doktorant przedstawił ciekawe wyniki swojej pierwszej
pracy eksperymentalnej (D2) dotyczącej zastosowania, po raz pierwszy, metod
biotransformacji do wytworzenia, niedostępnych w inny sposób, metabolitów substancji
farmaceutycznych. Doktorant opracował sposób wykorzystania frakcji S9 homogenatu
wątroby szczurzej do wytworzenia metabolitów wybranych substancji farmaceutycznych oraz
wykazał, poprzez badanie mechanizmów fragmentacji, że można stwierdzić obecność
oczekiwanych metabolitów w badanych próbkach rzeczywistych. W ten sposób doktorant
potwierdził obecność hydroksylowanych aromatycznych pochodnych propranololu, w oparciu
o poprzednio opracowane podobne metody dla takich -blokerów jak metoprolol i bisoprolol.
Zastosował również metody in silico do wymodelowania struktury potencjalnych
metabolitów. Dzięki opracowanym metodom oraz zastosowanej technice wysokorozdzielczej
LC-MS/MS, okazało się możliwe wykrycie, po raz pierwszy w próbkach środowiskowych,
kilku metabolitów substancji beta-adrenolitycznych.
Dane uzupełniające (Supplementary data) do artykułu przeglądowego i drugiej pracy
eksperymentalnej doktoranta stanowią odpowiednie uzupełnienie rozdziału „Materials and
methods” w tych publikacjach i przedstawiają wszystkie szczegóły opracowanych metod
analitycznych. Szkoda, że tego typu dane nie zostały dodane do wyników badań
przedstawionych w pierwszej publikacji eksperymentalnej (D2) doktoranta.
W swojej pracy doktorskiej mgr Stankiewicz zbadał występowanie w wodach
powierzchniowych nie tylko licznej grupy substancji farmaceutycznych, ale i metabolitów
kilku z nich. W pracy brak przekonującego uzasadnienia, dlaczego do badań włączono
metabolity tylko czterech substancji farmaceutycznych z grupy trzydziestu badanych i jakie
były kryteria wyboru metabolitów do badań.
Stanowczo zbyt skrótowo doktorant potraktował swoją pierwszą pracę
eksperymentalną (D2). W komentarzu, o objętości pół strony, przedstawił wprawdzie zasady
opracowanej biotransformacji substancji farmaceutycznych, ale brak jest jakiegokolwiek
4
komentarza i wyjaśnienia, na czym polegała zastosowana metoda in silico generowania
teoretycznych stanów przejściowych (Multiple Reaction Monitoring).
Ponadto, szereg drobnych korekt, dotyczących głównie uściślenia stosowanych pojęć i
nazw, zaznaczono w edytowalnej (elektronicznej) wersji pracy, w opcji śledzenia zmian i
przekazano już bezpośrednio doktorantowi. Pragnę jednak podkreślić, że wszystkie te drobne
uchybienia w niczym nie umniejszają wysokiej wartości merytorycznej przedstawionej pracy
doktorskiej.
Wyniki badań doktoranta zostały przedstawione nie tylko w postaci cyklu spójnych
tematycznie trzech publikacji, ze znaczącym udziałem doktoranta, ale zostały również przez
niego zaprezentowane, w formie prezentacji ustnych, na konferencji krajowej i
międzynarodowej oraz w formie posteru na konferencji krajowej.
W podsumowaniu stwierdzam z całym przekonaniem, że przedstawiona do recenzji
praca doktorska spełnia wszystkie wymagania stawiane w Ustawie o stopniach i tytule
naukowym z dnia 14 marca 2003 roku oraz Uchwale Rady Wydziału z dnia 22 kwietnia 2015
roku i wnoszę o dopuszczenie mgr Alberta Stankiewicza do dalszych etapów przewodu
doktorskiego.
Jednocześnie, ze względu na znaczące dokonania naukowe i sposób przedstawienia
wyników badań, a także opublikowanie wszystkich fragmentów pracy w postaci artykułów w
czasopismach z Listy Filadelfijskiej, w których doktorant jest pierwszym autorem co najmniej
jednej z nich i których łączny współczynnik oddziaływania wynosi 8,5, czyli znacznie
przekracza wymaganą wartość, na podstawie Uchwały Rady Wydziału z dnia 20 marca 2013
roku, wnoszę do wysokiej Rady o przyznanie mgr Albertowi Stankiewiczowi stopnia doktora
nauk farmaceutycznych z najwyższym wyróżnieniem, Summa cum laude.
Z wyrazami szacunku
A/prace doktorskie/Stankiewicz Albert recenzja 2016.doc
5