Zmiana poziomu ekspresji syncytyny I w komórkach linii HEK293 po

&ARM0RZEGL.AUK†
:MIANAPOZIOMUEKSPRESJISYNCYTYNY)WKOMÌRKACHLINII(%+
POINFEKCJIENDOGENNYMIRETROWIRUSAMIuWINI0%26
#HANGESOFSYNCTYTIN)EXPRESSIONLEVELIN(%+CELLSLINE
AFTERINFECTIONBYPORCINEENDOGENOUSRETROVIRUSES0%26
'RZEGORZ-ACHNIK$ANIEL3YPNIEWSKI3ABINA'AŒKA
4OMASZ,OCH$AGNA3OŒTYSIK$ARIA"ŒASZCZYK)LONA"EDNAREK
:AKŒAD"IOTECHNOLOGIII)N˜YNIERII'ENETYCZNEJ7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Endogenne retrowirusy (ang. ERVs) są ruchomymi elementami genetycznymi obecnymi w genomie, których
obecność wykazano u wszystkich kręgowców. ERVs innych gatunków mogą stanowić szczególne zagrożenie
infekcyjne dla człowieka, jeżeli wprowadzone zostaną
zabiegi ksenotransplantacji, czyli przeszczepów odzwierzęcych. W przypadku świni domowej, gatunku który jest
brany pod uwagę jako źródło narządów do przeszczepów,
ryzyko stanowią endogenne retrowirusy świni (PERVs).
Endogenne retrowirusy różnych gatunków mogą ulegać
rekombinacjom a także podlegać zmianom ekspresji na
skutek różnych elementów regulatorowych, zarówno
endo- jak i egzogennego pochodzenia. Genom człowieka
również zawiera wiele kopii endogennych retrowirusów
(HERVs) należących do różnych rodzin, w tym do rodziny HERV-W, której ekspresja ma duże znaczenie w warunkach fizjologicznych oraz w niektórych stanach chorobowych. Przeprowadzone badania miały na celu ocenę,
czy ilość białka syncytyny I –produktu ekspresji genu env
HERV-W w jednym z loci zmienia się w komórkach linii
HEK293 zakażonej PERV w odniesieniu do niezakażonej linii HEK293. Wykazano statystycznie istotne różnice
w ilości syncytyny I w analizowanych próbkach.
Endogenous retroviruses (ERVs) are the mobile genetic
elements, which are integrated in genome of all vertebrates .As the xenotransplantation is thought to be a solution of permanent organ deficiency, ERVs pose a serious
infection risk and should be taken into particular consideration. It has been shown, that ERVs of several species
are capable to recombine and may also undergo expression modulation by cellular and exogenous regulatory
elements. Porcine endogenous retroviruses (PERVs) may
be dangerous if swine would serve as organ donor source
for human recipients. Because several families of endogenous retroviruses are also present in human genome
(HERVs), we checked, if the presence of PERVs in human cell line HEK293 modulate human endogenous retrovirus (HERV-W family) expression at the protein level.
Our findings showed, that an amount of syncytin-I, - the
expression product of one of the HERV-W locus, changes
in HEK293 cells infected by PERV in comparison with
non-infected HEK293 cell line.
Key-words: Transplantation, Heterologous; Endogenous
retroviruses; Recombination, Genetic, Gene Expression
Słowa kluczowe: transplantacje heterologiczne; endogenne retrowirusy; rekombinacja genetyczna, ekspresja genu
Wstęp
Endogenne retrowirusy (ang. endogenous retroviruses
ERVs) występują u wszystkich, jak dotąd przebadanych,
kręgowców. Są to sekwencje, które, obok pseudogenów, retrogenów, retropozonów i retrotranspozonów, należą do tzw.
elementów ruchomych w genomie [1]. W przeciwieństwie
do wyżej wymienionych, endogenne retrowirusy jako jedyne
posiadają najistotniejsze elementy niezbędne do infekowania komórek, czyli sekwencję kodującą enzym retrowirusowy- odwrotną transkryptazę (RT) oraz sekwencję kodującą
białko otoczki wirusa (env). Geny te, wraz z genem kodującym białko strukturalne (gag), oflankowane są sekwencjami
o charakterze regulatorowym, tzw. długimi powtórzeniami końcowymi (ang. long terminal repeats, LTRs). Budowę licznych retroelementów znajdujących się w genomie
człowieka opisano szczegółowo w pracach przeglądowych,
np. w pracy Zwolińskiej [1]. Jak się przypuszcza, obecność w genomie endogennych retrowirusów jest skutkiem
zakażeń retrowirusami, które miały miejsce w przeszłości
w toku ewolucji. Wskazuje na to podobieństwo w strukturze
genetycznej do współcześnie istniejących retrowirusów eg-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
zogennych (w przypadku człowieka są to np. wirus nabytego niedoboru odporności (HIV), czy wirus T-limfotropowy
(HTLV)). Ze względu na brak presji selekcyjnej, zdecydowana większość endogennych elementów retrowirusowych
posiada liczne mutacje, które powodują, że z otwartych ramek odczytu (ORFs) rzadko powstają funkcjonalne białka,
zaś w pełni infekcyjne cząstki wirusowe- tylko w wyjątkowych przypadkach. Niektóre retrowirusy endogenne, jak np.
endogenny retrowirus wirus owiec jest niemal identyczny
pod względem budowy jak jego egzogenny odpowiednikwirus Jaagsiekte, co świadczy o pochodzeniu ERVs ze środowiska zewnętrznego oraz wskazuje, że proces integracji
z genomem gatunku- gospodarza zaszedł stosunkowo niedawno [2]. Człowiek jest również nosicielem dużej liczby
swoistych endogennych retrowirusów (ang. human endogenous retroviruses, HERVs). Przypuszczalnie aż 5-8%
wszystkich sekwencji genomowych stanowią cząstki o pochodzeniu retrowirusowym [3]. HERVs występują w wielu
kopiach, których liczba waha się w zależności od rodziny od
kilkunastu (HERV-T) do kilkuset (HERV-H) [4]. Dla rodziny HERV-W liczba loci dla poszczególnych genów gag, pol
i env wynosi odpowiednio: 70, 100 i 30 rozproszonych na
różnych chromosomach [5]. Endogenne retrowirusy człowieka mają zróżnicowaną budowę genetyczną; analizowane pod kątem filogenetycznym wykazują podobieństwa do
różnych grup retrowirusów, takich jak alfa beta i gamma [4].
W nomenklaturze przyjęto, że nazwy poszczególnych typów
(zwanych rodzinami) endogennych retrowirusów człowieka
ustala się na podstawie symbolu aminokwasu, odpowiadającemu tRNA, który jest wykorzystywany przez wirusa do
inicjacji procesu transkrypcji. Przykładowo, HERV-R wykorzystuje tRNA dla argininy (tRNA.R) [4]. Biorąc pod uwagę
doniesienia naukowe wskazujące, iż poszczególne rodziny
HERV lub nawet określone loci mają duży wpływ na organizm człowieka, manifestujący się zarówno w warunkach
fizjologicznych jak i w niektórych stanach patologicznych,
ludzkie endogenne retrowirusy są obecnie przedmiotem
licznych badań. Wykazano, iż zwiększona ekspresja sekwencji HERV-K spotykana jest w licznych nowotworach,
szczególnie wywodzących się z komórek zarodkowych,
jak np. potworniak oraz nasieniak ale też powiązana jest
z czerniakiem [5] i rakiem piersi [6]. Zmienioną ekspresję
HERV-W wykryto w przypadku niektórych chorób psychicznych, np. w płynie mózgowym chorych na schizofrenię. Ta sama rodzina endogennych retrowirusów (HERV
-W) wykazuje zwiększoną ekspresję u osób cierpiących na
stwardnienie rozsiane (sclerosis multiplex, SM) [7], łuszczycę i toczeń układowy [8]. Stąd istnieją przypuszczenia,
że endogenne retrowirusy mają duże znaczenie w chorobach
o podłożu (auto-) immunologicznym. Produkt ekspresji
genu HERV-W env posiada cechy superantygenu i ma zdolność do aktywacji wrodzonego układu immunologicznego.
Podejrzewa się, że nadekspresja genu env HERV-W ma
szczególny wpływ na rozwój schizofrenii [9]. Jak wskazują
liczne badania, HERVs mają równocześnie istotne znaczenie
w niektórych procesach fizjologicznych człowieka. Szczególnym przypadkiem jest np. endogenny retrowirus rodziny
HERV-W, którego jeden z genów- env, kodujący białko
otoczki wirusowej, ulega silnej ekspresji w prawidłowym
łożysku. W łożysku, a szczególnie w obrębie cytotrofobla-
stu, stwierdza się obecność licznych glikoprotein- produktów ekspresji genu env HERV-W. Glikoproteiny te umożliwiają tworzenie syncytiotrofoblastu- warstwy wielojądrzastych komórek umożliwiających połączenie w łożysku
organizmu matki i rozwijającego się płodu [10]. Ze względu na zdolność do tworzenia syncytiów, produkt genu env
HERV-W nazywany jest syncytyną I (ang. syncytin-I). Jest
też prawdopodobne, że produkty ekspresji genu env HERV
-W w łożysku mają dla zarodka znaczenie immunoprotekcyjne, które chroni go przed możliwym odrzuceniem przez
układ immunologiczny matki. W łożysku wykryto również
wysoką ekspresję genu env retrowirusów z rodziny HERV
-R. Sugeruje się, że wraz z analogicznymi produktami ekspresji env HERV-W glikoproteiny te zapobiegają zakażeniu
zarodka przez egzogenne retrowirusy poprzez konkurencyjne blokowanie receptorów [11].
Endogenne retrowirusy mają duże znaczenie w przypadku ksenotransplantacji, czyli przeszczepów organów pochodzących od zwierząt do organizmu człowieka. Temat ten jest
aktualny od kilku dziesięcioleci, ponieważ stale obserwuje
się niedostatek pacjentów do przeszczepów allogenicznych
(przyp. od autora: szczegółowe dane liczbowe można odnaleźć na stronie internetowej www.poltransplant.org.pl).
Możliwość ksenotransplantacji rozwiązałaby radykalnie
problem braku dawców, jednak wdrożenie tej dziedziny
napotyka na liczne przeszkody. Jedną z nich jest obecność
ERVs w organizmach zwierząt wszystkich możliwych gatunków donorowych. Ponieważ obecnie za optymalne źródło narządów do przeszczepów uważa się świnię domową
(Sus scrofa), endogenne retrowirusy tego gatunku są przedmiotem licznych badań. Niestety, endogenne retrowirusy
świni (ang. porcine endogenous retroviruses, PERVs) jako
jedne z nielicznych przedstawicieli ERVs ulegają ekspresji
tworząc aktywne cząstki wirusowe. Ponadto wykazano, że
PERV są zdolne do infekowania komórek człowieka in vitro
[12]. Jak dotąd nie potwierdzono jednak, aby endogenne retrowirusy świni były zdolne do zakażania człowieka w warunkach in vivo, prawdopodobnie ze względu na skuteczną
barierę immunologiczną. Niemniej w przypadku niektórych
linii komórkowych, jak linia embrionalnej nerki człowieka
HEK293, infekcje PERV mają charakter produktywny, skutkujący wytworzeniem zakaźnych cząstek potomnych [13].
Oprócz ryzyka zakażenia organizmu biorcy przez
PERV, istnieje też możliwość zajścia rekombinacji pomiędzy wirusami o podobnej budowie genetycznej. Zjawisko
to wykryto np. pomiędzy retrowirusami HIV-1 i HIV-2.
Rekombinacje genetyczne pomiędzy wirusami o podobnej
budowie genetycznej mogą skutkować pojawieniem się cząstek o zmienionym (zwiększonym) potencjale infekcyjnym
i mogą być faworyzowane w drodze pozytywnej selekcji.
Wykazano, że w przypadku endogennych retrowirusów
świni zachodzi rekombinacja pomiędzy dwoma subtypami
(PERV-A i PERV-C), powstająca cząsteczka PERV-A/C ma
zwiększony potencjał infekcyjny a kolejne pasaże w hodowlach komórek ludzkich HEK293 powodują dalsze zmiany
w budowie genomu wirusów [14]. W przypadku ksenotransplantacji są też teoretycznie możliwe rekombinacje między
PERV a endogennymi retrowirusami człowieka. Dotyczy to
zwłaszcza tych rodzin, które, podobnie jak PERVs, należą
do gamma- retrowirusów, czyli np. HERV-E, HERV-T lub
&ARM0RZEGL.AUK
rodzin, które blisko korelują filogenetycznie z gamma- retrowirusami. Są to np. HERV-R, HERV-W, HERV-H i kilka
innych. Uważa się, że oprócz rekombinacji na poziomie wirusowego RNA możliwe jest upakowanie cząstek RNA jednego wirusa w kapsydzie białkowym pochodzącym od innego wirusa. Taki proces miał miejsce podczas prób terapii
genowej u ssaków naczelnych. Zaobserwowano wówczas
przypadkowe, endogenne sekwencje (w tym należące do
endogennych retrowirusów) w wektorach retrowirusowych,
a następnie wykazano ich ekspresję w organizmie biorcy
[15]. Z kolei dotychczasowe poszukiwania rekombinantów
pomiędzy PERV a HERV nie potwierdziły ich obecności
[16], lecz badania w tej tematyce nie są liczne. Retrowirusy
posiadają w swym genomie wiele sekwencji o charakterze
regulatorowym, które po zakażeniu i integracji z genomowym DNA w niektórych przypadkach mogą modulować
ekspresję genów leżących w pobliżu [17]. Ze względu na
rolę, jaką spełniają HERV w organizmie człowieka, istotne
jest aby ocenić, czy obecność PERV nie wpływa na ekspresję tych retrowirusów.
Celem przedstawionej pracy było wykazanie, czy zakażenie komórek człowieka linii HEK293 wirusami PERV
ma wpływ na poziom ekspresji endogennych retrowirusów
człowieka z rodziny HERV-W. Ocenę procesu ekspresji prowadzono na poziomie białka.
Materiał i metody
Materiał badany
Próbkami badanymi były komórki linii HEK293 (Human Embryo Kidney, nr ECACC 85120602), komórki linii HEK293 infekowanej wirusami PERV (293/CIRCE, nr
ECACC: 97051411), oraz komórki linii nerki świni PK-15
(otrzymane od dr A. Lipowskiego z Państwowego Instytutu Weterynaryjnego- Państwowego Instytutu Badawczego
w Puławach). Hodowle komórkowe prowadzono w pożywce DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz antybiotyku (PAA, Austria). Wszystkie linie były
utrzymywane w hodowli do uzyskania stanu subkonfluencji
(70-80%) a następnie pasażowane w stosunku 1:6. Komórki
linii 293/CIRCE stanowiły kontrolę dodatnią zakażenia wirusami PERV. Procedura zakażania komórek HEK293 wirusami PERV pochodzącymi z nadsączu komórkowego linii
nerki świni PK-15 była przeprowadzona wg metody opisanej przez Kuddus i wsp. [18] oraz na podstawie informacji
własnych tego autora. Komórki HEK293 były posiewane
1 dobę przed zakażeniem w naczyniu hodowlanym (butelce)
o pojemności 75ml w standardowych warunkach, bez dodatku antybiotyków. W celu przygotowania zawiesiny wirusów PERV do infekcji komórek HEK293 zebrano pożywkę
hodowlaną z komórek PK- 15 pobraną po 48 godzinach prowadzenia hodowli komórkowej a następnie filtrowano przez
filtr o średnicy porów 0,45μm w celu pozbycia się komórek.
Infekcję prowadzono w obecności polibrenu (Hexadimethrine bromide, Sigma) przez 4 godziny, po czym pożywkę
zlewano i zastępowano świeżą, wolną od wirusów. Hodowlę kontynuowano do uzyskania 22 pasażu. Próbki komórek
do badań (ok. 5x106) pobierano w trzech powtórzeniach
po każdym pasażu komórkowym, przemywano roztworem
PBS i zamrażano w -80°C.
Ekstrakcja DNA i reakcja łańcuchowa polimerazy
(PCR)
Kwas deoksyrybonukleinowy ekstrahowano z komórek
(ok. 5x106) pobranych po każdym pasażu. Do izolacji DNA
zastosowano proteinazę K (Fermentas, Litwa), a po 1 godzinie inkubacji w 55°C przeprowadzono precypitację białek
przez dodanie 5M roztworu NaCl. DNA wytrącano z roztworu za pomocą 2-propanolu, osad przemywano 70% roztworem alkoholu etylowego. DNA rozpuszczano w buforze
TE (10 mM Tris-HCl, pH=8,0; 1mM EDTA) w końcowej
objętości 100μl. Jakość i stężenie ekstraktów DNA oceniano
spektrofotometrycznie przy długościach fali 260 i 280nm.
Stężenia kwasów nukleinowych w ekstraktach wynosiły
średnio od 100-250ng/μl, stosunek A260/280 wahał się od 1,70
do 1,85. Reakcję łańcuchową polimerazy przeprowadzono
z użyciem aparatu Mastercycler ep PCR (Eppendorf, Niemcy). Do detekcji materiału genetycznego PERV zastosowano warunki opisane przez Paradis i wsp [19], przy użyciu
starterów: PERV_F: TGA TCT AGT GAG AGA GGC AGA
G oraz PERV_R: CGC ACA CTG GTC CTT GTC G. Jako
kontrolę reakcji zastosowano fragment genu konstytutywnego- dehydrogenazy 3-fosforanu gliceraldehydu świni
(pGAPDH). Startery do reakcji PCR dla tego genu zaprojektowano za pomocą programu eprimer3 (pakiet EMBOSS).
Sekwencje starterów były następujące: pGAPDH_F: TGT
CGC CAT CAA TGA CCC C; pGAPDH_R: TGA CAA
GCT TCC CAT TCT C. Skład mieszaniny reakcyjnej stanowił 1x bufor reakcyjny, 200nM każdego z dNTP, 300nM
każdego ze starterów, 2,5mM MgCl2, 1U polimerazy Taq
(Fermentas, Litwa). Do mieszaniny dodawano 1μl ekstraktów DNA (100-250ng). Warunki termiczne: 95°C-5min., 40
cykli: 95°C-30sek, 61°C-30sek, 72°C-40sek; 72°C-10min.
Po reakcji produkty analizowano w 1,5% żelu agarozowym
barwionym bromkiem etydyny w obecności wzorca wielkości DNA pUC Mix Marker 8 (Fermentas, Litwa). Oczekiwane długości produktów wynosiły dla PERV: 262 pz, dla
pGAPDH: 216 pz.
Analiza western-blot
Lizę komórek (ok. 5x106) prowadzono w 250μl lodowatego buforu RIPA (50mM Tris HCl pH=8, 150 mM
NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoksycholan sodu, 0.1% SDS)
z dodatkiem 1/100 objętości inhibitorów proteaz (Protease
Inhibition Cocktail, Sigma, Niemcy). Lizat komórkowy
wstrząsano na lodzie (1godz.) i wirowano przy 13000 x g
przez 15 min. Uzyskany nadsącz przenoszono do nowych
probówek i mierzono absorbancję (A595) w obecności odczynnika Bradforda. Krzywą kalibracyjną do określenia
stężenia całkowitego białka przygotowano na bazie próbek
albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o znanych stężeniach
(Fermentas, Litwa). Próbki badane w ilości odpowiadającej
30μg całkowitego białka nakładano na 10% żel poliakrylamidowy. Elektroforezę prowadzono w obecności markera wielkości białek PageRuler unstained protein ladder lub
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas, Litwa). Bezpośrednio po elektroforezie przeprowadzono elektrobloting celem przeniesienia próbek na membranę PVDF
(Pall Technology, USA). Membrany suszono w temperaturze pokojowej i przechowywano do dalszej analizy. Detekcję białek endogennych retrowirusów człowieka rodziny
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Ryc. 1. Produkt reakcji łańcuchowej polimerazy dla genu gag wirusa PERV. Kolejność próbek: 1). marker wielkości pUC Mix Marker
8 (Fermentas); 2). komórki HEK293; 3). komórki PK15; 4). komórki
HEK293 po 5 pasażach od zakażenia PERV; 5). komórki HEK293 po
10 pasażach od zakażenia PERV; 6). komórki HEK293 po 15 pasażach
od zakażenia PERV; 7). komórki HEK293 po 22 pasażach od zakażenia
PERV; 8). komórki HEK293/CIRCE.
przeciwko beta- aktynie). Inkubację prowadzono przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
Membrany przemywano dwukrotnie buforem
TTBS i inkubowano w roztworze zawierającym
przeciwciało wtórne skoniugowane z alkaliczną fosfatazą przez 1 godzinę (rozcieńczenie
1:3000, Santa Cruz Biotechnology, USA). Następnie membrany przemywano (2 x TTBS,
1 x TBS) i inkubowano w roztworze chromogennego substratu (TBT/BCIP) aż do uzyskania wyraźnego sygnału. Membrany suszono
w temperaturze pokojowej i skanowano za
pomocą skanera cyfrowego. Wszystkie próbki analizowano w trzech powtórzeniach. Analizę półilościową opartą na pomiarze gęstości
optycznej prążków dla syncytyny I i beta-aktyny przeprowadzono z użyciem programu komputerowego ImageJ [20].
Wyniki badań
Reakcja PCR gag PERV i pGAPDH
Specyficzny produkt PCR dla genu gag
PERV otrzymano w próbce DNA komórek
HEK293 pobranych w piątym pasażu od zakażenia wirusami PERV. Właściwe produkty dla gag
PERV otrzymano także w próbkach po każdym
kolejnym pasażu (6-22), natomiast nie uzyskano
ich w próbce komórek HEK293 niezakażonych
PERV ani w próbkach komórek pobranych z pasaży 1-4 po zakażeniu PERV. W żadnej z badanych próbek nie uzyskano produktu PCR dla
pGAPDH (Ryc. 1).
Ryc. 2. Obraz membrany PVDF po analizie western blot. Widoczna
ekspresja białka syncytyny I (A) oraz beta-aktyny (B) w próbkach komórek HEK293 zakażonych wirusami PERV. 0). komórki HEK293;
1). komórki HEK293 po 2 pasażach od zakażenia PERV; 2). komórki
HEK293 po 6 pasażach od zakażenia PERV; 3). komórki HEK293 po
12 pasażach od zakażenia PERV; 4). komórki HEK293 po 16 pasażach
od zakażenia PERV; 5). komórki HEK293/CIRCE; 6). lizat komórek łożyska (kontrola dodatnia); Masa cząsteczkowa białka sycytyny
I = ok. 60 kDa (częściowo glikolizowana), masa cząsteczkowa białka
beta- aktyny = 49 kDa.
HERV-W (syncytyny I) oraz detekcję beta-aktyny prowadzono z użyciem specyficznych, króliczych przeciwciał
poliklonalnych (Thermo Scientifics, USA, Abcam Corp.
USA). Przed inkubacją w roztworze przeciwciał membrany
nawilżano w 100% metanolu przez 2 min. i zanurzano w roztworze blokującym (3% roztwór żelatyny w TBS) na okres
1 godziny z jednoczesnym wytrząsaniem. Następnie membrany przemywano buforem TTBS (TBS + 0,05% Tween
20) i inkubowano w 1% roztworze żelatyny z odpowiednim
przeciwciałem (rozcieńczenie 1:500 dla przeciwciała przeciwko syncytynie I, rozcieńczenie 1:2000 dla przeciwciała
Ekspresja produktu białkowego genu env
HERV-W (syncytyny I) w komórkach HEK293 zakażonych PERV
Prążek właściwy dla sycytyny I otrzymano
we wszystkich badanych próbkach. Relatywną ekspresję syncytyny I w próbce obliczano
w odniesieniu do ekspresji beta- aktyny, białka
o charakterze konstytutywnym. Uzyskane wyniki przedstawiono na Ryc. 2 oraz Ryc. 3. Analiza wariancji wykazała, że pomiędzy badanymi
próbkami występuje bardzo istotna statystycznie
różnica (p<0,0001). Wyniki szczegółowej analizy statystycznej testem RIR Tukey’a przedstawiono w Tabeli I. Za istotne statystycznie uznano
p<0,05.
Dyskusja
Komórki linii embrionalnej nerki człowieka HEK293 są
standardowo wykorzystywane w badaniach nad infekcyjnością endogennych retrowirusów świni (PERV). Wynika to
stąd, że jako jedne z nielicznych linii komórkowych człowieka stosunkowo łatwo ulegają zakażeniu PERV in vitro
a ich infekcja ma charakter produktywny, tj. skutkuje wydzielaniem cząstek wirusowych [13]. Procedura zakażania
komórek HEK293 wirusami PERV pochodzącymi z komó-
&ARM0RZEGL.AUK
w licznych tkankach i liniach komórkowych. Niestety, szczegółowe badania opisane przez Yi i wsp.
(2004) wskazujące, że gen env HERV-W ulega
ekspresji w kilku badanych liniach komórkowych,
nie obejmują linii HEK293 [21]. Ekspresja env
HERV-W została natomiast potwierdzona w linii
U-31, która podobnie jak HEK293, została wyprowadzona z komórek nerki człowieka [21]. Z kolei
badania Nellaker i wsp. [22] wykazały obecność
transkryptów HERV-W również w linii HEK293.
Dowodzi to, że linia HEK293 jest obiektywnym
wyborem do analizy ekspresji genu env HERV-W.
W przedstawionym przez nas eksperymencie,
we wszystkich badanych próbkach komórek linii
HEK293 wykazano ekspresję białka syncytyny I.
Wstępna analiza wariancji wykazała, że pomiędzy
wszystkimi badanymi próbkami z linii HEK293
Ryc. 3. Relatywna ilość białka syncytyny I w odniesieniu do ilości
istnieją istotne statystycznie różnice w eksprebiałka beta-aktyny w próbkach linii HEK293 zakażonej wirusami
sji syncytyny I (p<0,0001). Z kolei szczegółowa
PERV po określonej liczbie pasaży komórkowych. Wartości dla poanaliza statystyczna przeprowadzona testem RIR
szczególnych próbek oznaczają stosunek pola powierzchni pod pikiem
Tukey’a wskazuje, że istotne różnice statystyczne
wykresu gęstości optycznej dla syncytyny I do pola powierzchni pod
w ekspresji syncytyny I występują nie tylko mięanalogicznym pikiem dla beta-aktyny.
dzy komórkami HEK293 niezakażonymi PERV
a komórkami zakażonymi, ale również pomiędzy
komórkami
pobranymi z poszczególnych pasaży po zakarek linii nerki świni PK-15 jest opisywana wielokrotnie w liżeniu
PERV
oraz z komórkami HEK293/CIRCE (Tabela I).
teraturze [18]. Prace te nie podają jednak wprost, po jakim
Największą
ilość
syncytyny I zaobserwowano w komórkach
czasie od momentu zakażenia sekwencje PERV były wykryHEK293
po
zakażeniu
PERV; niższa ekspresja występowawane w zakażanych komórkach techniką detekcji materiała
w
komórkach
niezakażonych,
natomiast bardzo niewielki
łu genetycznego (PCR lub RT-PCR w przypadku detekcji
stopień
ekspresji
syncytyny
I
miał
miejsce w komórkach
wirusowego RNA). Kuddus i wsp. w swoich badaniach za
HEK293/CIRCE.
Można,
zatem
wnioskować,
że obeczakażone i przeznaczone do dalszych analiz uznaje komórki
ność
PERV
w
komórkach
linii
HEK293
moduluje
dodatnio
HEK293 po 17 pasażu od zakażenia PERV [18]. W naszym
ekspresję
endogennych
retrowirusów
człowieka
z
rodziny
eksperymencie istotne było ustalenie, kiedy zintegrowane
HERV-W,
co
ma
miejsce
co
najmniej
w
czasie
kilkunastu
z genomem komórek HEK293 wirusy PERV są możliwe do
wykrycia techniką PCR, ponieważ obecność prowirusowego pasaży licząc od momentu zakażenia. Doniesienia dotyDNA świadczy jednoznacznie o zajściu zakażenia. W przy- czące możliwej transaktywacji retrowirusów przez inne
padku, gdy przedmiotem detekcji jest wirusowe RNA (ma- wirusy wskazują np., że białka regulatorowe, kodowane
teriał genetyczny wirusa) nie ma pewności, czy wykrywa przez herpeswirusy wpływają na ekspresję genów wirusa
się wirusy potomne czy są to PERV pozostałe w hodowli HIV-1 oraz endogennych retrowirusów człowieka z rodziny
po procedurze zakażania. Nasze badania wskazują, że pro- HERV-K i HERV-W [23]. Symulacje komputerowe opiewirusy PERV pojawiają się w komórkach HEK293 w ilo- rające się analizie licznych loci HERV-W w genomie człości pozwalającej na ich detekcję po 5 pasażu komórkowym wieka również wskazują, że transaktywacja tych elementów
licząc od momentu zakażenia. Jednak ilość uzyskanego może zachodzić za pomocą elementów niezależnych od
DNA gag PERV (intensywność prążka na żelu) wskazu- HERV [24]. Odnaleziono też prowirusowe sekwencje enje, że wyjściowa liczba cząsteczek prowirusów jest niższa dogennych retrowirusów człowieka (w licznych loci), któw porównaniu z próbkami kontrolnymi- linii PK15 oraz rych budowa wskazuje, że są to rekombinanty pomiędzy
trwale zakażonej linii HEK293/CIRCE (na rycinie 1. por. HERV-W a HERV-K. Zjawisko to jest dowodem, że w przeszłości HERV mogły wchodzić w interakcje z innymi ronr 4-7 z nr 3 i 8).
dzinami
retrowirusów [25]. Nie jest więc wykluczone, że
Dane literaturowe wskazują, że ekspresja endogennych
również
obecnie
sekwencje retrowirusowe pochodzące z zeretrowirusów człowieka z rodziny HERV-W ma miejsce
Tab. I. Analiza statystyczna testem RIR Tukey’a ekspresji białka syncytyny I w próbkach z linii HEK293 zakażonej wirusami
PERV po określonej liczbie pasaży komórkowych. Pokazano różnice istotne statystycznie; NS- nieistotne statystycznie
HEK293
HEK293/2
HEK293/6
HEK293/12
HEK293/16
HEK293/2
0,0002
HEK293/6
NS
0,00114
HEK293/12
NS
0,0019
NS
HEK293/16
0,031
0,0133
NS
NS
HEK293/CIRCE
NS
0,0002
0,0217
0,0121
0,00175
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
wnątrz mogą ulegać integracji w obrębie jednego z licznych
loci HERV-W i wpływać na jego ekspresję, co może tłumaczyć wyniki naszych badań. Należy jednak podkreślić, że
syncytyna I, przeciwko której skierowane były specyficzne
przeciwciała stosowane w badaniach jest prawdopodobnie
produktem tylko jednego z loci HERV-W, mianowicie w locus ERVWE-1 na chromosomie 7 [5]. Dlatego mało prawdopodobne wydaje się, żeby zmiana w ilości białka w próbkach po zakażeniu HEK293 wirusami PERV w stosunku do
próbek niezakażonych wynikała z aktywacji insercyjnej.
Może wynikać raczej ze zmiany w regulacji komórkowej,
tym bardziej, że i w warunkach fizjologicznych w łożysku ekspresja syncytyny I pozostaje pod kontrolą licznych elementów regulatorowych ulokowanych w promotorze 5’LTR [26]. Uzyskane w naszych eksperymentach
wyniki należałoby potwierdzić również analizą ekspresji
na poziomie mRNA, ponieważ takie badanie obejmowałoby liczne loci HERV-W env a nie tylko locus ERVWE
kodujący syncytynę I. Liczne prace dotyczące korelacji
pomiędzy HERV-W a wybranymi jednostkami chorobowymi, bazują na ocenie ilości transkryptów w badanych
próbkach a nie na ilości białka.
Ze względu na istotną rolę syncytyny I (w procesach fizjologicznych oraz w określonych stanach patologicznych)
należy przeanalizować, dlaczego ekspresja endogennych
retrowirusów człowieka w komórkach zakażonych PERV
ulega zmianie w stosunku do komórek niezakażonych. Analogiczne zjawisko może występować in vivo w przypadku
ksenotransplantacji, kiedy organizm byłby bezpośrednio
narażony na endogenne retrowirusy świni obecne w przeszczepianych narządach.
Wnioski
Wykazana różnica w ekspresji genu env HERV-W w komórkach HEK293 zakażonych PERV w stosunku do niezakażonych komórek HEK293 może sugerować, że:
1. Obecność elementów regulatorowych wirusów PERV,
zwłaszcza w rejonie długich powtórzeń końcowych
wpływa in trans na poziom ekspresji syncytyny I.
2. Infekcja PERV wpływa na procesy fizjologiczne komórki, co skutkuje zmianą ekspresji syncytyny I.
Praca finansowana w ramach umów badawczych
nr KNW-2-078/09 oraz KNW-6-372/09
Piśmiennictwo
1. Zwolińska K. Sekwencje pochodzenia retrowirusowego
w genomie człowieka. Ludzkie endogenne retrowirusy
(HERV). Postepy Hig Med Dosw (online) 2006; 60:
637-652.
2. Mura M i wsp. Late viral interference induced by transdominant Gag of an endogenous retrovirus. PNAS,
2004; 101: 11117-11122.
3. Griffiths DJ. Endogenous retroviruses and the human
genome sequence. Gen Biol 2001; 2: 1017.1-1017.5
4. Gifford R, Tristem M. The evolution and diversity
of endogenous retroviruses. Virus Genes 2003; 26:
291-315.
5. Voisset C i wsp. Chromosomal distribution and coding
capacity of the human endogenous retrovirus HERV
-W family. AIDS Res Hum Retrov 2000; 16: 731-740
6. Wang-Johanning F i wsp. Quantitation of HERV-K env
gene expression and splicing in human breast cancer.
Oncogene 2003; 22: 1528-1535.
7. Antony JM i wsp. Quantitative analysis of human endogenous retrovirus- W env in neuroinflammatory diseases. AIDS Res Hum Retrov 2006; 22: 1253-1259.
8. Perl A i wsp. Endogenous retroviral pathogenesis in lupus. Curr Opin Rheumatol 2010; 22: 483-492.
9. Perron H i wsp. Endogenous retrovirus type W GAG
and envelope protein antigenemia in serum of schizophrenic patients. Biol Psychiat 2008; 64: 1019-1023.
10. Frendo JL i wsp. Direct involvement of HERV-W Env
glycoprotein in human trophoblast cell fusion and differentiation. Mol Cell Biol 2003; 23: 3566-3574.
11. Ponferrada VG, Mauck BS, Wooley DP. The envelope
glycoprotein of human endogenous retrovirus HERV
-W induces cellular resistance to spleen necrosis virus.
Arch Virol 2003; 148: 659-675.
12. LeTissier P, Stoye JP. Two sets of human-tropic pig retrovirus. Nature 1997; 389: 681-682.
13. Wilson CA i wsp. Extended analysis of the in vitro tropism of porcine endogenous retrovirus. J Virol 2000;
74: 49–56.
14. Harrison I i wsp. Determinants of high titer in recombinant porcine endogenous retroviruses. J Virol 2004; 78:
13871-13879.
15. Purcell DF i wsp. An array of murine leukemia virus related elements is transmitted and expressed in a primate
recipient of a retroviral gene transfer. Virology 1996;
70: 887-897.
16. Suling K i wsp. Packaging of human endogenous retrovirus sequences is undetectable in porcine endogenous
retrovirus particles produced from human cells. Virology 2003; 312: 330-336.
17. Bannert N, Kurth R. Retroelements and the human genome: new perspectives on an old relation. Proc Natl
Acad Sci USA 2004; 101 (Supl. 2): 14572-14579.
18. Kuddus R i wsp. Some morphological, growth and genomic properties of human cells chronically infected
with porcine endogenous retrovirus (PERV). Genome
2003; 46: 858-869.
19. Paradis K i wsp. Search for cross-species transmission
of porcine endogenous retrovirus in patients treated with
living pig tissue. Science 1999; 285: 1236-1241.
20. Abramoff MD, Magelhaes PJ, Ram SJ. Image Processing with ImageJ.Biophoto-nics Int 2004; 11: 36-42.
21. Yi J-M, Kim H-M, Kim H-S. Expression of the human endogenous retrovirus HERV-W family in various
human tissues and cancer cells. J Gen Virol 2004; 85:
1203-1210.
22. Nellaker C i wsp. Transactivation of elements in the human endogenous retrovirus W family by viral infection.
Retrovirology 2006; 3: 44.
23. Lee WJ i wsp. Activation of the human endogenous retrovirus W long terminal repeat by herpes simplex virus
type 1 immediate early protein 1. Mol Cells 2003; 15:
75–80.
&ARM0RZEGL.AUK
24. Belshaw R i wsp. High copy number in human endogenous retrovirus families is associated with copying
mechanisms in addition to reinfection. Mol Biol Evol
2005; 22: 814-817.
25. Flockerzi A i wsp. Human endogenous retrovirus HERV-K14 families: status, variants, evolution and mobilization of other cellular sequences. J Virol 2005; 79:
2941-2949.
data otrzymania pracy: 28.09.2010r.
data akceptacji do druku: 19.10.2010r.
Adres do korespondencji:
Grzegorz Machnik
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
Tel: +48 32 364 10 25
e-mail: [email protected]
26. Cheng YH i wsp. Isolation and characterization of the
human syncytin gene promoter. Biol Reprod 2004; 70:
694-701.