Przeznaczenie

Transkrypt

Przeznaczenie

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
HIM
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
Informacje dotyczące
zamówienia
HIM
COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR Test, version 1.5
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
WB
48 Tests P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
500 Tests P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
Przeznaczenie
COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) jest to test
amplifikacji kwasu nukleinowego in vitro służący do oznaczenia ilościowego
RNA ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (Human Immunodeficiency
Virus Type 1, HIV-1) w ludzkim osoczu za pomocą analizatora COBAS®
AMPLICOR®. Test umożliwia oznaczenie ilościowe HIV-1 RNA w zakresie
50-750 000 kopii/ml, wykorzystując połączenie dwóch procedur przygotowania
próbki, standardowej oraz ultraczułej.
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, nie jest przeznaczony do
stosowania jako test przesiewowy krwi lub produktów krwiopochodnych na
obecność HIV-1. Nie jest również przeznaczony do stosowania jako test
diagnostyczny potwierdzający obecność zakażenia HIV-1.
6/2007, Revision 6.0
COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5
1/52
P/N: 04497821 190
Test jest przeznaczony do zastosowania w postępowaniu klinicznym u pacjentów
zakażonych HIV-1, z uwzględnieniem stanu klinicznego oraz innych
wskaźników laboratoryjnych progresji choroby. Test może służyć do oceny
rokowania w oparciu o pomiar początkowego poziomu HIV-1 RNA; może także
służyć do monitorowania leczenia przeciwretrowirusowego w oparciu o pomiar
zmian poziomu HIV-1 RNA w osoczu podczas trwania tego leczenia. Poziomy
HIV-1 RNA, oznaczane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (Polymerase
Chain Reaction, PCR), wykorzystano jako jeden z zastępczych wskaźników
w przyspieszonym procesie weryfikacji prowadzonym przez FDA następujących
leków: inhibitorów proteazy – INVIRASE (metanosulfonian sakwinawiru),
CRIXIVAN® (sulfonian indinawiru), NORVIR® (ritonawir) i FORTOVASE
(sakwinawir); nienukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy –
VIRAMUNE® (newirapina), SUSTIVA® (efavirenz) i ZIAGEN® (abakawir); oraz
inhibitorów odwrotnej transkryptazy – EPIVIR® (lamiwudyna).
Podsumowanie i objaśnienie testu
Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest czynnikiem etiologicznym zespołu
nabytego niedoboru odporności (Acquired Immunodeficiency Syndrome,
AIDS)1-3. Zakażenie HIV może być przenoszone drogą kontaktu płciowego,
narażenia na zakażoną krew lub produkty krwiopochodne albo z zakażonej matki
na płód4. W ciągu trzech do sześciu tygodni od narażenia na HIV, ogólnie u osób
zakażony występuje krótki, ostry zespół charakteryzujący się objawami
grypopodobnymi, któremu towarzyszy duża wiremia we krwi obwodowej5-8.
Później u większości zakażonych osób występuje swoista dla HIV odpowiedź
immunologiczna oraz zmniejszenia wiremii w osoczu; ma to zazwyczaj miejsce
od czterech do sześciu tygodniu od początku objawów9,10. Po serokonwersji
zakażone osoby wchodzą zazwyczaj w fazę o stabilnym przebiegu klinicznym,
bezobjawową, która może trwać wiele lat11-13. Okres bezobjawowy
charakteryzuje się utrwaloną niewielką wiremią w osoczu14 oraz stopniowym
zanikaniem limfocytów T CD4+, co prowadzi do ciężkiego niedoboru odporności,
mnogich zakażeń oportunistycznych, nowotworów złośliwych i zgonu15.
Pomimo, że poziomy wiremii w fazie bezobjawowej zakażenia we krwi
obwodowej są stosunkowo małe, to replikacja wirusa i jego usuwanie wydają się
być procesem dynamicznym, w którym duża produkcja wirusa i zakażanie
komórek CD4+ jest równoważone przez odpowiednio nasilone usuwanie wirusa,
śmierć zakażonych komórek i uzupełnianie komórek CD4+. Powoduje to, że
poziomy wiremii i komórek CD4+ w osoczu są względnie stałe16-18.
Za pomocą pomiarów ilościowych wiremii HIV we krwi obwodowej wykazano,
że większe poziomy wirusa mogą wiązać się ze zwiększonym ryzykiem progresji
klinicznej choroby wywoływanej przez HIV. Ponadto wykazano, że zmniejszenie
poziomów wirusa w osoczu może wiązać się ze zmniejszonym ryzykiem progresji
klinicznej19-21. Poziomy wirusa we krwi obwodowej można oznaczyć ilościowo
mierząc antygen p24 HIV w surowicy, prowadząc ilościową hodowlę HIV
z osocza lub bezpośrednio oceniając zawartość wirusowego RNA w osoczu za
pomocą amplifikacji kwasu nukleinowego lub technologii amplifikacji
sygnału22-26.
Antygen p24 jest głównym białkiem rdzeniowym wirusa HIV i znajduje się
w surowicy w postaci wolnej lub związanej z przeciwciałem przeciwko p24.
Wolny antygen p24 można mierzyć za pomocą dostępnych w handlu badań
immunoenzymatycznych (EIA). Niemniej jednak przydatność antygenu p24 jako
markera obciążenia organizmu wirusem jest ograniczona, ponieważ może być on
wykryty tylko u 20% bezobjawowych pacjentów i 40-50% pacjentów z objawami.
Postępowanie zmierzające do rozbicia kompleksów antygen-przeciwciało
poprawia czułość badań mierzących poziom antygen p24, ale białko wirusa nadal
nie jest wykrywane u większości bezobjawowych pacjentów22.
HIV w osoczu można hodować inokulując nim pobudzone komórki jednojądrowe
krwi obwodowej (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) pochodzące od
zdrowych dawców. Oznaczenie ilościowe uzyskuje się inokulując PBMC za
pomocą seryjnych rozcieńczeń próbki osocza. Hodowla ilościowa ma
ograniczoną użyteczność w monitorowaniu poziomów wirusa u osób
zakażonych, ponieważ jedynie niewielka frakcja cząstek wirusa jest zakaźna
w warunkach in vitro. Zakaźny wirus jest często niewykrywalny u osób bez
objawów22.
HIV RNA w osoczu można oznaczyć ilościowo za pomocą technologii
amplifikacji kwasu nukleinowego, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy
(PCR)27-29. Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, wykorzystuje
technologię PCR w celu osiągnięcia maksymalnej czułości oraz dynamicznego
zakresu ilościowego detekcji HIV-1 RNA w osoczu zawierającym dodatek
antykoagulantów (EDTA lub ACD)24.
2/52
HIV-1 MONITOR
Zasady procedury
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR , v1.5, opiera się na pięciu
głównych procesach: przygotowanie próbki; odwrotna transkrypcja docelowego
RNA w celu utworzenia komplementarnego DNA (cDNA)30; amplifikacja PCR30
docelowego cDNA z wykorzystaniem primerów swoistych dla HIV-1;
hybrydyzacja zamplifikowanego produktu z sondami oligonukleotydowymi
swoistymi dla celu (celów); oraz wykrycie związanych z sondami
zamplifikowanych produktów za pomocą kolorymetrii.
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, umożliwia równoczesne
przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji oraz amplifikacji PCR docelowego
HIV-1 oraz HIV-1 Quantitation Standard RNA. Mieszanina główna (Master Mix)
zawiera parę primerów swoistych zarówno dla HIV-1 RNA jak i dla HIV-1
Quantitation Standard RNA. Opracowano ją w celu zapewnienia równoważnego
oznaczenia ilościowego podtypów HIV-1 grupy M. Nie ustalono charakterystyki
działania testu dla próbek grupy O.
Oznaczenie ilościowe HIV-1 wirusowego RNA przeprowadza się za pomocą
HIV-1 Quantitation Standard. HIV-1 Quantitation Standard to niezakaźny
transkrypt RNA zawierający identyczne miejsca wiązania odcinków primerowych
z posiadanymi przez docelowy HIV-1 RNA, oraz charakterystyczne miejsce
wiązania sondy, które umożliwia zróżnicowanie amplikonu Quantitation Standard
od amplikonu HIV-1. HIV-1 Quantitation Standard wchodzi w skład każdej
próbki; znana jest liczba jego kopii; razem z docelowym HIV-1 jest
przeprowadzany przez proces przygotowania próbki, odwrotną transkrypcję,
amplifikację PCR, hybrydyzację i detekcję, a także jest amplifikowany. Analizator
COBAS® AMPLICOR® oblicza poziomy HIV-1 RNA w badanych próbkach,
porównując sygnał HIV-1 z sygnałem Quantitation Standard dla każdej próbki.
Quantitation Standard rekompensuje wpływ hamowania oraz kontroluje proces
amplifikacji, aby umożliwić dokładne oznaczenie ilościowe HIV-1 RNA w każdej
próbce.
Przygotowanie próbki
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, może być stosowany
z dwiema procedurami przygotowania próbki, procedurą standardową oraz
procedurą ultraczułą. W standardowej procedurze przygotowania próbki HIV-1
RNA izoluje się z bezpośrednio z osocza poprzez lizę cząsteczek wirusa przy
użyciu czynnika chaotropowego, a następnie strącenie RNA z alkoholem. W
ultraczułej procedurze przygotowania próbki cząsteczki wirusa HIV-1 w osoczu są
w pierwszym etapie koncentrowane za pomocą wirówki o dużej prędkości,
a następnie poddawane lizie przy użyciu czynnika chaotropowego, po której ma
miejsce strącenie HIV-1 RNA z alkoholem. Znana liczba cząsteczek Quantitation
Standard RNA jest wprowadzana do każdej próbki z odczynnikiem lizującym.
HIV-1 Quantitation Standard przeprowadza się przez etapy przygotowania próbki,
odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i detekcji oraz wykorzystuje się do ilościowego
oznaczenia HIV-1 RNA w badanej próbce.
3/52
Odwrotna transkrypcja
i amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
Wybór docelowej sekwencji RNA dla HIV-1 zależy od identyfikacji regionów
w obrębie genomu HIV-1, które wykazują największy konserwatyzm sekwencji.
Zgodnie z tym, właściwy wybór odcinków primerowych oraz sondy ma kluczowe
znaczenie dla zdolności testu do detekcji genotypu HIV-1. Test COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, wykorzystuje primery SK145 i SKCC1B
w celu określenia sekwencji 155 nukleotydów w obrębie bardzo
konserwatywnego regionu genu gag HIV-131. Region gag koduje antygeny
charakterystyczne dla grupy oraz białka strukturalne rdzenia wirionu. Ogólnie
geny gag HIV-1 posiadają około 1500 nukleotydów i znajdują się w przybliżeniu
w pozycjach 789-2290 genomu HIV. Sekwencja nukleotydów odcinków
primerowych została zoptymalizowana w taki sposób, aby zapewnić równoważną
amplifikację podtypów grupy M HIV-1.
Odwrotna transkrypcja
Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR wykonywane są przy użyciu
termostabilnego, rekombinowanego enzymu – Thermus thermophilus polimeraza
DNA (rTth pol). W obecności manganu i w odpowiednich warunkach układu
buforowego, rTth pol wykazuje aktywność zarówno odwrotnej transkryptazy, jak
i polimerazy DNA30. Pozwala to na zachodzenie reakcji odwrotnej transkrypcji
i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej.
Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do
amplifikacji (A-tubes), w których zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak
i amplifikacja PCR. Primer inicjujący transkrypcję nici sensownej, określany jako
primer antysensowny (SKCC1B) oraz primer inicjujący transkrypcję nici
antysensownej, określany jako primer sensowny (SK145) są biotynylowane na
końcach 5'. Mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby umożliwić primerowi
antysensownemu swoiste wtopienie do docelowego HIV-1 RNA oraz do HIV-1
Quantitation Standard RNA. W obecności Mn2+ oraz nadmiaru trójfosforanów
deoksynukleozydu (deoxynucleoside triphosphates, dNTPs), w tym trójfosforanów
deoksyadenozyny, deoksyguanozyny, deoksycytydyny oraz deoksytymidyny, rTth
pol wydłuża wtopiony primer, budując nić DNA (cDNA) komplementarną do
docelowego RNA.
Amplifikacja odcinka docelowego
Po odwrotnej transkrypcji docelowego HIV-1 RNA oraz HIV-1 Quantitation
Standard RNA, mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby doszło do denaturacji
hybrydy RNA:cDNA oraz odsłonięcia docelowych sekwencji dla primera. Po
ochłodzeniu mieszaniny i swoistym wtopieniu primera sensownego (SK145)
z nicią cDNA, rTth pol wydłuża primer syntetyzując drugą nić DNA. W ten
sposób kończy się pierwszy cykl PCR. W jego wyniku powstała dwuniciowa
kopia DNA regionu docelowego HIV-1 RNA oraz HIV-1 Quantitation Standard
RNA. Mieszanina reakcyjna podgrzewana jest po raz kolejny, w celu rozdzielenia
powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych dla
primerów. W miarę stygnięcia mieszaniny, primery SK145 i SKCC1B
przyłączają się do docelowego DNA. rTth pol w obecności Mn2+ oraz nadmiaru
dNTPs wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowych wzorców, w celu
wytworzenia cząsteczki dwuniciowego DNA, zawierającej 155 par zasad,
nazwanej amplikonem. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie
powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich
skutecznie podwajając ilość DNA amplikonu. Amplifikacja zachodzi wyłącznie
w regionie genomu HIV-1, który znajduje się pomiędzy dwoma primerami; cały
genom HIV-1 nie jest amplifikowany.
4/52
HIV-1 MONITOR
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikacja wybiórcza docelowego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej
zachodzi w teście COBAS® AMPLICOR® HIV-1, v1.5, dzięki zastosowaniu
enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozydaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny
(dUTP). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje zniszczenie nici DNA
zawierających dezoksyurydynę32, nie wpływając na DNA zawierający
dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się
dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, z uwagi na
stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów
dezoksynukleozydu (dNTPs) w odczynniku Master Mix; dlatego też
dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon.
Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na
rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym
AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozszczepienie DNA
zawierającego dezoksyurydynę przy resztach dezoksyurydynowych na drodze
otwarcia łańcucha w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu
termicznym w pH zasadowym odczynnika Master Mix, łańcuch amplikonu DNA
pęka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację
DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55°C, tj.
w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu
docelowego.
Po amplifikacji każdy resztkowy enzym jest denaturowany poprzez dodanie roztworu
denaturacyjnego. W ten sposób zapobiega się degradacji dowolnego amplikonu
docelowego. Wykazano, że enzym AmpErase w teście COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5 inaktywuje co najmniej 103 kopii amplikonu HIV-1
zawierającego dezoksyurydynę w przeliczeniu na jedną reakcję PCR.
Reakcja hybrydyzacji
Po amplifikacji PCR analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie dodaje
roztwór denaturacyjny do probówek amplifikacyjnych (A-tubes) w celu chemicznej
denaturacji amplikonu HIV-1 oraz HIV-1 Quantitation Standard i uzyskania
jednoniciowego DNA. W celu uzyskania wyników ilościowych obejmujących duży
zakres dynamiczny, analizator COBAS® AMPLICOR® seryjnie rozcieńcza
zdenaturowany amplikon w naczyńkach używanych do detekcji (D-cups). Do
każdego z czterech rozcieńczeń amplikonu HIV-1 lub do każdego z dwóch
rozcieńczeń amplikonu HIV-1 Quantitation Standard dodaje się zawiesinę
cząsteczek magnetycznych opłaszczonych sondą oligonukleotydową swoistą dla,
odpowiednio, amplikonu HIV-1 (SK102) lub amplikonu HIV-1 Quantitation
Standard (CP35). Amplikony znakowane biotyną ulegają hybrydyzacji ze
swoistymi dla materiału docelowego sondami oligonukleotydowymi związanymi
z cząsteczkami magnetycznymi. Każde oznaczenie ilościowe wymaga czterech
niezależnych pomiarów absorbancji odczynników, wykorzystujących zawiesinę
sondy HIV-1, oraz dwóch pomiarów absorbancji wykorzystujących zawiesinę
sondy HIV-1 Quantitation Standard.
Reakcja detekcji
Po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS® AMPLICOR® przemywa cząsteczki
magnetyczne w pojemnikach D-cup w celu usunięcia niezwiązanego materiału,
a następnie dodaje kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa. Kompleks awidynaperoksydaza chrzanowa wiąże się ze znakowanymi biotyną amplikonami, które
uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla materiału docelowego sondami
oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator
COBAS® AMPLICOR® usuwa niezwiązany koniugat przez wypłukanie cząsteczek
magnetycznych, a następnie dodaje do każdego pojemnika D-cup roztwór substratu,
zawierający nadtlenek wodoru i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB). W obecności
nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami katalizuje
utlenianie TMB tworząc barwny kompleks. Analizator COBAS® AMPLICOR®
mierzy wartość absorbancji tego kompleksu przy długości fali 660 nm.
5/52
Oznaczenie ilościowe HIV-1 RNA
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, ilościowo oznacza
wirusowy RNA HIV-1, wykorzystując drugą sekwencję docelową (HIV-1
Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do badanej próbki.
HIV-1 Quantitation Standard to niezakaźna cząsteczka RNA składająca się z 233
transkrybowanych in vitro nukleotydów, której miejsca wiązania primera są
identyczne ze znajdującymi się w docelowej sekwencji HIV-1. HIV-1
Quantitation Standard zawiera miejsca wiązania primerów SK145 i SKCC1B
oraz wytwarza produkt amplifikacji o tej samej długości (155 zasad) i składzie
zasad, jak docelowy HIV-1 RNA. Miejsce wiązania sondy amplikonu HIV-1
Quantitation Standard zostało zmodyfikowane w celu różnicowania amplikonu
HIV-1 Quantitation Standard i amplikonu docelowego HIV-1.
W liniowym zakresie testu, pochłanianie dla długości fali wynoszącej 660 nm
(A660) dla każdego pojemnika D-cup jest proporcjonalne do ilości amplikonów
HIV-1 lub HIV-1 Quantitation Standard w pojemniku D-cup. Analizator COBAS®
AMPLICOR® oblicza całkowita absorbancja HIV-1 i HIV-1 Quantitation Standard
mnożąc pochłanianie pojemnika D-cup przez współczynnik rozcieńczenia
amplikonu dla tego pojemnika, a następnie wybiera pojemnik o maksymalnym
całkowitym pochłanianiu. Obliczona całkowita absorbancja jest proporcjonalna do
ilości HIV-1 RNA lub HIV-1 Quantitation Standard RNA obecnej w każdej reakcji
odwrotnej transkrypcji/amplifikacji PCR. Ilość HIV-1 RNA w każdej próbce
oblicza się ze współczynnika całkowitego absorbancji HIV-1 i całkowitego
absorbancji HIV-1 Quantitation Standard, oraz wprowadzonej liczby cząsteczek
HIV-1 Quantitation Standard RNA, za pomocą następującego równania:
HIV-1 A
[Total
Total QS A ]
AF
gdzie:
6/52
x Input HIV-1 QS kopie/PCR x Sample Volume Factor = HIV-1 RNA kopie/ml
Total HIV-1 A = obliczona całkowita absorbancja dla amplikonu HIV-1
Total QS A = obliczona całkowita absorbancja dla amplikonu
Quantitation Standard
Input HIV-1 QS copies/PCR = liczba kopii Quantitation Standard w każdej reakcji;
liczba ta jest swoista dla serii
Sample Volume Factor = współczynnik konwersji jednostek: kopie/PCR do
kopii/ml
AF = współczynnik dostosowania do standaryzacji wyników
testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5
do wyników testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5
(współczynnik dostosowania = 1,11)
Sample Volume Factor = 40 (dla standardowej procedury przygotowania próbki)
Sample Volume Factor = 4 (dla ultraczułej procedury przygotowania próbki)
HIV-1 MONITOR
Odczynniki
HIM
COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
Odczynniki do przygotowania
próbki
48 testów P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
HIM PREP
4 x 9,0 ml
HIV-1 LYS
(HIV-1 MONITOR odczynnik lizujący)
Bufor Tris-HCl
68% tiocyjanian guanidyny
3% ditiotreitol
< 1% glikogen
68% (udział wagowy) tiocyjanian guanidyny
+
Xn
Produkt szkodliwy
HIV-1 QS, v1.5
4 x 0,1 ml
(HIV-1 MONITOR standard oznaczania, wersja 1,5)
< 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA
(pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje wiążące
primery HIV-1 oraz unikalny obszar wiążący sondę
< 0,005% Poly rA RNA (syntetyczny)
EDTA
0,05% azydek sodu
HIV-1 DIL
(HIV-1 MONITOR rozcieńczalnik próbki)
Bufor Tris-HCl
EDTA
0,05% azydek sodu
Odczynniki kontroli
4 x 4,8 ml
HIM CTL
NHP
4 x 1,6 ml
[Osocze ujemne (ludzkie)]
Ludzkie osocze , niereaktywne w testach (licencjonowanych
w USA przez FDA) dla przeciwciała przeciwko HCV, przeciwciała
przeciwko HIV-1/2, antygenu p24 HIV oraz HBsAg; brak
wykrycia HIV-1 RNA, HCV RNA lub HBV DNA za pomocą
PCR w zmieszanych jednostkach od wielu dawców; brak
wykrycia przeciwciała przeciwko rdzeniowi HBV
w zmieszanych jednostkach od wielu dawców za
pomocą testów licencjonowanych przez FDA.
0,1% Substancja konserwująca ProClin® 300
HIV-1 (–) C
[HIV-1 (–) Kontrola]
EDTA
0,05% azydek sodu
4 x 0,05 ml
7/52
HIV-1 L(+)C
4 x 0,05 ml
[HIV-1 MONITOR Low (+) Kontrola]
(pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje HIV-1
EDTA
0,05% azydek sodu
HIV-1 H(+)C
4 x 0,05 ml
[HIV-1 MONITOR High (+) Kontrola]
(pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje HIV-1
EDTA
0,05% azydek sodu
Odczynniki do amplifikacji
HIM AMP
HIV-1 MMX, v1.5
4 x 0,7 ml
(HIV-1 MONITOR Master Mix, wersja 1.5)
Bufor bicynowy
Glicerol
< 0,01% rTth polimeraza DNA (rTth pol, bakteryjna)
Octan potasu
< 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
< 0,001% primery SKCC1B i SK145, biotynylowane
< 0,01% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) (bakteryjna)
0,05% azydek sodu
HIV-1 Mn2+, v1.5
(HIV-1 MONITOR roztwór manganu, wersja 1.5)
< 2% mangan
Kwas octowy
Barwnik amarantowy
0,05% azydek sodu
Odczynniki do swoistej
reakcji detekcji
4 x 0,1 ml
HIM DK
2 x 75 testów
AD3
(Odczynnik do rozcieńczenia amplikonu)
EDTA
0,8% wodorotlenek sodu
0,8% (udział wagowy) wodorotlenek sodu
+
Xi
Produkt drażniący
IM PS1, v1.5
2 x 100 testów
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 1, wersja 1.5)
Bufor MES
< 0,01% zawiesina Dynabeads® (cząsteczkek paramagnetycznych)
opłaszczonych oligonukleotydową sondą swoistą dla HIV-1 (SK102)
0,09% azydek sodu
8/52
HIV-1 MONITOR
IM4, v1.5
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 2, wersja 1.5)
Bufor fosforanowy
< 0,2% detergent
24,9% tiocyjanian sodu
2 x 100 testów
IQ PS1, v1.5
1 x 100 testów
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 1
standardu oznaczania, wersja 1.5)
Bufor MES
< 0,01% zawiesina Dynabeads (cząsteczkek paramagnetycznych)
opłaszczonych oligonukleotydową sondą swoistą dla
HIV-1 Quantitation Standard (CP35)
0,09% azydek sodu
IQ4, v1.5
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 2
standardu oznaczania, wersja 1.5)
Bufor fosforanowy
< 0,2% detergent
24,9% tiocyjanian sodu
Odczynniki do nieswoistej
reakcji detekcji
DK
DN4
(Roztwór denaturacyjny)
1,6% wodorotlenek sodu
EDTA
Błękit tymolowy
1 x 100 testów
1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu
+
Xi
1 x 100 testów
Produkt drażniący
CN4
3 x 100 testów
(Kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa)
Bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej
Albumina wołowa (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenol
1% Substancja konserwująca ProClin® 150
SB3
(Substrat A)
Roztwór soli kwasu cytrynowego
0,01% nadtlenek wodoru
5 x 75 testów
9/52
SB
(Substrat B)
0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)
40% dimetyloformamid (DMF)
T
5 x 5 ml
40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF)
Produkt toksyczny
R: 61-20/21-36
Może działać szkodliwie na dziecko w łonie
matki. Działa szkodliwie przez drogi
oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa
drażniąco na oczy.
S: 53-45
Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać
się z instrukcją. W przypadku awarii lub jeżeli
źle się poczujesz, niezwłocznie zasięgnij
porady lekarza - jeżeli to możliwe, pokaż
etykietę.
COBAS® AMPLICOR®
WB
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® bufor płuczący
500 testów P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X – koncentrat płuczący)
< 2% bufor fosforanowy
< 9% chlorek sodu
EDTA
< 2% detergent
2 x 250 testów
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Test ten jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z ludzkim osoczem pobranym do
EDTA lub ACD (antykoagulanty). Wykazano, że heparyna hamuje PCR i nie wolno
jej stosować w tej procedurze.
Nie pipetować ustami.
Nie jeść, nie pić oraz nie palić w laboratorium, w obszarach roboczych. Przy
obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe
rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć
ręce po obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami testowymi.
Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek, unikać skażenia
bakteryjnego odczynników lub ich zanieczyszczenia rybonukleazą. Zaleca się
używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od RNazy.
Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii lub różnych butelek tej samej
serii.
Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi,
federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
Nie używać zestawu po upływie daty przydatności.
Regionalne biuro Roche na życzenie może dostarczyć informacje o bezpieczeństwie
materiałów (Material Safety Data Sheets, MSDS).
10/52
HIV-1 MONITOR
Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem
w obszarze „przedamplifikacyjnym” i z jednokierunkowym ruchem w stronę obszaru
„poamplifikacyjnego” (amplifikacji/detekcji). Czynności wykonywane przed
amplifikacją muszą rozpoczynać się od przygotowania odczynników, następnie zaś
należy przygotowywać próbki. Materiały i urządzenia muszą być przypisane do każdej
z czynności przedamplifikacyjnych i nie wolno ich używać do żadnych innych
czynności lub przenosić pomiędzy obszarami. W każdym z obszarów należy używać
rękawic; rękawice muszą być zmieniane przed opuszczeniem każdego z obszarów.
Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być
używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub
pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego
DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą
pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Z próbkami należy obchodzić się tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując
laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumencie Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories33 oraz w CLSI Document
M29-A334. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo
przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub
destylowanej.
Uwaga
Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn
sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10
przyniesie 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
UWAGA: Niniejszy zestaw zawiera składnik (NHP) otrzymany z ludzkiej krwi.
Materiał źródłowy badano przy użyciu testów zatwierdzonych przez US FDA
i stwierdzono, że jest on niereaktywny pod względem obecności przeciwciał
przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu
powierzchniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Ponadto badano
zmieszane jednostki od wielu dawców; nie wykryto HIV-1 RNA, HCV RNA i HBV
DNA za pomocą PCR oraz nie wykryto przeciwciała przeciwko rdzeniowi HBV za
pomocą licencjowanego przez FDA testu. Żadna ze znanych metod badania nie
może zaoferować całkowitej pewności, że produkty otrzymane z ludzkiej krwi nie
będą przenosić czynników zakaźnych. Dlatego też wszelkie materiały pochodzenia
ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Z NHP należy obchodzić się
jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne takie jak
procedury wymienione w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories33 oraz w dokumencie CLSI M29-A334. Należy dokładnie czyścić
i dezynfekować wszystkie powierzchnie robocze przy użyciu 0,5% roztworu
podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn2+, v1.5; HIV-1 (–) C;
HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 i IQ PS1, v1.5 zawierają azydek sodu.
Azydek sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi
wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali.
Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy
spłukać rury dużą objętością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
Należy nosić okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne oraz jednorazowe
rękawiczki podczas obchodzenia się z HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4;
AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB i substratem roboczym
(zmieszanymi odczynnikami SB3 i SB). Unikać kontaktu wymienionych
materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu,
natychmiast spłukać dużą objętością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte
odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania powyższych
odczynników przed wytarciem plam należy rozcieńczyć je wodą.
Unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z SB lub substratem roboczym. Jeżeli
dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą objętością wody.
11/52
Dimetyloformamid zawarty w SB i substracie roboczym może działać szkodliwe
na płód w łonie matki; opisywano ponadto działania toksyczne po doustnym
przyjęciu dużych dawek. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania oparów
oraz spożycia. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, dokładnie spłukać za pomocą
mydła i wody oraz natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną.
Nie wolno dopuścić, aby HIV-1 LYS, który zawiera tiocyjanian guanidyny, lub
IM4, v1.5 i IQ4, v1.5, które zawierają tiocyjanian sodu, nawiązały kontakt
z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Mieszaniny takie mogą
spowodować powstanie silnie toksycznego gazu.
Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym
korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek.
Nie należy używać probówek z korkami zatrzaskowymi.
Wymagania dotyczące przechowywania i użytkowania
Nie zamrażać odczynników.
Przechowywać HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 oraz HIV-1 DIL w temperaturze
2-8°C. Nieotwarte odczynniki zachowują stabilność do podanej daty ważności.
Po otwarciu nieużytą część należy wyrzucić.
Podczas przechowywania HIV-1 LYS w temperaturze 2-8°C powstaje osad.
Przed użyciem należy rozpuścić osad, ogrzewając HIV-1 LYS do 25-37°C.
Ogrzewanie HIV-1 LYS kontynuować przez maksymalnie 30 minut, a następnie
dokładnie wymieszać, aż kryształy ulegną rozpuszczeniu. Przed użyciem należy
zbadać każdą butelkę HIV-1 LYS, obserwując ją na białym tle, poszukując
śladu żółtego koloru lub cech wyciekania. Jeżeli stwierdzono jakikolwiek ślad
żółtego koloru lub obecność wycieku, nie używać danej butelki do badania.
Należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu
wymiany. Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy
wyrzucić. Roboczy odczynnik lizujący (przygotowany poprzez dodanie HIV-1
QS, v1.5 do HIV-1 LYS) musi być przechowywany w temperaturze pokojowej
i zużyty w ciągu 4 godzin od przygotowania.
HIV-1 MMX, v1.5 i HIV-1 Mn2+, v1.5 przechowywać w temperaturze 2-8°C.
Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. Po otwarciu
opakowania pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. Roboczy
odczynnik Master Mix (przygotowany przez dodanie HIV-1 Mn2+, v1.5 do HIV-1
MMX, v1.5) musi być przechowywany w temperaturze 2-8°C i jest stabilny przez
4 godziny w temperaturze 2-8°C.
NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C przechowywać w temperaturze
2-8°C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. Po
otwarciu opakowania pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić.
AD3 przechowywać w temperaturze 2-25°C. Po załadowaniu do analizatora
COBAS® AMPLICOR®, AD3 jest stabilny przez 30 dni w temperaturze 2-8°C
lub do upływu daty ważności. AD3 stosować można maksymalnie w ciągu
4 cykli pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami
należy przechowywać go w temperaturze 2-8°C.
IM PS1, v1.5 i IM4, v1.5 przechowywać w temperaturze 2-8°C. Odczynniki te są
stabilne do oznaczonej daty przydatności. Po wymieszaniu IM PS1, v1.5 i IM4,
v1.5, odczynnik roboczy jest stabilny przez 14 dni w temperaturze 2-8°C.
Odczynnik roboczy może być stosowany przez maksymalnie 2 cykle pracy
urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy cyklami musi być przechowywany
w temperaturze 2-8°C.
IQ PS1, v1.5 i IQ4, v1.5 przechowywać w temperaturze 2-8°C. Odczynniki te są
stabilne do oznaczonej daty przydatności. Po wymieszaniu IQ PS1, v1.5 i IQ4,
v1.5, odczynnik roboczy jest stabilny przez 30 dni w temperaturze 2-8°C.
12/52
HIV-1 MONITOR
Odczynnik roboczy może być stosowany przez maksymalnie 4 cykle pracy
urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy cyklami musi być przechowywany
w temperaturze 2-8°C.
DN4 przechowywać w temperaturze 2-25°C. DN4 zachowuje stabilność do
oznaczonej daty przydatności. Po otwarciu opakowania, DN4 jest stabilny przez
30 dni w temperaturze 2-8°C lub do upływu daty ważności. DN4 stosować można
maksymalnie w ciągu 4 cykli pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy
poszczególnymi cyklami należy przechowywać go w temperaturze 2-8°C.
CN4 przechowywać w temperaturze 2-8°C. CN4 zachowuje stabilność do
oznaczonej daty przydatności. Po otwarciu opakowania, odczynnik CN4 jest trwały
przez 30 dni w temperaturze 2-8°C lub do upływu daty ważności. CN4 stosować
można maksymalnie w ciągu 4 cykli pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy
poszczególnymi cyklami należy przechowywać go w temperaturze 2-8°C.
SB3 i SB przechowywać w temperaturze 2-8°C. Nieotwarte, odczynniki te są
stabilne do oznaczonej daty ważności. Substrat roboczy musi być przygotowywany
codziennie, poprzez wymieszanie SB3 z SB. W analizatorze COBAS®
AMPLICOR® substrat roboczy jest stabilny przez 16 godzin. Ani SB3, SB ani
substratu roboczego nie należy poddawać działaniu metali, środków utleniających
lub bezpośredniego światła.
WB przechowywać w temperaturze 2-30°C. WB zachowuje stabilność do podanej
daty ważności. Zbadać WB przed rozcieńczeniem, i jeśli potrzeba, ogrzać do
temperatury 30-37°C, aby rozpuścić ewentualny osad. Roboczy roztwór płuczący
(1X), przygotowany poprzez rozcieńczenie WB 1:10 w wodzie destylowanej lub
dejonizowanej, musi być przechowywany w temperaturze 2-25°C w zbiorniku
buforu płuczącego COBAS® AMPLICOR® i zachowuje stabilność przez
2 tygodnie od daty przygotowania.
Pomiędzy uruchomieniami urządzenia częściowo zużyte odczynniki detekcji
należy przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed wprowadzeniem do
analizatora COBAS® AMPLICOR® odczynników z otwartych opakowań lub
odczynników roboczych, należy sprawdzić ich datę ważności.
Dostarczane materiały
COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
Odczynniki do przygotowania próbki
HIM
P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
HIM PREP
HIV-1 LYS
(HIV-1 MONITOR odczynnik lizujący)
HIV-1 QS, v1.5
(HIV-1 MONITOR standard oznaczania, wersja 1,5)
HIV-1 DIL
(HIV-1 MONITOR rozcieńczalnik próbki)
Odczynniki kontroli
HIM CTL
NHP
[Osocze ujemne (ludzkie)]
HIV-1 (–) C
[HIV-1 (–) Kontrola]
HIV-1 L(+)C
[HIV-1 MONITOR Low (+) Kontrola]
HIV-1 H(+)C
[HIV-1 MONITOR High (+) Kontrola]
13/52
Odczynniki do amplifikacji
HIM AMP
HIV-1 MMX, v1.5
(HIV-1 MONITOR odczynnik Master Mix, wersja 1.5)
HIV-1 Mn2+, v1.5
(HIV-1 MONITOR roztwór manganu, wersja 1.5)
Odczynniki do swoistej
reakcji detekcji
HIM DK
AD3
(Odczynnik do rozcieńczenia amplikonu)
IM PS1, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 1, wersja 1.5)
IM4, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 2, wersja 1.5)
IQ PS1, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 1 standardu oznaczania, wersja 1.5)
IQ4, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 2 standardu oznaczania, wersja 1.5)
Odczynniki do nieswoistej
reakcji detekcji
DK
DN4
(Roztwór denaturacyjny)
CN4
(Kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa)
SB3
(Substrat A)
SB
(Substrat B)
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® bufor płuczący
WB
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X – koncentrat płuczący)
Materiały wymagane, lecz niedostarczane
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowywania odczynników
– Pierścień A-ring wyposażony w 12 probówek A-tubes COBAS® AMPLICOR®
– Uchwyt pierścienia A-ring do aparatu COBAS® AMPLICOR®
– Pipeta Eppendorf Multipette® z pojemnikiem 1,25 ml Combitip® (jałowa,
pojedynczo pakowana)
– Pipetory (o pojemności 50 µl i 100 µl)* z końcówkami pozbawionymi RNazy
z barierą dla aerozoli lub wyrzutnikiem
– Jednorazowe rękawiczki, bezpudrowe
14/52
HIV-1 MONITOR
Przed amplifikacją – obszar przygotowania próbki i kontroli
– Probówki z zakrętką o pojemności 2,0 ml, jałowe (Sarstedt 72.694.006 lub
odpowiednik)**
– Probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml, jałowe (Sarstedt 72.692.105 lub
odpowiednik)**
– Stojaki do próbówek (Sarstedt 93.1428 lub odpowiednik)
– 95% etanol, do stosowania w biologii molekularnej lub histologii (świeżo
rozcieńczony do 70% za pomocą wody destylowanej lub dejonizowanej)
– Alkohol izopropylowy, o stopniu czystości odczynnika chemicznego
– Jałowe pipety transferowe o cienkich końcówkach, wolne od RNazy
– Jałowe, jednorazowe, polistyrenowe pipety serologiczne (5 ml, 10 ml i 25 ml)
– Pipetory (pojemność 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl,
600 µl, 800 µl i 1000 µl)* z końcówkami pozbawionymi RNazy z barierą dla
aerozoli lub wyrzutnikiem
– Mikrowirówka (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g);
Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub odpowiednik
– Chłodzona ultrawirówka i nieruchomy wirnik kątowy (45 stopni, mieszczący
co najmniej 24 probówki o pojemności 1,5 ml) z RCF 23 600 x g (Heraeus
17RS z wirnikiem HFA 22.1, Biofuge 28RS lub odpowiednik)
– Mieszadło wibracyjne
– Bezpudrowe rękawiczki jednorazowe
Po amplifikacji – obszar amplifikacji/detekcji
– Analizator i drukarka COBAS® AMPLICOR®
– Instrukcja obsługi analizatora COBAS® AMPLICOR®
• Opcjonalnie: Oprogramowanie AMPLILINK obejmujące:
– Stację danych
w drukarkę
z
oprogramowaniem
AMPLILINK,
wyposażoną
– Instrukcję obsługi oprogramowania AMPLILINK serii 2.4,
współpracującego z analizatorem COBAS® AMPLICOR® (w przypadku
stosowania oprogramowania AMPLILINK w wersji 2.41) lub Podręcznik
oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 stosowanego z urządzeniem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem
COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®
(w przypadku stosowania oprogramowania AMPLILINK serii 3.2)
– Stojaki dla pojemników D-cups
– Woda destylowana lub dejonizowana
– Pipety serologiczne o pojemności 5 ml
– Mieszadło wibracyjne
– Niepudrowane rękawiczki jednorazowe
*
Pipetory powinny być dokładne z zakresie 3% objętości znamionowej. We
wskazanych przypadkach używać należy pozbawionych RNazy końcówek
do pipet z barierą dla aerozoli lub wyrzutnikiem w celu zapobieżenia
skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem.
** Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek
zakręcanych, aby uniknąć rozpryśnięcia i możliwości krzyżowego skażenia
próbek i kontroli. Nie stosować korków zatrzaskowych.
15/52
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek
Uwaga
Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem zdolnym do
przenoszenia czynników zakaźnych.
Pobieranie próbek
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 przeznaczono do użycia
tylko z próbkami osocza. Krew pobierać do jałowych probówek stosując jako
antykoagulant EDTA (nakrętka lawendowa) lub ACD (nakrętka żółta). Próbki
pobrane na heparynę nie nadają się do badania przy użyciu tego testu. Pełną
krew przechowywać w 2-25°C nie dłużej niż 6 godzin. Zastosowanie próbek
zabezpieczonych przed krzepnięciem za pomocą ACD przyniesie wyniki, które są
o około 15% mniejsze niż wyniki uzyskane z próbek zabezpieczonych za pomocą
EDTA. Wynika to z rozcieńczenia za pomocą 1,5 ml ACD znajdującego się
w probówce. Na rysunku 1 przedstawiono wpływ antykoagulantów ACD i EDTA
na wyniki oznaczania HIV-1 RNA w próbkach osocza.
Próbki z ACD
Przeciętny wynik testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR
(HIV RNA kopie/ml osocze, n = 2)
Rysunek 1
Porównanie antykoagulantów ACD i EDTA *
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR
Wyniki dla próbek z EDTA i ACD
Próbki z EDTA
Przeciętny wynik testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR
(HIV RNA kopie/ml osocze, n = 2)
* Dane przedstawione na rysunku 1 otrzymano za pomocą testu AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, po standardowej procedurze przygotowania próbki.
Oddzielić osocze od pełnej krwi w ciągu 6 godzin od pobrania, odwirowując
(800-1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej. Osocze należy
przenieść do jałowych probówek polipropylenowych.
Transport próbek
Transport pełnej krwi lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi lub lokalnymi, dotyczącymi transportowania
czynników etiologicznych35. Krew pełną należy transportować w temperaturze
2-25°C i obrabiać w przeciągu 6 godzin od pobrania. Osocze może być
transportowane w 2-8°C lub zamrożone w temperaturze –20°C do –80°C.
Przechowywanie próbek
Próbki osocza mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez 1 dzień
lub w temperaturze 2-8°C przez 5 dni, albo zamrożone w temperaturze –20°C do
–80°C. Zaleca się, aby próbki przechowywać w równych objętościach
(600-700 µl) w jałowych polipropylenowych probówkach 2,0 ml z zakręcanymi
korkami (takimi jak Sarstedt 72.694.006). Próbki osocza można zamrażać
i rozmrażać najwyżej trzykrotnie. Rysunek 2 przedstawia dane z badań
dotyczących zamrażania i rozmrażania.
16/52
HIV-1 MONITOR
HIV-1 RNA kopie/ml
Znormalizowany do pierwszego rozmrożenia
Rysunek 2
Przeciętne wyniki HIV-1 z trzech mieszanin osocza HIV-1
dodatniego po 2, 3 i 4 cyklach zamrożenia-rozmrożenia*
Liczba rozmrożeń
* Dane przedstawione na rysunku 2 otrzymano za pomocą testu AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, po standardowej procedurze przygotowania próbki.
Instrukcja użytkowania
Uwaga
Szczegółowe informacje na temat obsługi, drukowania wyników oraz
interpretacji sygnałów i komentarzy przedstawiono w (1) Instrukcji obsługi
analizatora COBAS® AMPLICOR®, (2) Instrukcji obsługi oprogramowania
AMPLILINK w wersji 2.4, współpracującego z analizatorem COBAS®
AMPLICOR® (w przypadku stosowania oprogramowania AMPLILINK serii
2.41) lub, w przypadku używania oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 –
w Podręczniku oprogramowania AMPLILINK serii 3.2, stosowanego
z urządzeniem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®,
analizatorem COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®.
Uwaga
Przed użyciem wszystkie odczynniki muszą osiągnąć temperaturę otoczenia.
Potwierdzić wzrokowo obecność wystarczającej objętości każdego
z odczynników przed przystąpieniem do procedury testowej.
Uwaga
Próbki osocza przed użyciem muszą mieć temperaturę otoczenia. Tam, gdzie jest
to wskazane, używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub
wyrzutnikiem. Dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić wybiórczą amplifikację.
Uwaga
Do przygotowywania próbek badanych oraz kontrolnych należy stosować
probówki z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i potencjalnemu
skażeniu krzyżowemu próbek. Nie stosować korków zatrzaskowych.
Uwaga
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 można wykonywać tylko
w trybie podstawowym (Basic).
Wielkość przebiegu
Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla czterech przebiegów po 12
oznaczeń każdy, które wykonywać można oddzielnie lub w dwóch przebiegach po 24
oznaczeń. Maksymalna liczba próbek na przebieg wynosi 24 (21 próbek + 3
kontrole). Co najmniej jedno powtórzenie każdej AMPLICOR® HIV-1 (–) Kontroli,
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Low (+) Kontroli oraz AMPLICOR® HIV-1
MONITOR High (+) Kontroli musi być włączone do każdego uruchomienia testu
(zobacz rozdział Kontrola jakości).
Odczynniki przygotowania próbki oraz amplifikacji próbki pakowane są do
butelek jednokrotnego użytku, wystarczających do wykonania 12 testów. Aby
zapewnić efektywne użycie odczynników, próbki i kontrole należy badać
w seriach o liczebności będącej wielokrotnością liczby 12.
17/52
Uwaga
Przebieg pracy
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 można zakończyć w ciągu
jednego lub dwóch dni. Aby przeprowadzić oznaczenie w ciągu jednego dnia
roboczego należy kolejno wykonywać instrukcje w punktach Przygotowanie
odczynników, przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, oraz Odwrotna
transkrypcja, amplifikacja i detekcja. Badanie można wykonywać przez 2 dni,
przeprowadzając Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych w 1 dniu,
a następnie Przygotowanie odczynników i Odwrotną transkrypcję, amplifikację
i detekcję w 2 dniu.
W celu przeprowadzenia przygotowania próbek badanych i kontrolnych w 1 dniu,
a odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i detekcji w 2 dniu, należy wykonać albo
Standardowe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy A.1 do A.14)
albo Ultraczułe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy B.1 do
B.19). Poddane obróbce próbki należy przechowywać w warunkach wskazanych
w etapie A.14 lub B.19. W 2 dniu należy rozpocząć od Przygotowania
odczynników, a następnie w temperaturze pokojowej rozmrozić poddane obróbce
próbki badane i kontrolne, po czym przystąpić do Standardowego przygotowania
próbek badanych i kontrolnych, etap A.15, lub Ultraczułego przygotowania
próbek badanych i kontrolnych, etap B.20, oraz do Odwrotnej transkrypcji,
amplifikacji i detekcji.
Przygotowanie odczynników
18/52
Wykonywane w: Obszarze przedamplifikacyjnym – obszarze przygotowania
odczynników
1.
Określ, jaka liczba pierścieni A-ring jest potrzebna do badania próbek od
pacjentów i kontroli. Umieścić pierścień (pierścienie) A-ring w statywie
(statywach).
2.
Przygotować roboczy odczynnik Master Mix dodając 100 µl HIV-1 Mn2+,
v1.5 do jednej fiolki HIV-1 MMX, v1.5. Odmierzanie objętości Master Mix
nie jest konieczne. Dodać 100 µl HIV-1 Mn2+, v1.5 do całej fiolki HIV-1
MMX, v1.5. Zamknąć ponownie probówkę i wymieszać zawartość
odwracając 10-15 razy. Nie mieszać roboczego odczynnika Master Mix na
mieszadle wibracyjnym. Różowy barwnik znajdujący się w HIV-1 Mn2+,
v1.5 wykorzystuje się do wizualnego potwierdzenia, że HIV-1 Mn2+, v1.5
został dodany do Master Mix. Pozostałą część HIV-1 Mn2+, v1.5 należy
wyrzucić. Roboczy odczynnik Master Mix musi być przechowywany
w temperaturze 2-8°C i użyty w ciągu 4 godzin po przygotowaniu.
3.
Dodać 50 µl roboczego odczynnika Master Mix do każdej z probówek
A-tube, używając pipetora do powtarzalnego dozowania jednakowych
objętości cieczy lub pipetora z końcówkami wyposażonymi w barierę dla
aerozoli lub wyrzutnik. W tym czasie nie należy zamykać korków probówek
A-tube. Niezużyty roboczy odczynnik Master Mix należy wyrzucić.
4.
Umieścić pierścień (pierścienie) A-ring zawierający roboczy odczynnik
Master Mix w zamykanej torebce foliowej i zamknąć szczelnie torebkę.
Przenieść pierścień(nie) A-ring do obszaru przedamplifikacyjnego –
przygotowania próbek. Pierścień(nie) A-ring zawierające roboczy odczynnik
Master Mix należy przechowywać w temperaturze 2-8°C w obszarze
przedamplifikacyjnym – przygotowania próbek, do czasu zakończenia
przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. Roboczy odczynnik
Master Mix w probówkach A-tube zamkniętych szczelnie w plastykowym
worku w temperaturze 2-8°C zachowuje stabilność przez 4 godziny.
HIV-1 MONITOR
Przygotowanie próbek
badanych i kontroli
Wykonywane w: Obszarze przedamplifikacyjnym – przygotowania próbki
Uwaga
Aby wykonać amplifikację uprzednio przygotowanych próbek i kontroli, należy
najpierw wykonać kroki opisane w części „Przygotowanie odczynników”.
W temperaturze pokojowej należy rozmrozić poddane obróbce próbki badane
i kontrolne, a następnie wykonać „Standardowe przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych”, etap A.15 lub „Ultraczułe przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych”, etap B.20.
Uwaga
W HIV-1 LYS podczas przechowywania w temperaturze 2-8°C tworzy się osad.
Przed użyciem ogrzać do temperatury 25-37°C i dokładnie wymieszać, aby
doprowadzić do rozpuszczenia osadu.
Uwaga
Przed użyciem należy zbadać każdą butelkę HIV-1 LYS, obserwując ją na białym tle,
poszukując śladu żółtego koloru lub cech wyciekania. Jeżeli stwierdzono jakikolwiek
ślad żółtego koloru lub obecność wycieku, nie używać danej butelki do badania. Należy
skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu wymiany.
Standardowe przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych
A.1. Przygotować 70% etanol. Dla 12 testów, wymieszać 11,0 ml 95% etanolu
i 4,0 ml wody dejonizowanej lub destylowanej.
A.2. Oznaczyć jedną probówkę o pojemności 2,0 ml z zakręcanym korkiem dla
każdej próbki pochodzącej od pacjenta oraz dodatkowo oznaczyć trzy
probówki jako „HIV-1 (–) C”, „HIV-1 L(+)C” i „HIV-1 H(+)C”.
A.3. Przygotować standardowy roboczy odczynnik lizujący. Mieszać HIV-1 QS,
v1.5 za pomocą mieszadła wibracyjnego przez co najmniej 10 sekund przed
użyciem. Dla każdej serii składającej się maksymalnie z 12 próbek badanych
i kontrolnych, dodać 100 µl HIV-1 QS, v1.5 do jednej butelki HIV-1 LYS
i dokładnie wymieszać. Mierzenie objętości HIV-1 LYS nie jest konieczne.
Różowy barwnik znajdujący się w HIV-1 QS, v1.5 wykorzystuje się do
wizualnego potwierdzenia, że HIV-1 QS, v1.5 został dodany do HIV-1 LYS.
Pozostałą część HIV-1 QS, v1.5 należy wyrzucić. W temperaturze pokojowej
roboczy odczynnik lizujący jest stabilny przez 4 godziny.
Uwaga
W razie używania zamrożonych próbek, należy je rozmrozić w temperaturze
pokojowej i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Odwirować
krótko probówkę z próbką, aby pobrać próbkę z dna probówki. Zachować
ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic przy obchodzeniu się z próbkami.
A.4. Dodać 600 µl standardowego roboczego odczynnika lizującego do każdej
oznaczonej probówki; następnie zamknąć probówki. Sprawdzić, czy roboczy
odczynnik lizujący jest różowy, aby potwierdzić, że HIV-1 QS, v1.5 został
dodany do HIV-1 LYS.
A.5. Przygotować próbki kontrolne w następujący sposób:
– Mieszać na mieszadle wibracyjnym NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C
i HIV-1 H(+)C przez 3-5 sekund.
–
Dodać 200 µl NHP do każdej spośród trzech probówek kontrolnych.
Zamknąć probówki i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej
3-5 sekund.
–
Dodać 50 µl HIV-1 (–) C do probówki opisanej „HIV-1 (–) C” zawierającej
standardowy roboczy odczynnik lizujący oraz NHP. Zamknąć probówkę
i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
–
Dodać 50 µl HIV-1 L(+)C do probówki opisanej „HIV-1 L(+)C”
zawierającej standardowy roboczy odczynnik lizujący oraz NHP.
Zamknąć probówkę i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez
3-5 sekund.
19/52
–
Dodać 50 µl HIV-1 H(+)C do probówki opisanej „HIV-1 H(+)C”
zawierającej standardowy roboczy odczynnik lizujący oraz NHP. Zamknąć
probówkę i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
A.6. Dodać 200 µl każdej próbki pobranej od pacjenta do oznaczonych we
właściwy sposób probówek zawierających roboczy odczynnik lizujący.
Zamknąć probówki i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej
3-5 sekund.
A.7. Inkubować probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi w temperaturze
pokojowej przez 10 minut.
A.8. Do każdej probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi, po jej otwarciu,
dodać 800 µl 100% alkoholu izopropylowego (w temperaturze pokojowej),
ponownie zamknąć probówkę i energicznie mieszać na mieszadle
wibracyjnym przez 3-5 sekund. Jednocześnie może być otwarta tylko jedna
probówka.
A.9. Na każdej probówce umieścić znak orientacyjny; probówki umieścić
w mikrowirówce w taki sposób, aby znaki orientacyjne były skierowane na
zewnątrz. W ten sposób peletki ustawią się zgodnie ze znakami. Odwirować
próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy
maksymalnej prędkości (12 500-16 000 x g).
A.10. Używając dla każdej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej
z cienką końcówką ostrożnie odciągnąć i usunąć supernatant z każdej
probówki, zachowując ostrożność, aby nie wzburzyć peletki (która może być
nie widoczna). Usunąć tak dużo płynu, ile jest możliwe bez wzburzenia
peletki. Usunąć powoli supernatant, pozwalając na całkowite spłynięcie
płynu po ścianie probówki. Nie stosować aspiracji próżniowej.
A.11. Do każdej probówki dodać 1,0 ml 70% etanolu (w temperaturze pokojowej),
a następnie zamknąć ją i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
A.12. Umieścić probówki w mikrowirówce ze znakami orientacyjnymi
skierowanymi na zewnątrz i wirować probówki przez 5 minut
w temperaturze pokojowej przy maksymalnej prędkości (12 500-16 000 x g).
A.13. Za pomocą nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką,
oddzielnej dla każdej probówki, ostrożnie usunąć supernatant bez
wzburzenia peletki. Na tym etapie peletka powinna być wyraźnie widoczna.
Usunąć tak dużo supernatantu, ile jest możliwe. Pozostałości etanolu mogą
hamować amplifikację.
A.14. Dodać 400 µl HIV-1 DIL do każdej probówki. Zamknąć ponownie
probówki. Energicznie mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund
w celu ponownego uzyskania zawiesiny wyekstrahowanego RNA. Pozostać
może niewielka ilość nierozpuszczalnego materiału. W ciągu 2 godzin po
przygotowaniu poddane obróbce próbki badane i kontrolne należy
amplifikować. Jeżeli amplifikacja nie może rozpocząć się w ciągu 2 godzin
po przygotowaniu, próbki można przechowywać zamrożone w temperaturze
co najmniej –20°C nie dłużej niż jeden tydzień, z nie więcej niż jednym
cyklem zamrożenia-rozmrożenia. Więcej niż jeden cykl zamrożeniarozmrożenia może spowodować utratę liczby kopii.
Uwaga
Jeżeli poddane obróbce próbki badane i kontrolne przed amplifikacją
przechowywano zamrożone, to przed przejściem do etapu A.15 należy je rozmrozić
w temperaturze pokojowej i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
A.15. Do odpowiednich probówek A zawierających odczynnik roboczy Master
Mix za pomocą pipetora wyposażonego w końcówki z barierą dla aerozoli
lub wyrzutnikiem dodać 50 µl każdej z poddanych obróbce próbek badanych
i kontrolnych. Do każdej próbki badanej i kontrolnej użyć nowej końcówki.
20/52
HIV-1 MONITOR
Zachować ostrożność, aby nie przenieść jakiegokolwiek wytrąconego
materiału, który mógł nie ulec rozpuszczeniu. Zamknąć probówki A-tube.
A.16. Zanotować położenie próbek i kontroli w pierścieniu A-ring. Amplifikacja
musi rozpocząć się w ciągu 45 minut od dodania poddanych obróbce próbek
i kontroli do probówek A-tube zawierających roboczy odczynnik Master
Mix. Przenieść poddane obróbce próbki i kontrole w pierścieniach A-ring do
obszaru amplifikacji/detekcji. Pozostałości poddanych obróbce próbek
można zamrozić i przechowywać w temperaturze co najmniej –20°C nie
dłużej niż 1 tydzień, z nie więcej niż jednym cyklem zamrożeniarozmrożenia. Więcej niż jeden cykl zamrożenia-rozmrożenia może
spowodować utratę liczby kopii.
Ultraczułe przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych
B.1. Wstępnie schłodzić ultrawirówkę oraz wirnik do 2-8°C w sposób opisany
w instrukcji obsługi ultrawirówki.
B.2. Przygotować 70% etanol. Dla 12 testów, wymieszać 11,0 ml 95% etanolu
i 4,0 ml wody dejonizowanej lub destylowanej.
B.3. Oznaczyć jedną probówkę o pojemności 1,5 ml z zakręcanym korkiem dla
każdej próbki pochodzącej od pacjenta oraz dodatkowo oznaczyć trzy
probówki jako „HIV-1 (–) C”, „HIV-1 L(+)C” i „HIV-1 H(+)C”.
B.4. Przygotować ultraczuły roboczy odczynnik lizujący. Mieszać HIV-1 QS, v1.5
za pomocą mieszadła wibracyjnego przez co najmniej 10 sekund przed
użyciem. Dla każdej serii składającej się maksymalnie z 12 próbek badanych
i kontrolnych, dodać 25 µl HIV-1 QS, v1.5 do jednej butelki HIV-1 LYS
i dokładnie wymieszać. Mierzenie objętości HIV-1 LYS nie jest konieczne.
Różowy barwnik znajdujący się w HIV-1 QS, v1.5 wykorzystuje się do
wizualnego potwierdzenia, że HIV-1 QS, v1.5 został dodany do HIV-1 LYS.
Pozostałą część HIV-1 QS, v1.5 należy wyrzucić. W temperaturze pokojowej
ultraczuły roboczy odczynnik lizujący jest stabilny przez 4 godziny.
Uwaga
W razie używania zamrożonych próbek, należy je rozmrozić w temperaturze
pokojowej i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Odwirować
krótko probówkę z próbką, aby pobrać próbkę z dna probówki. Zachować
ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic przy obchodzeniu się z próbkami.
B.5. Dodać 500 µl każdej próbki pochodzącej od pacjenta do odpowiednio
oznaczonych probówek.
B.6. Dodać 500 µl NHP do każdej spośród odpowiednio oznaczonych probówek.
B.7. Na każdej probówce umieścić znak orientacyjny; probówki umieścić
w ultrawirówce w taki sposób, aby znaki orientacyjne były skierowane na
próbki badane i kontrolne z prędkością 23 600 x g przez 60 minut w 2-8°C.
B.8. Używając dla każdej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej
z cienką końcówką odciągnąć ostrożnie i usunąć supernatant z każdej
Uwaga
Peletki wirusa uzyskane w etapie B.8 ultraczułej procedury przygotowania
próbki zachowują stabilność do 6 godzin w temperaturze pokojowej.
W temperaturze co najmniej –20°C zachowują stabilność przez minimum
14 dni.
21/52
B.9. Dodać 600 µl roboczego odczynnika lizującego do każdej oznaczonej
probówki; następnie zamknąć probówki. Sprawdzić, czy roboczy odczynnik
lizujący jest różowy, aby potwierdzić, że HIV-1 QS, v1.5 został dodany do
HIV-1 LYS. Mieszać na mieszadle wibracyjnym probówkę przez
3-5 sekund, aby ponownie wprowadzić peletkę w stan zawiesiny.
B.10. Przygotować ultraczułe próbki kontrolne w następujący sposób:
–
Mieszać na mieszadle wibracyjnym HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C i HIV-1
H(+)C przez 3-5 sekund.
–
Dodać 12,5 µl HIV-1 (–) C do probówki opisanej „HIV-1 (–) C” zawierającej
ultraczuły roboczy odczynnik lizujący. Zamknąć probówkę i mieszać na
mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
–
Dodać 12,5 µl HIV-1 L(+)C do probówki opisanej „HIV-1 L(+)C” zawierającej
ultraczuły roboczy odczynnik lizujący. Zamknąć probówkę i mieszać na
mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
–
Dodać 12,5 µl HIV-1 H(+)C do probówki opisanej „HIV-1 H(+)C”
zawierającej ultraczuły roboczy odczynnik lizujący. Zamknąć probówkę
i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
B.11. Inkubować probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi w temperaturze
pokojowej przez 10 minut.
B.12. Do każdej probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi, po jej otwarciu,
dodać 600 µl 100% alkoholu izopropylowego (w temperaturze pokojowej),
ponownie zamknąć probówkę i energicznie mieszać na mieszadle wibracyjnym
przez 3-5 sekund. Jednocześnie może być otwarta tylko jedna probówka.
B.13. Na każdej probówce umieścić znak orientacyjny; probówki umieścić
w mikrowirówce w taki sposób, aby znaki orientacyjne były skierowane na
próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy
maksymalnej prędkości (12 500-16 000 x g).
B.14. Używając dla każdej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej
z cienką końcówką odciągnąć ostrożnie i usunąć supernatant z każdej
B.15. Do każdej probówki dodać 1,0 ml 70% etanolu (w temperaturze pokojowej),
a następnie zamknąć ją i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
B.16. Umieścić probówki w mikrowirówce ze znakami orientacyjnymi
skierowanymi na zewnątrz i wirować probówki przez 5 minut
w temperaturze pokojowej przy maksymalnej prędkości (12 500-16 000 x g).
B.17. Za pomocą nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką,
oddzielnej dla każdej probówki, ostrożnie usunąć supernatant bez
wzburzenia peletki. Na tym etapie osad (peletka) powinien być wyraźnie
widoczny. Usunąć tak dużo supernatantu, ile jest możliwe. Pozostałości
etanolu mogą hamować amplifikację.
B.18. Powtórzyć etap B.17 w celu usunięcia tak dużo pozostałości supernatantu, ile
jest możliwe. Pozostałości etanolu mogą hamować amplifikację.
B.19. Dodać 100 µl HIV-1 DIL do każdej probówki. Zamknąć ponownie
probówki. Energicznie mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund
w celu ponownego uzyskania zawiesiny wyekstrahowanego RNA. Pozostać
może niewielka ilość nierozpuszczalnego materiału. W ciągu 2 godzin po
22/52
HIV-1 MONITOR
przygotowaniu poddane obróbce próbki badane i kontrolne należy
amplifikować. Jeżeli amplifikacja nie może rozpocząć się w ciągu 2 godzin
po przygotowaniu, próbki można przechowywać zamrożone w temperaturz
co najmniej –20°C nie dłużej niż jeden tydzień, z nie więcej niż jednym
cyklem zamrożenia-rozmrożenia. Więcej niż jeden cykl zamrożeniarozmrożenia może spowodować utratę liczby kopii.
Uwaga
Jeżeli poddane obróbce próbki badane i kontrolne przed amplifikacją
przechowywano zamrożone, to przed przejściem do etapu B.20 należy je rozmrozić
w temperaturze pokojowej i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
B.20. Do odpowiednich probówek A-tube zawierających odczynnik roboczy
Master Mix za pomocą pipetora wyposażonego w końcówki z barierą dla
aerozoli lub wyrzutnikiem dodać 50 µl każdej z poddanych obróbce próbek
badanych i kontrolnych. Do każdej próbki badanej i kontrolnej użyć nowej
końcówki. Zachować ostrożność, aby nie przenieść jakiegokolwiek
wytrąconego materiału, który mógł nie ulec rozpuszczeniu. Zamknąć
probówki A-tube.
B.21. Zanotować położenie próbek i kontroli w pierścieniu A-ring. Amplifikacja
musi rozpocząć się w ciągu 45 minut od dodania poddanych obróbce próbek
i kontroli do probówek A-tube zawierających roboczy odczynnik Master
Mix. Przenieś przygotowane próbki badane i kontrolne w pierścieniach
(A-ring) do obszaru amplifikacji/detekcji. Pozostałości poddanych obróbce
próbek można zamrozić i przechowywać w temperaturze co najmniej –20°C
nie dłużej niż 1 tydzień, z nie więcej niż jednym cyklem zamrożeniaodmrożenia. Więcej niż jeden cykl zamrożenia-rozmrożenia może
spowodować utratę liczby kopii.
Odwrotna transkrypcja,
amplifikacja
i detekcja
Wykonywana w: Obszar poamplifikacyjny – amplifikacji/detekcji
Należy wykonać codzienne czynności serwisowe obejmujące:
– Przecierać stanowisko startowe przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej
kłaczków, a następnie osuszyć je
–
Przecierać końcówkę uchwytu do pojemników D-cup przy użyciu wilgotnej
szmatki pozbawionej kłaczków, a następnie osuszyć ją
–
Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i napełnić go w razie potrzeby
–
Przygotować roboczy roztwór płuczący (1X) w sposób podany poniżej. Zbadać
WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w temperaturze 30-37°C w celu
ponownego rozpuszczenia osadu. Dodać 1 objętość WB do 9 objętości
destylowanej lub dejonizowanej wody. Dobrze wymieszać. Przez cały czas
utrzymywać co najmniej 3-4 litry roboczego buforu płuczącego (1X)
w zbiorniku buforu płuczącego systemu
–
Opróżnić pojemnik na odpady
–
Włączyć analizator COBAS® AMPLICOR®
–
W czasie uruchamiania sprawdzić strzykawki i przewody
–
W czasie uruchamiania sprawdzić końcówkę transferową
Przed każdym przebiegiem
– Sprawdzić pojemnik na odpady i opróżnić go w razie potrzeby
–
Sprawdzić zbiornik buforu płuczącego, w razie potrzeby dodać buforu
–
Usunąć zużyte stojaki do pojemników D-cup
–
Włączyć analizator COBAS® AMPLICOR®
23/52
Ładowanie analizatora COBAS® AMPLICOR® i sprawdzenie działania systemu
1.
Sprawdzić ilość odczynników w analizatorze COBAS® AMPLICOR®.
Przygotować ilość pojemników z odczynnikami wystarczającą do
ukończenia zaplanowanej pracy.
2.
Dokładnie wymieszać IM PS1, v1.5 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml
IM PS1, v1.5 do jednej kasety z IM4, v1.5. Umieścić kasetę w stojaku na
odczynniki przeznaczone do określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę IM PS1,
v1.5. Zanotować datę przygotowania odczynnika na kasecie IM4, v1.5.
3.
Dokładnie wymieszać IQ PS1, v1.5 na mieszadle wibracyjnym. Dodać
2,5 ml IQ PS1, v1.5 do jednej kasety z IQ4, v1.5. Umieścić kasetę
w stojaku na odczynniki przeznaczone do określonego testu. Usunąć
zużytą fiolkę IQ PS1, v1.5. Zanotować datę przygotowania odczynnika na
kasecie IQ4, v1.5.
4.
Przygotować substrat roboczy pipetując 5 ml SB do jednej kasety z SB3. Aby
wymieszać, kilkakrotnie nabrać i usunąć płyn z pipety. Usunąć otwartą fiolkę
SB. Zanotować datę przygotowania na kasecie z SB3.
5.
Umieścić substrat roboczy w ogólnym stojaku na odczynniki.
6.
Umieścić kasetę AD3 w stojaku na odczynniki przeznaczone do określonego
testu. Zanotować datę na kasecie z AD3.
7.
Umieścić kasety z DN4 i CN4 w ogólnym stojaku na odczynniki. Na każdej
kasecie zanotować datę jej otwarcia.
8.
Oznaczyć ramki na odczynniki jako zwykłe lub określone dla danego testu,
używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania
AMPLILINK.
9.
Skonfigurować ramki na odczynniki przez wprowadzenie pozycji
odczynników i numerów serii do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK.
10. Załadować ramki na odczynniki do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK. Upewnić się, że każda kaseta z odczynnikami znajduje się
w przypisanym jej miejscu i jest mocno zamocowana w statywie.
11. Umieścić stojak na pojemniki D-cup na przeznaczonej dla nich platformie. Do
wykonania niezależnej, podwójnej analizy próbek przez analizator COBAS®
AMPLICOR® na każdą próbkę i roztwór kontrolny potrzebnych jest
6 pojemników D-cup, a na każdy pojemnik z odczynnikiem roboczym – dwa
pojemniki D-cup.
12. Umieścić pierścień(nie) A-ring w segmencie(tach) termocyklera analizatora
COBAS® AMPLICOR®.
13. Załadować pierścienie A do analizatora COBAS® AMPLICOR®, używając
klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK.
14. Utworzyć listę roboczą pierścienia A.
Uwaga
24/52
Na tym etapie użytkownik będzie musiał wprowadzić do analizatora COBAS®
AMPLICOR® liczbę kopii Quantitation Standard charakterystyczną dla serii
odczynnika, oraz zakresy kontroli Low (+) i High (+) Control, które znajdują się
na kartach danych COBAS® AMPLICOR® HIV-1 Test, v1.5 Data Card.
Wprowadzić odpowiednie zakresy kontroli w oparciu o zastosowaną procedurę
przygotowania próbki (tj. standardową lub ultraczułą). Zakresy te są
wprowadzane do analizatora COBAS® AMPLICOR® za pomocą klawiatury,
skanera kodu kreskowego lub oprogramowania AMPLILINK podczas
ustawiania listy pracy dla pierścienia A-ring.
HIV-1 MONITOR
15. Należy szczelnie zamknąć pokrywę segmentu(ów) termocyklera.
16. Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®.
17. Poczekać aż analizator COBAS® AMPLICOR® wskaże, że zakończone zostało
sprawdzanie obciążenia.
Uwaga
Analizator COBAS® AMPLICOR® umożliwia wykonanie 2 oddzielnych testów
ilościowych zawartości każdej probówki A-tube. Analizator COBAS®
AMPLICOR® oblicza wymaganą ilość każdego odczynnika detekcji, a kontrola
załadowania, która wykonywana jest na początku każdego cyklu, określa czy
dostępna ilość odczynników jest wystarczająca do żądanych testów.
18. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie wykonuje odwrotną
transkrypcję, amplifikację, rozcieńczenie amplikonu i detekcję. Wyniki są
wyrażone jako liczba kopii HIV-1 RNA w przeliczeniu na mililitr (kopie/ml).
Uwaga
Wyniki
Obliczenie wyników
Uwaga
Dla każdej próbki badanej i kontrolnej, analizator COBAS® AMPLICOR®
automatycznie:
•
Wybiera wszystkie rozcieńczenia amplikonu HIV-1 i Quantitation Standard,
które mieszczą się w liniowym zakresie absorbancji testu (0,15-2,0 A660).
Aby możliwe było obliczenie wyników, co najmniej jedno rozcieńczenie
HIV-1 oraz co najmniej jedno rozcieńczenie Quantitation Standard musi
mieścić się w wymienionym liniowym zakresie.
•
Koryguje wszystkie wybrane wartości absorbancji ze względu na
pochłanianie tła.
•
Określa, czy wartość A660 dla HIV-1 QS może być zaakceptowana,
potwierdzając, że etapy obróbki próbki, odwrotnej transkrypcji, amplifikacji
i detekcji zostały wykonane poprawnie.
•
Określa, czy wszystkie docelowe rozcieńczenia HIV-1 (–) C przynoszą
wartości A660 ≤ 0,099.
•
Określa wartości Total HIV-1 i QS A660 dla wszystkich wybranych
rozcieńczeń i oblicza liczbę kopii dla HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C oraz dla
każdej próbki, wykorzystując maksymalną wartość Total A660.
•
Określa, czy obliczona liczba kopii dla HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C mieści
się w przypisanym zakresie.
•
Generuje wydruk zawierający wartości A660 dla wszystkich rozcieńczeń HIV-1
i Quantitation Standard, a także obliczoną liczbę kopii (HIV-1 RNA kopie/ml)
dla każdej próbki badanej i kontrolnej. Liczba kopii znajduje się na wydruku,
poniżej miejsca identyfikacji próbki, w obrębie informacji naukowej.
W zależności od uznania użytkownika, wyniki testu można ręcznie
przekonwertować z wyrażonych w kopiach na mililitr (kopie/ml) na jednostki
międzynarodowe (IU/ml).
W oparciu o wspólne badania wielu ośrodków uzgodniono, że współczynnik
konwersji dla pierwszego standardu międzynarodowego wynosi 0,51 HIV-1 RNA
kopii na jednostkę międzynarodową36.
Seria sprawdzająca
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu serii, sprawdź sygnały i komentarze
umieszczone na wydruku. Seria nie jest ważna, jeżeli dowolny spośród
poniższych sygnałów i komentarzy dotyczy kontroli HIV-1 MONITOR.
25/52
Oznaczenie
_Q_
Komentarz
QS_INVALID
_N_
_H_
NC_INVALID
HPC_INVALID
_L_
LPC_INVALID
OD_SEQUENCE
QS_SEQUENCE
TARGETOD_HI
TARGETOD_LO
TARG_RANGE
•
Przegląd danych
Interpretacja
Wartość HIV-1 QS A660 dla dowolnej próbki kontrolnej większa lub
mniejsza niż akceptowalny zakres.
Wartość HIV-1 (–) CA660 większa niż akceptowalna granica (> 0,099).
Liczba kopii HIV-1 H(+)C większa lub mniejsza niż przypisany
zakres.
Liczba kopii HIV-1 L(+)C większa lub mniejsza niż przypisany
zakres.
Wskazuje na docelową wartość A660 poza sekwencją. Wyniki nie będą
obliczone. Powtórzyć całą procedurę testu, w tym przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych, amplifikację oraz detekcję.
Wskazuje na wartość QS A660 poza sekwencją. Wyniki nie będą
obliczone. Powtórzyć całą procedurę testu, w tym przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych, amplifikację oraz detekcję.
Wszystkie docelowe wartości gęstości optycznej (optical density, OD)
są większe niż największa wartość z określonego przedziału.
W przypadku wystąpienia takiego oznaczenia w odniesieniu do Low
Positive Control lub High Positive Control analizator COBAS®
AMPLICOR® nie oblicza miana. W przypadku braku obliczonej
wartości miana, wynik danej kontroli oraz przebieg oznaczenia są
nieważne.
Wszystkie docelowe wartości gęstości optycznej (OD) są mniejsze niż
najmniejsza wartość z określonego przedziału. W przypadku
wystąpienia takiego oznaczenia w odniesieniu do Low Positive
Control lub High Positive Control analizator COBAS® AMPLICOR®
nie oblicza miana. W przypadku braku obliczonej wartości miana,
wynik danej kontroli oraz przebieg oznaczenia są nieważne.
Co najmniej jedna docelowa wartość gęstości optycznej (OD) jest
mniejsza oraz jedna jest większa niż wartości z określonego
przedziału, lecz żadna nie mieści się w obrębie tego przedziału.
W przypadku wystąpienia takiego oznaczenia w odniesieniu do Low
Positive Control lub High Positive Control analizator COBAS®
AMPLICOR® nie oblicza miana. W przypadku braku obliczonej
wartości miana, wynik danej kontroli oraz przebieg oznaczenia są
nieważne.
Jeśli seria jest nieważna, należy powtórzyć całe oznaczenie, w tym
przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotną transkrypcję,
amplifikację i detekcję.
Analizator COBAS® AMPLICOR® przedstawia wydruk wyników A660, a także liczbę
kopii obliczoną dla każdej próbki badanej i kontrolnej. Wartości A660 dla seryjnych
rozcieńczeń amplikonu docelowego oraz QS powinny stopniowo zmniejszać się A660
wraz ze zwiększaniem się współczynników rozcieńczeń. Wyjątek stanowią
rozcieńczenia, dla których wartości A660 przekraczają zakres liniowy oznaczenia
(próbki o dużym mianie), lub rozcieńczenia, w których wartości A660 są zbliżone do tła
(próbki o małym mianie).
Rozcieńczenia amplikonu HIV-1
Rozcieńczenia HIV-1 #1, #2, #3 i #4 odpowiadają roztworowi amplikonu HIV-1
RNA bez zanieczyszczeń oraz seryjnym rozcieńczeniom 1:9, 1:81 i 1:729.
Wartości absorbancji powinny zmniejszać się wraz z seryjnymi
rozcieńczeniami – największa wartość A660 dla każdej próbki badanej i kontrolnej
w pierwszym rozcieńczeniu (rozcieńczenie #1) oraz najmniejsza wartość A660
w ostatnim rozcieńczeniu (rozcieńczenie #4). Jeżeli wartości HIV-1 A660 nie są
w sekwencji, to wyświetlona zostanie wiadomość błędu OD_SEQUENCE dla
danej próbki badanej lub kontrolnej.
26/52
HIV-1 MONITOR
Rozcieńczenia amplikonu HIV-1 QS
Rozcieńczenia HIV-1 QS #1 i #2 odpowiadają roztworowi amplikonu HIV-1 QS
bez zanieczyszczeń oraz rozcieńczeniu seryjnemu 1:9. Jeżeli wartość A660 dla
rozcieńczenia #2 jest większa niż wartość A660 dla rozcieńczenia #1, to
wyświetlona zostanie wiadomość błędu QS_SEQUENCE. Wynik testu dla tej
próbki badanej lub kontrolnej jest nieważny. Powtórzyć całą procedurę testu
(w tym obróbkę próbki, amplifikację i detekcję) dla tej próbki badanej lub
kontrolnej.
Interpretacja wyników z wartościami A660 poza sekwencją
•
Wartości A660 dla rozcieńczeń amplikonu HIV-1 powinny charakteryzować
się zmniejszaniem wartości A660 wraz ze zwiększaniem współczynnika
rozcieńczenia, z wyjątkiem rozcieńczeń, które są wysycone, oraz
rozcieńczeń charakteryzujących się wartościami A660 tła.
•
W reakcjach zawierających dużo kopii HIV-1 RNA na mililitr rozcieńczenia
#1, #2 i #3 mogą stać się wysycone, co spowoduje zmniejszenie wyników
A660 (patrz przykład 1 w tabeli 1). Wyniki te są ważne nawet wówczas, gdy
rozcieńczenia HIV-1 od #1 do #4 nie charakteryzują się zmniejszającymi się
wartościami A660.
•
W reakcjach zawierających mało kopii HIV-1 RNA na mililitr rozcieńczenia
#2, #3 i #4 mogą posiadać wartości A660 tła (patrz przykład 2 w tabeli 1).
Wyniki te są ważne nawet wówczas, gdy rozcieńczenia HIV-1 od #1 do #4
nie charakteryzują się zmniejszającymi się wartościami A660.
•
Wszystkie rozcieńczenia o wartościach A660 pomiędzy 0,15 a 2,0 powinny
charakteryzować się zmniejszaniem wartości A660 dla rozcieńczeń od #1 do
#4. Jeżeli wartości A660 pomiędzy 0,15 and 2,0 nie charakteryzują się
zmniejszaniem wartości A660 dla rozcieńczeń od #1 do #4, to występuje błąd
(patrz przykłady 3, 4 i 5 w tabeli 1). Wyniki testu dla tej próbki badanej lub
kontrolnej są nieważne. Należy powtórzyć całą procedurę testu dla tej próbki
(w tym obróbkę próbki, amplifikację oraz detekcję).
Tabela 1
Przykłady wyników A660 poza sekwencją
Docelowa A660
(współczynnik rozcieńczenia)
Przykład 1
1:1
2,578
1:9
3,603
1:81
3,201
1:729
*0,700
QS A660
(współczynnik)
rozcieńczenia)
1:1
1:9
2,618
*0,397
Przykład 2
*0,216
0,004
0,016
0,007
3,236
*0,743
WAŻNY: Próbka o niskim mianieA660 na poziomie
lub w pobliżu poziomu wykrywalności.
Przykład 3
0,002
0,007
0,004
0,339
4,218
*0,883
NIEWAŻNY: wyświetlana wiadomość
OD_SEQUENCE.
Przykład 4
3,052
1,597
3,384
2,887
1,357
*0,158
OD_SEQUENCE.
Przykład 5
0,016
0,267
0,007
0,004
3,612
*0,793
OD_SEQUENCE.
Interpretacja wyników
WAŻNY: Próbka o wysokim mianieA660 powyżej
liniowego zakresu pochłaniania.
*
Oznacza wartość A660 wybraną przez analizator COBAS® AMPLICOR® do obliczenia wyniku, tak jak wskazano na wydruku.
Nie wybrano wyniku dla próbek z wartościami A660 poza sekwencją.
Interpretacja
wyników
Aby przebieg był ważny, należy sprawdzić, czy żadnej z próbek nie towarzyszą
sygnały lub komentarze na wydruku wyników. Wyniki należy interpretować
w następujący sposób:
27/52
Analizator COBAS® AMPLICOR® zaprogramowano tak, aby sygnalizował
najczęstsze błędy i niespójności wyników. Niemniej jednak zaleca się, aby
elementem rutynowej oceny danych w laboratorium było przeglądanie odczytów
wartości A660, w celu zapewnienia maksymalnej integralności wyników.
Uwaga
•
•
•
Oznaczenie
_Q_
Komentarz
QS_INVALID
Wyniki próbek, którym na wydruku nie towarzyszą sygnały lub komentarze,
można ogłosić.
Ważny przebieg może zawierać zarówno wyniki próbek ważnych, jak
i nieważnych, w zależności od sygnałów i/lub komentarzy dla
poszczególnych próbek.
Próbki, którym towarzyszą sygnały i/lub komentarze, należy interpretować
w następujący sposób:
Interpretacja
Brak rozcieńczenia QS o wartości A660 w zakresie liniowego zakresu pochłaniania testu.
Wynik testu dla tej próbki jest nieważny. Próbki z wynikami nieważnymi powinny być
ponownie zbadane; należy powtórzyć przygotowanie próbek badanych i kontrolnych,
odwrotną transkrypcję, amplifikację oraz detekcję.
TARGETOD_LO
Wartości A660 dla wszystkich rozcieńczeń HIV-1 mniejsze niż liniowy zakres absorbancji
testu. Wyniki należy przedstawić jako „nie wykryto HIV-1 RNA (mniej niż 400 HIV-1 RNA
kopii/ml)” lub jako „nie wykryto HIV-1 RNA (mniej niż 50 kopii/ml)” w zależności od tego,
czy zastosowano standardową (Standard), czy ultraczułą (UltraSensitive) procedurę
przygotowania próbki.
TARGETOD_HI
Wartości A660 dla wszystkich rozcieńczeń HIV-1 większe niż zakres liniowy absorbancji testu.
Wynik należy przedstawić jako „nie oznaczono”. Jeżeli zastosowano standardową procedurę
rzygotowania próbki, to należy przygotować rozcieńczenie próbki oryginalnej i HIV-ujemnego
ludzkiego osocza oraz powtórzyć test, stosując standardową procedurę przygotowania próbki.
Pomnożyć uzyskany wynik przez współczynnik rozcieńczenia. Jeżeli zastosowano ultraczułą
procedurę przygotowania próbki, to należy powtórzyć badanie oryginalnej próbki osocza,
wykorzystując standardową procedurę przygotowania próbki.
RESULT_LO
Obliczona liczba kopii/ml jest mniejsza niż liniowy zakres testu. Dla standardowej procedury
przygotowania próbki wyniki należy przedstawić jako „wykryto HIV-1 RNA, mniej niż 400
HIV-1 RNA kopii/ml”. Jeżeli oczekuje się wyników ilościowych, należy ponownie zbadać
oryginalną próbkę osocza, wykorzystując ultraczułą procedurę przygotowania próbki. Dla
ultraczułej procedury przygotowania próbki wyniki należy przedstawić jako „wykryto HIV-1
RNA, mniej niż 50 HIV-1 RNA kopii/ml”.
RESULT_HI
Obliczona liczba kopii/ml jest większa niż liniowy zakres testu. Dla standardowej procedury
przygotowania próbki wyniki należy przedstawić jako „więcej niż 7,5 x 105 HIV-1 RNA
kopii/ml”. Jeżeli oczekuje się wyników ilościowych, można rozcieńczyć oryginalną próbkę
z ludzkim osoczem HIV-1-ujemnym i powtórzyć test. Pomnożyć uzyskany wynik przez
współczynnik rozcieńczenia. Dla ultraczułej procedury przygotowania próbki wyniki należy
przedstawić jako „więcej niż 1,0 x 105 HIV-1 RNA kopii/ml”. Jeżeli oczekuje się wyników
ilościowych, można ponownie zbadać oryginalną próbkę, wykorzystując standardową
procedurę jej przygotowania.
TARG_RANGE
Wszystkie docelowe wartości A660 nie mieszczą się w liniowym zakresie testu. Wynik należy
przedstawić jako „nie oznaczono”. Powtórzyć badanie oryginalnej próbki, ponawiając
przygotowanie próbki, odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję.
OD_SEQUENCE
Wskazuje na docelową wartość A660 poza sekwencją. Wyniki nie będą obliczone. Powtórzyć
całą procedurę testu, w tym przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, amplifikację oraz
detekcję.
QS_SEQUENCE
28/52
Wskazuje na wartość QS A660 poza sekwencją. Wyniki nie będą obliczone. Powtórzyć całą
procedurę testu, w tym przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, amplifikację oraz
detekcję.
HIV-1 MONITOR
Kontrola jakości
Co najmniej jedno powtórzenie każdej kontroli AMPLICOR® HIV-1 MONITOR
(–) Control, AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Low (+) Control oraz
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR High (+) Control musi być włączone do
każdego uruchomienia testu. Tak jak w przypadku każdej nowej procedury
laboratoryjnej, nowy operator powinien rozważyć zastosowanie dodatkowych
kontroli za każdym razem, kiedy przeprowadzany jest test, do czasu osiągnięcia
dużego stopnia zaufania dotyczącego poprawności przeprowadzania testu. Nie
ma wymagań dotyczących położenia kontroli w pierścieniu A-ring.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu oznaczenia, sprawdzić sygnały
i komentarze umieszczone na wydruku dla danego przebiegu.
Kontrola ujemna
Oznaczenie kontroli HIV-1 (–) Control powinno przynieść wynik HIV-1 RNA Not
Detected, t.j. wszystkie wartości HIV-1 A660 ≤ 0,099. Jeżeli HIV-1 (–) Kontrola nie
spełnia tego kryterium, to cały przebieg testu jest nieważny. Należy powtórzyć
cały proces (przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotna
transkrypcja, amplifikacja i detekcja). Jeżeli pochłanianie HIV-1 (–) Control
systematycznie wynosi więcej niż 0,099, to należy skontaktować się z lokalnym
przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Kontrole dodatnie
Przypisany zakres AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Low (+) oraz High (+)
Control jest swoisty dla danej serii kontroli w zależności do zastosowanego
sposobu przygotowania próbki (standardowego lub ultraczułego). Znajduje się on
na karcie danych COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5, którą
dostarczono wraz z zestawem. Zakresy te są wprowadzane do analizatora
COBAS® AMPLICOR® za pomocą klawiatury, skanera kodu kreskowego lub
oprogramowania AMPLILINK podczas ustawiania listy pracy dla pierścienia
A-ring.
Liczba kopii HIV-1 RNA na mililitr dla HIV-1 MONITOR Low (+) Control oraz
dla HIV-1 MONITOR High (+) Control powinna mieścić się w zakresie
wskazanym na karcie danych COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5.
Jeżeli jedna lub obie kontrole HIV-1 MONITOR (+) Control nie spełniają tych
kryteriów, to cały przebieg testu jest nieważny. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotna transkrypcja,
amplifikacja i detekcja). Jeżeli liczba kopii HIV-1 RNA na mililitr dla jednej lub
obu kontroli HIV-1 MONITOR (+) Control systematycznie mieści się poza
przypisanym zakresem, proszę zwrócić się do regionalnego biura Roche w celu
uzyskania pomocy technicznej.
Środki ostrożności dotyczące procedury
Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem
w obszarze „przedamplifikacyjnym” i z jednokierunkowym ruchem w stronę
obszaru „poamplifikacyjnego” (amplifikacji/detekcji). Czynności wykonywane
przed amplifikacją należy rozpocząć od przygotowania odczynników, a następnie
przygotowania próbek. Materiały i urządzenia muszą być przypisane do każdej
z czynności przedamplifikacyjnych i nie wolno ich używać do żadnych innych
czynności lub przenosić pomiędzy obszarami. W każdym z obszarów należy
używać rękawic; rękawice muszą być zmieniane przed opuszczeniem każdego
z obszarów. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika
nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem
próbki lub pipetowaniem lub obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł
docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po
amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
29/52
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia
badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
Z uwagi na wysoką czułość analityczną tego testu, należy zachować najwyższą
ostrożność, aby nie dopuścić do skażenia odczynników w zestawach lub
mieszanin amplifikacyjnych. Należy monitorować czystość wszystkich
odczynników. Wyrzucić wszelkie podejrzane odczynniki.
Ograniczenia metody
Test ten został sprawdzony wyłącznie w przypadku stosowania ludzkiego osocza
pobranego do EDTA lub ACD (antykoagulanty). Badanie innych rodzajów
próbek może skutkować wynikami fałszywie ujemnymi lub fałszywie dodatnimi.
Heparyna hamuje PCR; nie wolno stosować próbek pobranych z heparyną jako
antykoagulantem w teście COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5.
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, zoptymalizowano dla HIV-1
grupy M, podtypów A-H. Działanie testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR,
v1.5 w przypadku HIV-1 grupy O oraz HIV-2 nie jest znane. Niniejszy test nie
powinien być stosowany w postępowaniu klinicznym z pacjentami zakażonymi HIV-2
lub HIV-1 grupa O.
Wiarygodne wyniki uzależnione są od właściwego pobrania próbki, transportu,
przechowywania oraz procedur obróbki.
Obecność AmpErase w AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Master Mix, v1.5,
zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Mimo tego skażenia między próbkami
kontrolnymi wykazującymi pozytywny odczyn w kierunku HIV-1 i próbkami
klinicznymi uniknąć można jedynie dzięki dobrej praktyce laboratoryjnej
i dokładnemu przestrzeganiu procedur wyszczególnionych w Podręczniku
metodyki.
Niniejszy produkt powinien być stosowany wyłącznie przez personel przeszkolony
w technikach PCR.
Niniejszego produkt używać można wyłącznie w analizatorze COBAS®
AMPLICOR®.
Wytyczne proceduralne
Decyzja o zastosowaniu standardowej lub ultraczułej procedury przygotowania
próbki zależeć będzie od charakterystycznej populacji pacjentów, których osocze
trafia do laboratorium. Zaleca się, aby każde laboratorium oceniło
charakterystykę populacji pacjentów, w celu ustalenia najlepszej procedury
laboratoryjnej dla początkowego badania. Ponadto należy określić, w których
przypadkach stosowana będzie alternatywna procedura przygotowania próbki. Na
przykład, jeżeli w populacji pacjentów nie ma osób dotychczas nieleczonych lub
wiadomo, że wszyscy pacjenci otrzymują leczenie przeciwko retrowirusom, to
laboratorium może wybrać ultraczułą procedurę przygotowania próbki jako
metodę rutynową; procedurę standardową stosować natomiast tylko wówczas,
gdy obciążenie organizmu wirusem przekracza 100 000 kopii/ml. Jeżeli nie jest
znana populacja pacjentów (w odniesieniu do leczenia lub wstępnego obciążenia
organizmu wirusem), laboratorium może wybrać standardową procedurę
przygotowania próbki jako procedurę rutynową; procedurę ultraczułą stosować
natomiast tylko po zastosowaniu procedury standardowej i uzyskaniu wyniku
wskazującego na obciążenie organizmu wirusem mniejsze niż 400 kopii/ml.
30/52
HIV-1 MONITOR
Substancje interferujące
Heparyna hamuje PCR. Nie stosować próbek pobranych do heparyny.
Zwiększone poziomy lipidów, bilirubiny oraz hemoglobiny w próbkach nie
interferują z oznaczeniem ilościowym HIV-1 RNA za pomocą tego testu.
Następujące leki nie interferują z oznaczeniem ilościowym HIV-1 RNA za
pomocą testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5:
Inhibitory proteazy HIV
• Indinawir
• Ritonawir
• Nelfinawir
• Sakwinawir
Nienukleozydowe inhibitory
odwrotnej transkryptazy
• HBY 097
• Newirapina
• Delawirdyna
Inhibitory odwrotnej transkryptazy
nukleozydu HIV
• Zydowudyna
• Didanozyna
• Zalcytabina
• Stawudyna
• Lamiwudyna
Związki stosowane w leczeniu CMV
• Gancyklowir
• Walinian gancyklowiru
Ocena działania poza zastosowaniami klinicznymi
Opis badania
Granica detekcji, dokładność i zakres liniowy testu COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5, określono za pomocą analizy rozcieńczeń seryjnych
szczegółowo poznanej hodowli macierzystej wirusa HIV-1 w HIV-ujemnym
osoczu ludzkim. Wirus został dostarczony przez Laboratorium kontroli jakości
wirusologicznej (Virology Quality Assurance, VQA) grupy ds. badań klinicznych
AIDS (AIDS Clinical Trials Group, ACTG), wydziału ds. AIDS Narodowych
instytutów zdrowia (National Institutes of Health, NIH) w Bethesda, Maryland,
USA. Stężenie wirusowego RNA w hodowli macierzystej oszacowano za pomocą
mikroskopii elektronowej, stężenia antygenu p24, oraz testu AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, a także analizy rozgałęzionych łańcuchów DNA. Wszystkie metody
przyniosły porównywalne wyniki36. Przygotowanie próbek oraz analizę za
pomocą testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, przeprowadzono
wewnątrz laboratorium. Panel seryjnych rozcieńczeń analizowano każdego
spośród dwunastu dni, za pomocą standardowej oraz ultraczułej procedury
przygotowania próbki z dwoma seriami testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5.
Granica detekcji
W badaniach przytoczonych powyżej wykazano, że test COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5, po ultraczułym przygotowaniu próbki, umożliwia
wykrycie w osoczu HIV-1 RNA związanego z wirionem w stężeniach nawet tak
małych, jak 50 kopii RNA na mililitr, z odsetkiem wyników dodatnich większym
niż 95% oraz w stężeniach tak małych jak 400 kopii RNA na mililitr z odsetkiem
wyników dodatnich większym niż 95%, stosując standardową procedurę
przygotowania próbki (tabela 2), zakładając, że OD wybranych pojemników
D-cup znajduje się w określonym zakresie OD (0,15-2,00).
31/52
Tabela 2
Granica wykrywalności testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Standardowe przygotowanie próbki
Ultraczułe przygotowanie próbki
Nominalna wartość
Nominalna wartość
wejściowa
Liczba
Liczba Dodatnich
wejściowa
Liczba
(HIV-1 RNA
powtórzeń odsetek
(HIV-1 RNA
powtórzeń
kopie/ml)
kopie/ml)
Liczba Dodatnich
odsetek
850 000
36
36
100%
100 000
36
36
100%
750 000
36
36
100%
75 000
36
36
100%
650 000
36
36
100%
50 000
36
36
100%
500 000
36
36
100%
35 000
36
36
100%
350 000
36
36
100%
25 000
35
35
100%
100 000
36
36
100%
5000
35
35
100%
35 000
36
36
100%
1000
36
36
100%
7000
36
36
100%
400
32
32
100%
2000
36
36
100%
100
36
36
100%
600
36
36
100%
80
36
36
100%
500
48
46
96%
60
36
35
97%
400
36
36
100%
50
36
35
97%
250
36
29
81%
40
36
32
89%
175
36
27
75%
25
36
29
81%
Dokładność wewnątrzseryjną oraz całkowitą oceniono zgodnie z metodyką
określoną w wytycznych CLSI EP5-T2, „Ocena dokładności działania urządzeń
do testów chemicznych w zastosowaniach klinicznych” („Evaluation of Precision
Performance of Clinical Chemistry Devices”). Procedura ta dopuszcza
oznaczenie dokładności wewnątrzseryjnej i całkowitej poprzez przeprowadzenie
pojedynczego badania obejmującego wiele dni i wielu użytkowników. Serię
składającą się z 3 powtórzeń każdej próbki przeprowadzano codziennie przez
12 dni. Każdą próbkę przeprowadzono poprzez całą procedurę testu COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, w tym przygotowanie próbki, odwrotną
transkrypcję, amplifikację i detekcję. Dlatego przedstawiana tutaj dokładność
odzwierciedla wszystkie aspekty procedury testu. Wyniki pochodzące z badania
dotyczącego dokładności przedstawiono w tabelach 3 oraz 4.
Dokładność
Tabela 3
Dokładność testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
standardowa procedura przygotowania próbki
Próbka
Próbka 1
Próbka 2
Próbka 3
Próbka 4
Całkowita liczba powtórzeń
36
36
36
36
Przeciętne miano HIV-1 RNA
(kopie/ml)
705
10 056
162 119
535 083
Odchylenie standardowe
341
3082
44 188
148 708
CV
48%
31%
27%
28%
340
2916
53 556
190 702
CV
48%
29%
33%
36%
Wewnątrz serii
Ogółem
32/52
HIV-1 MONITOR
Tabela 4
Dokładność testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 ultraczuła
procedura przygotowania próbki
Próbka
Próbka 1
Próbka 2
Próbka 3
Próbka 4
Całkowita liczba powtórzeń
36
36
35*
36
Przeciętne miano HIV-1 RNA
(kopie/ml)
84
1045
5578
39 825
44
331
823
12 451
52%
32%
15%
31%
39
382
1350
12 074
47%
37%
24%
30%
Wewnątrz serii
CV
Ogółem
CV
* Dla próbki 3 uzyskano jeden wynik nieważny QS; nie włączono go do obliczenia
dokładności.
Zakres liniowy
Tak jak przedstawiono na rysunku 3, wykazano, że test COBAS® AMPLICOR® HIV1 MONITOR, v1.5 przynosi odpowiedź liniową od 50 (Log10 = 1,70) HIV-1 RNA
kopii/ml do co najmniej 100 000 (Log10 = 5,00) HIV-1 RNA kopii/ml, podczas
stosowania ultraczułej procedury przygotowania próbki oraz od 400 (Log10 = 2,60)
HIV-1 RNA kopii/ml do co najmniej 750 000 (Log10 = 5,87) HIV-1 RNA kopii/ml,
podczas stosowania standardowej procedury przygotowania próbki. Ponadto
zaobserwowano silną zależność pomiędzy standardową i ultraczułą procedurą
przygotowania próbki we wspólnym zakresie liniowym testu COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, tj. 400 do 100 000 kopii/ml.
Wynik testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, wersja 1.5
Log 10 (HIV-1 RNA kopie/ml)
Rysunek 3
Liniowość testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 standardowa
i ultraczuła procedura przygotowania próbki
7,0
Standardowe przygotowanie próbki
y = -0,16731 + 1,06x R = 0,99912
Ultraczułe przygotowanie próbki
y = -0,18823 + 1,0465x R = 0,99946
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
Słupki błędu - 1 odchylenie standardowe
N = 27 do 36
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Stężenie nominalne
Log (HIV-1 RNA kopie/ml)
10
33/52
Zakres zdolności diagnostycznej
(działanie na podtypach grupy M)
Izolaty HIV-1, które zebrano na całym świecie, wykazują istotne zróżnicowanie
genetyczne; mogą być klasyfikowane do grup filogenetycznych w oparciu
o sekwencję nukleotydów38,39. Grupa M (major – główna) zawiera zdecydowaną
większość izolatów HIV-1; grupa O (outliers – pozostałe) reprezentuje niewielką
liczbę izolatów, pochodzących w większości z Kamerunu i Gabonu. Grupę M
można dalej podzielić na co najmniej 9 podtypów (lub kladów), które oznacza się
literami od A do I.
Działanie testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, w przypadku
podtypów grupy M oceniono analizując 30 dobrze poznanych hodowanych
izolatów HIV-1, reprezentujących podtypy od A do G (patrz tabela 5). Każdy
izolat hodowano in vitro. Stężenia hodowli macierzystej wirusa oceniono
obliczając liczbę cząsteczek w mikroskopie elektronowym, zgodnie z metodą
Layne i wsp.40 Każda hodowla macierzysta wirusa została rozcieńczona
w ujemnym osoczu ludzkim do stężenia wynoszącego w około 12 500 oraz 1250
cząsteczek wirusa/ml. Każde rozcieńczenie hodowli macierzystej wirusa
analizowano w jednym laboratorium, w trzech powtórzeniach, wykorzystując
zarówno standardową, jak i ultraczułą procedurę przygotowania próbki.
Ponieważ każda cząstka wirusa zawiera dwa genomy wirusowe, oczekiwane
stężenia HIV RNA wynoszą w przybliżeniu 25 000 kopii/ml i 2500 kopii/ml.
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, przyniósł równoważne
wyniki dla wszystkich 30 izolatów; liczby kopii dla wszystkich badanych
podtypów były zgodne pomiędzy sobą oraz zgodne z oczekiwaną liczbą cząstek
wirusa (patrz rysunek 4). Dla próbek zawierających 25 000 kopii/ml, średni
wynik dla standardowej procedury przygotowania próbki wynosił
43 906 kopii/ml z 4,5-krotnym zakresem (od 18 567 do 82 917 kopii/ml) oraz dla
ultraczułej procedury przygotowania próbki – 29 019 kopii/ml z 6,3-krotnym
zakresem (do 12 233 do 77 250 kopii/ml). Dla próbek zawierających
2500 kopii/ml średni wynik dla standardowej procedury przygotowania próbki
wynosił 4045 kopii/ml z 6,4-krotnym zakresem (od 1379 do 8807 kopii/ml) oraz
dla ultraczułej procedury przygotowania próbki – 3710 kopii/ml z 5,7-krotnym
zakresem (do 1390 do 7977 kopii/ml).
Powyższe wyniki wskazują na silną korelację pomiędzy standardową i ultraczułą
procedurą przygotowania próbki. Nie badano izolatów grupy O. Działanie testu
COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 wobec izolatów grupy O nie
jest znane.
34/52
HIV-1 MONITOR
Tabela 5
Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 badanie zdolności
diagnostycznej dla podtypów – badane izolaty HIV-1
Izolat
Kraj
izolacji
Podtyp
Pozycja piśmiennictwa
Numer akcesyjny
do GenBank
UG273
Uganda
A
43
L22957
DJ258
Dżibuti
A
41, 43
L11763, L22939
DJ263
Dżibuti
A
43, 47
AF063223, L22941
US1
USA
B
44
L14573
US2
USA
B
44
L14574
US3
USA
B
44
L14575
US4
USA
B
44
L14576
CM237
Tajlandia
B
44
L14570
BK132
Tajlandia
B
45
L03696, L03697
BZ167
Brazylia
B
41, 42
L11752, L22087
ZAM18
Zambia
C
43, 46, 50
L03705, L22945
UG268
Uganda
C
41, 43, 46
L11799, L22948
ETH2220
Etiopia
C
46, 52
U46016
SE364
Senegal
C
43
L22944
SM145
Somalia
C
41, 43
L11803, L22946
SE365
Senegal
D
41, 43
L11797, L22945
UG270
Uganda
D
41
L11800
UG274
Uganda
D
41, 43, 46
L11801, L22950
CM235
Tajlandia
E
45
L03698
CM238
Tajlandia
E
41, 44
L11760, L14571
CM240
Tajlandia
E
41, 44, 48
U54771, L11761, L14572
L03702, L03703
CM243
Tajlandia
E
45
POC30506
Tajlandia
E
46, 49
U48272
ID12
Indonezja
E
46, 51
U68193
ID17
Indonezja
E
46, 51
U68191
NP1465
Tajlandia
E
46
nie jest w GenBanku
BZ126
Brazylia
F
42
L22083, L22082
BZ162
Brazylia
F
41, 42
L11751, L22084
BZ163
Brazylia
F
42
L22086, L22085
HH8793
Kenia
G
46, 47
AF061640
35/52
BZ163 / F
HH8793 / G
BZ162 / F
BZ126 / F
ID17 / E
NP1465 / E
ID12 / E
CM243 / E
POC30506 / E
CM240 / E
CM238 / E
UG274 / D
CM235 / E
SE365 / D
UG270 / D
SE364 / C
1
SM145 / C
10
UG268 / C
2
ETH2220 / C
10
BZ167 / B
3
ZAM18 / C
10
BK132 / B
4
US4 / B
10
CM237 / B
5
US3 / B
10
US2 / B
6
US1 / B
10
Ultraczuła - 2 500 k/ml
Ultraczuła - 25 000 k/ml
Standardowa - 2 500 k/ml
Standardowa - 25 000 k/ml
DJ263 / A
7
DJ258 / A
10
UG273 / A
Wynik testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, wersja 1.5
(HIV-1 RNA kopie/ml)
Rysunek 4
Działanie testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5,
na podtypy HIV-1 od A do G
Izolat i podtyp
Swoistość kliniczną testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5,
ustalono za pomocą analizy anty-HIV-1 ujemnych dawców krwi. Ogółem,
stosując standardową procedurę przygotowania próbki, zbadano 507 próbek
z dodatkiem antykoagulantu EDTA (267) lub ACD (240); natomiast stosując
ultraczułą procedurę przygotowania próbki zbadano 504 próbki z dodatkiem
antykoagulantu EDTA (307) lub ACD (197). W badaniu tym zastosowano trzy
serie testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5. Wszystkie próbki
były ujemne dla HIV-1 RNA w przypadku procedury standardowej, a 503 próbki
były ujemne w przypadku procedury ultraczułej. Jedna próbka, która
w przypadku ultraczułej procedury przygotowania próbki była dodatnia dla
HIV-1 RNA, charakteryzowała się wartością HIV A660 w pojemniku D-cup bez
zanieczyszczenia wynoszącą 0,156 (patrz tabela 6). Po podwójnym powtórzeniu
badania tej próbki za pomocą procedury ultraczułej, oba powtórzenia przyniosły
wyniki ujemne (HIV A660 w pojemniku D-cup bez zanieczyszczenia = 0,002
i 0,002). Zakładając, że u seroujemnych dawców krwi częstość występowania
zakażenia HIV-1 wynosi zero, swoistość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR®
HIV-1 MONITOR, v1.5 i standardowej obróbki próbki wynosi 100%,
a ultraczułej obróbki próbki – 99,8%.
Swoistość kliniczna
Tabela 6
Swoistość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5
Anty-HIV-1 ujemni dawcy krwi
Procedura
przygotowania
próbki
Standardowa
Ultraczuła
36/52
N
507
504
HIV-1 RNA
kopie/ml
Nie wykryto
507
503
Dodatnie
0
1
HIV-1 A660
(w rozcieńczeniu bez zanieczyszczenia
w pojemniku detekcyjnym D-cup)
Minimum Przeciętnie Maksimum
SD
0,000
0,004
0,082
0,006
0,000
0,005
0,156
0,010
HIV-1 MONITOR
Swoistość analityczna
Swoistość analityczną testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5,
oceniono dodając hodowane komórki, hodowane wirusy lub oczyszczone kwasy
nukleinowe z organizmów i wirusów wymienionych w tabeli 7 do HIV ujemnego
osocza ludzkiego (po etapie A.6. “Instrukcji użytkowania”). Każdą próbkę
analizowano za pomocą testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5,
po standardowej obróbce próbki. Dla żadnego spośród organizmów, wirusów lub
oczyszczonych kwasów nukleinowych innych niż HIV nie uzyskano wyniku
dodatniego w kierunku RNA HIV-1. Dwa spośród czterech badanych izolatów
HIV-2 (7824A i 60415K) przyniosły wyniki dodatnie; niemniej nie można
wypowiedzieć się o zdolności tego testu do amplifikacji izolatów HIV-2.
Tabela 7
Próbki swoistości analitycznej
Adenowirus typ 2
Adenowirus typ 3
Adenowirus typ 7
Cytomegalowirus AD-169
Cytomegalowirus Davis
Cytomegalowirus Towne
Wirus Epstein-Barr P-3
(komórki chłoniaka Burkitta)
Wirus Epstein-Barr HR1
(komórki chłoniaka Burkitta)
Wirus Epstein-Barr
(komórki chłoniaka Burkitta RAJI)
Varicella-Zoster Ellen
Varicella Oka
Wirus zapalenia wątroby typu B
Wirus zapalenia wątroby typu C genotyp 1a
Wirus zapalenia wątroby typu C genotyp 1b
Wirus zapalenia wątroby typu C genotyp 2b
Wirus zapalenia wątroby typu C genotyp 3a
Wirus zapalenia wątroby typu C genotyp 4c
HIV-2 BEN
HIV-2 podtyp A/B (izolat 7312A)
HIV-2 podtyp A/B (izolat 7824A)
HIV-2 podtyp A/B (izolat 60415K)
Ludzki wirus Herpes 6
Ludzki wirus Herpes 7
Herpes simplex typ 1,F
Herpes simplex typ 1, HF
Herpes simplex typ 1, McIntyre
Herpes simplex typ 2, G
Herpes simplex typ 2, MS
Ludzki wirus papilloma 6B
Ludzki wirus papilloma 11
Komórki HTLV-1 MT-2
Komórki HTLV-1 MoT
Mycobacterium avium
Pneumocystis carinii
Propionibacterium acnes
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Działanie w porównaniu
z testem AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5
Działanie testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 porównano analizując próbki osocza
pochodzące od pacjentów zakażonych HIV-1. Próbki pozyskano od firmy
Bioclinical Partners, Inc. (Franklin, MA, USA). Dla próbek tych nie znano
wcześniej wyników testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, ponadto przyjęto, że
należą one do podtypu B. Ogółem 289 próbek porównano, wykorzystując
standardową procedurę przygotowania testu; 332 próbki porównano,
wykorzystując ultraczułą procedurę przygotowania próbki. Korelację ustalono za
pomocą próbek, dla których wyniki ilościowe uzyskano posługując się zarówno
testem COBAS® AMPLICOR®, jak i AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (225
próbek – standardowa procedura przygotowania próbki oraz 259 próbek –
ultraczuła procedura przygotowania próbki). Dla tych próbek, które przyniosły
wyniki w zakresie liniowym standardowej procedury przygotowania próbki (400750 000 kopii/ml), jak przedstawiono na rysunku 5, oraz w zakresie liniowym
ultraczułej procedury przygotowania próbki (50-100 000 kopii/ml), jak
przedstawiono na rysunku 6, przeprowadzono analizę regresji. Wyniki uzyskane
za pomocą testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, były bardzo dobrze skorelowane dla
każdej procedury przygotowania próbki.
37/52
Rysunek 5
Korelacja testów COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, przeprowadzanych na próbkach osocza
pochodzących od pacjentów zakażonych HIV-1 standardowa procedura
przygotowania próbki
COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log HIV-1 RNA-kopie/ml
7,0
y = 0,33206 + 0,95588x R = 0,93668
6,0
5,0
10
4,0
3,0
2,0
1,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log HIV-1 RNA-kopie/ml
10
Rysunek 6
Korelacja testów COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, przeprowadzanych na próbkach osocza
pochodzących od pacjentów zakażonych HIV-1 ultraczuła procedura
przygotowania próbki
7,0
COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log10HIV-1 RNA-kopie/ml
y = 0,27412 + 0,93427x R = 0,91887
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log 10 HIV-1 RNA-kopie/ml
38/52
HIV-1 MONITOR
Skuteczność kliniczna
Analizę obciążenia organizmu wirusem w opisanych niżej badaniach
przeprowadzono za pomocą testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR. Badania te
przeprowadzono w USA; u wszystkich uczestniczących w nich pacjentów
oczekiwano zakażenia podtypem B HIV-1. Skuteczność kliniczną testu COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, można było ustalić na podstawie tych
badań wówczas, gdy wykazano, że test AMPLICOR® HIV-1 MONITOR oraz test
COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 mają równoważne działanie
(z wyjątkiem podtypów HIV-1 innych niż B) i przynoszą równoważne wyniki dla
próbek zawierających podtyp B (dane w pliku).
Rokowanie
Stosowanie testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR w celu przewidywania progresji
choroby u osób zakażonych HIV oceniano w badaniach ACTG 116A i 116B/117.
Dane uzyskane w tych badaniach analizowano za pomocą modelu hazardów
proporcjonalnych Coxa, w celu oceny częstości progresji choroby w oparciu
o poziom HIV-1 RNA. Badanie ACTG 116A miało charakter badania z podwójną
ślepą próbą, w którym porównywano skuteczność kliniczną zydowudyny (ZDV)
w połączeniu z dwoma dawkami 2',3'-dideoksyinozyny (ddI) u pacjentów
z aawansowaną chorobą wywoływaną przez HIV, u których wcześniej, nie dłużej niż
przez 16 tygodni, stosowano leczenie zydowudyną. Badanie ACTG 116B/117 miało
charakter badania skuteczności, w którym porównywano leczenie za pomocą
2',3'-dideoksyinozyny (ddI) oraz zydowudyny u pacjentów zakażonych HIV,
u których wcześniej stosowano leczenie zydowudyną dłużej niż 16 tygodni.
Populacja pacjentów uczestniczących w każdym z tych badań obejmowała osoby, u
których na początku badania rozpoznano AIDS, zespół związany z AIDS (AIDS
related complex, ARC) oraz osoby bezobjawowe. Progresję choroby zdefiniowano
jako przejście do AIDS, nowe zdarzenie w przebiegu AIDS lub zgon.
Badanie składowe ACTG 116A HIV-1 RNA obejmowało 186 pacjentów
pochodzących z badania klinicznego, u których w chwili włączenia do badania
pobrano próbki osocza oraz PBMC, a następnie przechowywano je w odpowiedni
sposób; ponadto próbki te musiały być dostępne dla analizy. Badanie składowe
ACTG 116B/117 HIV-1 RNA obejmowało 99 wybranych losowo pacjentów
pochodzących z badania leku, u których w chwili włączenia do badania pobrano
próbki osocza, a następnie przechowywano je w odpowiedni sposób; ponadto
próbki te musiały być dostępne dla analizy.
Niedostosowane i dostosowane hazardy względne dla progresji choroby, które
mierzono odwołując się do początkowych poziomów HIV-1 RNA, zmian poziomów
HIV-1 RNA w ciągu 8 tygodni oraz liczby komórek CD4+, oceniano za pomocą
modeli hazardów proporcjonalnych Coxa. Nieskorygowany hazard względny
reprezentuje ryzyko związane tylko ze zmienną, natomiast dostosowany hazard
względny reprezentuje ryzyko związane z tą zmienną po uwzględnieniu innych
zmiennych w modelu. Modele te wskazują na zwiększone ryzyko (jeżeli tylko jest
jakiekolwiek ryzyko) progresji choroby w związku ze zmiennymi wprowadzonymi
do modelu. Analizy te przeprowadzono oceniając hazardy względne dla 5-krotnej
różnicy wartości badanej zmiennej. Wyniki analiz przedstawiono w tabelach 8-11.
Dane, które się w nich znajdują, wskazują, że w populacji pacjentów
z zaawansowaną chorobą wywoływaną przez HIV, otrzymujących swoiste leczenie
przeciwko odwrotnej transkryptazie, 5-krotne zwiększenie początkowych
poziomów HIV-1 RNA wiąże się ze zwiększeniem ryzyka progresji choroby.
U pacjentów, którzy otrzymywali wcześniej ZDV dłużej niż przez 16 tygodni
(uczestnicy badania ACTG 116B/117), 5-krotne zwiększenie początkowych
poziomów HIV-1 RNA nie miało statystycznie znamiennej wartości
prognostycznej. U pacjentów, którzy wcześnie nie otrzymywali ZDV lub ich
leczenie za pomocą ZDV trwało nie dłużej niż 16 tygodni, 5-krotne zwiększenie
poziomów RNA pomiędzy początkiem badania a 8 tygodniem posiadało
statystycznie znamienną wartość prognostyczną. U pacjentów, którzy otrzymywali
39/52
wcześniej ZDV dłużej niż 16 tygodni, nie udowodniono, aby 5-krotne zwiększenie
poziomów RNA pomiędzy początkiem badania a 8 tygodniem posiadało
statystycznie znamienną wartość prognostyczną.
Częstość występowania progresji choroby analizowano także dla każdego badania,
dzieląc każdą populację badaną na decyle, jak kwalifikator wykorzystując
początkowy poziom HIV-1 RNA. Dla poszczególnych decyli oceniono częstość
progresji choroby. W każdym badaniu stwierdzono, że częstość występowania
progresji choroby wynosiła 60% dla wszystkich pacjentów, u których początkowy
poziom HIV-1 RNA przekraczał 250 000 kopii/ml. W badaniu 116A stwierdzono,
że częstość progresji u pacjentów znajdujących się w pierwszych 4 decylach
(< 11 912, < 34 661, < 72 438 i < 103 806 HIV-1 RNA kopii/ml) wynosiła 35%.
W kolejnych trzech decylach (< 15 695, < 194 312 i < 247 229) częstość
występowania progresji wynosiła pomiędzy 40% a 50%. W ostatnich trzech
decylach, w których poziom HIV-1 RNA wynosił > 250 000 HIV-1 RNA kopii/ml,
częstość występowania progresji choroby przekraczała 60%. W badaniu 116B/117
stwierdzono, że częstość występowania progresji choroby była bardziej zmienna,
lecz nadal wykazywała ogólny trend do większego ryzyka progresji u osób
z większymi poziomami HIV-1 RNA. W badaniu tym odsetek progresji wynosił
przeciętnie 30% (zakres = 10-60%) w pierwszych 6 decylach (< 11 571,
< 31 292, < 49 743, < 62 132, < 97 781 i < 150 866). Dla kolejnych dwóch decyli
(< 251 627 i < 403 146) odsetek progresji zwiększał się odpowiednio do 50% lub
60%. Dla ostatnich dwóch decyli (< 794 027 i < 1 456 302), w których poziom
HIV-1 RNA był większy niż 403 000, odsetek progresji przekraczał 80%. Na
rysunkach 7 i 8 przedstawiono tabele zbiorcze oraz wykresy słupkowe dla
powyższych analiz.
Pomiar odpowiedzi na leczenie
przeciwko retrowirusom
Zastosowanie testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR w celu pomiaru
skuteczności leczenia przeciwretrowirusowego oceniono w badaniu klinicznym
leków przeciwko retrowirusom, w tym inhibitora odwrotnej transkryptazy,
zalcytabiny (ddC, nazwa handlowa HIVID), inhibitora proteazy, sakwinawiru
(SAQ, nazwa handlowa INVIRASE), oraz połączeń tych dwóch leków. Badanie
NV14256 miało charakter badania z randomizacją, fazy III, z podwójną ślepą
próbą, którego pierwotnym celem była ocena bezpieczeństwa, tolerancji oraz
skuteczności trzech sposobów leczenia (ddC, SAQ oraz SAQ z ddC), w oparciu
o kliniczne punkty końcowe u pacjentów przerywających (lub takich, którzy nie
mogli stosować) leczenie za pomocą zydowudyny (ZDV). Ponadto zamierzano
porównać przeżycia pomiędzy trzema badanymi grupami (w tym zgony po
zdarzeniu związanym z AIDS oraz toksyczność ograniczającą wielkość dawki).
W badaniu NV14256 wcześniejsze leczenie za pomocą ZDV stanowiło kryterium
włączenia; większość pacjentów otrzymywała wcześniej ZDV przez co najmniej
1 rok. Ogółem do badania NV14256, w 49 ośrodkach, włączono 970 pacjentów.
W badaniu zaplanowano następujące trzy grupy pacjentów: ddC (325), sakwinawir
(327) oraz sakwinawir + ddC (318). Charakterystyka demograficzna oraz początkowa
pacjentów uczestniczących w badaniu NV14256 odzwierciedlała zróżnicowanie
populacji pacjentów z zaawansowanym zakażeniem HIV-1, otrzymujących wcześniej
szeroki zakres leczenia przeciwretrowirusowego.
Przydatność testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR do pomiaru skuteczności
leczenia w czasie oceniono analizując medianę zmiany poziomu HIV-1 RNA
pomiędzy wartością początkową a uśrednioną różnicą w czasie (DAVGt – średnia
zmiana pomiędzy wartością początkową, a wartością po liczbie t tygodni). W celu
oceny zdolności testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR do detekcji zmian
w poziomach HIV-1 RNA w wyniku leczenia, analizowano medianę zmiany od
wartości początkowej w czasie dla każdej badanej grupy. Na rysunku
9 przedstawiono medianę zmiany od wartości początkowej dla każdej badanej
grupy w badaniu NV14256 w ciągu 48 tygodni. Zaobserwowano możliwe do
zmierzenia i trwałe zmniejszenie poziomów HIV-1 RNA, oznaczone za pomocą
testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR. Największą i najbardziej trwałą zmianę
40/52
HIV-1 MONITOR
poziomów HIV-1 RNA dla każdego punktu czasowego stwierdzono u pacjentów
otrzymujących leczenia wielolekowe (SAQ + ddC).
Przydatność seryjnych pomiarów HIV-1 RNA do oceny odpowiedzi
wirusologicznej na leczenie przeciwko retrowirusom zbadano również stosując
model hazardów proporcjonalnych Coxa. W analizie tej połączono trzy badane
grupy oraz dostosowano model Coxa stratyfikowany ze względu na grupy
terapeutyczne; jako wyrażenia liniowe wykorzystano następujące współzmienne:
log10(początkowy HIV-1 RNA), log10(ostatni HIV-1 RNA), początkowy CD4
i ostatni CD4. W modelu tym ustalono współczynnik hazardu jako 10-krotne
zwiększenie HIV-1 RNA lub zmniejszenie o 100 liczby CD4. Tak, jak
przedstawiono w tabeli 12, współczynnik log10(ostatni HIV-1 RNA) wyrażenia
dla tego modelu jest znamienny statystycznie i dodatni do 40 tygodnia. Zgodnie
z tym, współczynniki hazardu HIV-1 RNA do 40 tygodnia wskazują, że poziomy
HIV-1 RNA w każdym punkcie czasowym charakteryzują się znamiennością
statystyczną i posiadają ciągłą wartość prognostyczną.
W analizie zależnej danych oceniono związek pomiędzy poziomami HIV-1 RNA
a czasem przeżycia. Dla potrzeb tej analizy czas przeżycia określono jako czas
w badaniu, podczas którego u pacjenta nie wystąpiły zdarzenia związane z AIDS
lub zgon. Analizy wykonano wykreślając krzywe przeżycia Kaplana i Meiera dla
każdej badanej grupy, dzieląc populację pacjentów w każdej grupie na trzy części
w oparciu o poziomy HIV-1 RNA (mniejszy, średni, większy). Krzywe przeżycia
wykreślono jako funkcję odsetka przeżycia ADE dla każdej grupy pacjentów
(mniejszy, średni, większy poziom HIV-1 RNA) dla liczby tygodni po 8 tygodniu.
Szacunkowe analizy przeżycia Kaplana i Meiera wykazują, że pacjenci z małymi
poziomami HIV-1 RNA mają większe prawdopodobieństwo przeżycia bez ADE
przez dłuższy czas w porównaniu z pacjentami z dużymi poziomami HIV-1 RNA.
Na rysunkach 10, 11 i 12 przedstawiono krzywe Kaplana i Meiera dla każdej
badanej grupy.
W oddzielnej analizie danych pochodzących z badania NV14256, ryzyko ADE oraz
zgonu oceniono jako funkcję ostatniego (wykonanego jako ostatni) pomiaru poziomu
HIV-1 RNA w różnych tygodniach trwania badania. W szczególności oceniano
wpływ ostatniego pomiaru HIV-1 RNA na hazard wystąpienia pierwszego ADE lub
zgonu (w oparciu o zdarzenia kliniczne obserwowane później w badaniu). Analizę
przeprowadzono za pomocą analizy przeżycia w modelu Cox, wykorzystując jako
współzmienne log10(początkowy HIV-1 RNA), log10(ostatni HIV-1 RNA),
początkową CD4 oraz ostatnią CD4. Model miał charakter funkcji liniowej
współzmiennych wskazujących log hazardu (współczynnika) dla ADE. Następnie
wykorzystano funkcję liniową do ustalenia wskaźnika ryzyka dla wszystkich
uczestników badania. Pacjenci, u których przez 4 tygodnie trwania badania nie
stwierdzono ADE, zostali uporządkowani zgodnie z wskaźnikiem ryzyka; pierwsza
grupa 25% uczestników utworzyła grupę „małego ryzyka”, natomiast pozostałych
pacjentów równo rozdzielono, przydzielając ich do sześciu oddzielnych grup,
zgodnie z wskaźnikiem ryzyka. Każda spośród tych sześciu grup została następnie
porównana z grupą małego ryzyka za pomocą modelu przeżycia; wykreślono średni
poziom HIV-1 RNA dla każdej spośród grup w porównaniu ze współczynnikiem
hazardu dla ADE obliczonym za pomocą cząstkowego modelu wykładniczego. Na
rysunkach 13 i 14 przedstawiono współczynniki hazardu dla czasu do pierwszego
ADE w porównaniu z log10(ostatni HIV-1 RNA) dla pacjentów, u których w ciągu
4 tygodni nie stwierdzono ADE oraz pacjentów, u których w ciągu 16 tygodni nie
stwierdzono ADE. Powyższe dane wskazują, że uczestniczący w tym badaniu
pacjent, posiadający w 4 tygodniu poziom HIV-1 RNA wynoszący 100 000 kopii/ml
(log10 = 5,0) charakteryzował się 6-krotnie większym prawdopodobieństwem
wystąpienia ADE lub zgonu niż pacjent, którego poziom HIV-1 RNA wynosił 8 000
kopii/ml. Pacjent uczestniczący w tym badaniu, który 16 tygodniu posiada poziom
HIV-1 RNA wynoszący 1 000 000 (log10 = 6,0), charakteryzował się 20-krotnie
większym prawdopodobieństwem wystąpienia ADE lub zgonu niż pacjent, które
poziom HIV-1 RNA wynosił 8000 kopii/ml.
41/52
Dane przedstawione tutaj, dotyczące przydatności klinicznej oraz zastosowania
testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR do monitorowania skuteczności leczenia
przeciwretrowirusowego uzyskano z jednego badania klinicznego, w którym
porównywano dwa leki oraz trzy sposoby leczenia szczególnej grupy chorych.
Z uwagi na to, że jedno badanie kliniczne może niedokładnie wykazywać
przydatność kliniczną ilościowego oznaczania HIV-1 RNA we wszystkich
populacjach pacjentów, we wszystkich sytuacjach klinicznych, lub ze wszystkimi
sposobami leczenia przeciwretrowirusowego, należy zachować właściwą
ostrożność przed objęciem dowolnego pacjenta interpretacją danych z tego
badania. Podobnie jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki testu
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR należy interpretować z uwzględnieniem
wszystkich wyników badań klinicznych i laboratoryjnych.
Tabela 8
Zależność pomiędzy badaną zmienną na początku badania a progresją choroby – badanie ACTG 116A
(N = 153 pacjenti, 73 przypadków progresji)
Nieskorygowany hazard względny
(95% Cl)
Skorygowany hazard względny
(95% Cl)
Wartość p2
Zmienna
Liczba kopii log HIV-1 RNA1
1,58 (1,20 - 2,09)
1,44 (1,07 - 1,93)
0,02
Log CD4+ liczba komórek1
0,39 (0,28 - 0,54)
2,00 (1,22 - 3,27)
0,95 (0,59 - 1,53)
0,45 (0,31 - 0,64)
1,39 (0,82 - 2,37)
1,12 (0,68 - 1,84)
0,0001
0,22
0,66
Rozpoznania AIDS na początku
Leczenie z ddl
1 - Hazard względny jest to współczynnik ryzyka wynikający z 5-krotnego zwiększenia HIV-1-RNA lub
zmniejszenia liczby komórek CD4+
2 - Wartości p są dla wartości skorygowanego ryzyka względnego
Tabela 9
Zależność pomiędzy zmianą HIV-1 RNA od wartości początkowej do wartości w 8 tygodniu a progresją
choroby – badanie ACTG 116A
(N = 114 pacjentów, 62 przypadki progresji)
(95% Cl)
Zmienna
(95% Cl)
Wartość p2
1,46 (1,11 - 1,93)
1,63 (1,16 - 2,28)
0,0005
Zmiana log HIV-1 RNA od wartości
początkowej do 8. tygodnia1
Leczenie z ddl
1,18 (0,93 - 1,48)
1,54 (1,09 - 2,16)
0,013
0,43 (0,30 – 0,62)
1,83 (1,09 - 3,09)
0,76 (0,45 - 1,27)
0,50 (0,34 - 0,73)
1,28 (0,74 - 2,21)
0,87 (0,51 - 1,49)
0,0004
0,38
0,61
1 - Hazard względny to współczynnik hazardu wynikający z 5-krotnego zwiększenia HIV-1-RNA lub
2 - Wartości p są dla wartości skorygowanego ryzyka względnego
Tabela 10
Zależność pomiędzy badanymi zmiennymi na początku badania a progresją
choroby – badanie ACTG 116B/117
(N = 86 pacjentów, 39 przypadków progresji)
(95% Cl)
Zmienna
(95% Cl)
Wartość p2
1,90 (1,28 - 2,82)
1,25 (0,81 - 1,94)
0,32
0,28 (0,16 - 0,48)
3,13 (1,66 - 5,92)
0,89 (0,47 - 1,69)
0,33 (0,18 - 0,62)
2,38 (1,24 - 4,58)
0,88 (0,46 - 1,71)
0,0006
0,01
0,71
Leczenie z ddl
2 - Wartości p są dla wartości skorygowanego hazardu względnego
42/52
HIV-1 MONITOR
Tabela 11
Zależność pomiędzy zmianą HIV-1 RNA od wartości początkowej do wartości w 8 tygodniu a progresją
choroby – badanie ACTG 116B/117
(N = 65 pacjentów, 29 przypadków progresji)
Nieskorygowany hazard względny Skorygowany hazard względny
(95% Cl)
(95% Cl)
Wartość p2
Zmienna
2,10 (1,32 - 3,34)
Zmiana log HIV-1 RNA od wartości
początkowej do 8. tygodnia1
Leczenie z ddl
1,41 (0,71 - 2,79)
1,58 (0,68 - 3,68)
0,29
0,25 (0,13 – 0,46)
2,43 (1,17 - 5,05)
1,07 (0,51 - 2,27)
0,29 (0,14 - 0,60)
1,87 (0,88 - 3,97)
0,98 (0,39 - 2,48)
0,001
0,10
0,96
1,58 (0,93 - 2,69)
0,09
2 - Wartości p są dla wartości skorygowanego hazardu względnego
Rysunek 7
Częstość występowania progresji choroby w zależności od początkowego
poziomu HIV-1 RNA – badanie 116A
Progresja choroby w porównaniu z początkowym poziomem HIV-1 RNA
Progresja choroby (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
<2 162 193
<775 841
<417 316
<247 229
<194 312
<150 695
<103 806
<72 438
<34 661
<11 912
0
Początkowy poziom HIV-1 RNA (kopie/ml)
Numer rejestru
Decyl
n=
Liczba progresji
Liczba progresji do AIDS/zgon
%
18
36
54
72
90
108
126
144
162
179
< 11 912
< 34 661
< 72 438
< 103 806
< 150 695
< 194 312
< 247 229
< 417 316
< 775 841
< 2 162 193
18
18
18
18
18
18
18
18
18
17
15
14
17
14
16
16
14
16
17
14
5
5
6
5
7
8
6
10
12
9
33,33
35,71
35,29
35,71
43,75
50,00
42,86
62,50
70,59
64,29
43/52
Rysunek 8
Częstość występowania progresji choroby w zależności od początkowego
poziomu HIV-1 RNA – badanie 116B/117
Progresja choroby w porównaniu z początkowym poziomem HIV-1 RNA
Progresja choroby (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
< 1 456 302
< 794 027
< 403 146
< 251 627
< 150 866
< 97 781
< 62 132
< 49 743
< 31 292
< 11 571
0
Początkowy poziom HIV-1 RNA (kopie/ml)
Numer rejestru
Decyl
n=
Liczba progresji
Liczba progresji do AIDS/zgon
%
10
20
30
40
50
60
70
80
90
96
< 11 571
< 31 292
< 49 743
< 62 132
< 97 781
< 150 866
< 251 627
< 403 146
< 794 027
< 1 456 302
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6
4
2
3
6
1
3
5
6
9
5
40,00
20,00
30,00
60,00
10,00
30,00
50,00
60,00
90,00
83,33
Rysunek 9
Mediany zmian HIV-1 RNA od wartości początkowych w ciągu
48 tygodni – badanie NV14256
Tydzień 4
n1 = 98
n2 = 91
n3 = 92
Tydzień 8
n1 = 90
n2 = 85
n3 = 91
Tydzień 12
n1 = 89
n2 = 88
n3 = 85
Tydzień 16
n1 = 93
n2 = 81
n3 = 86
Tydzień 24
n1 = 86
n2 = 83
n3 = 84
Tydzień 32
n1 = 71
n2 = 73
n3 = 79
Tydzień 40
n1 = 63
n2 = 71
n3 = 69
Tydzień 48
n1 = 52
n2 = 62
n3 = 56
Tydzień 40
Tydzień 48
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
Tydzień 4 Tydzień 8 Tydzień 12 Tydzień 16
ZDV+ddC
44/52
Tydzień 24
Tydzień 32
SAQ 600mg+ZDV
SAQ 600mg+ZDV+ddC
HIV-1 MONITOR
Tabela 12
Ryzyko ADE w porównaniu z Log10(ostatni RNA) oraz innymi współczynnikami w oparciu
o czas od danego tygodnia badania dla pacjentów przeżywających ten tydzień
Podsumowanie wyników modelu Coxa – Model stratyfikowany zgodnie z badanymi
grupami – badanie NV14256
Tydzień badania
4
8
16
24
32
40
48
56
64
Zmienna
Współczynnik modelu Coxa
Wskaźnik hazardu*
Wartość p
log10(początkowy RNA)
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Początkowy CD4
Ostatni CD4
0,798
0,4197
-0,0009
-0,0040
0,8096
0,4186
-0,0019
-0,0049
0,8714
0,5385
-0,0015
-0,0049
0,6910
0,7135
-0,0003
-0,0064
0,5926
0,9000
-0,0040
-0,0023
0,8003
0,7086
-0,0030
-0,0031
0,5993
0,5631
-0,0011
-0,0079
1,0917
0,0835
-0,0022
-0,0072
1,2803
-0,2500
0,0006
-0,0085
2,22
1,52
0,91
0,67
2,25
1,52
0,83
0,62
2,39
1,71
0,87
0,62
2,00
2,04
0,97
0,53
1,81
2,46
0,67
0,79
2,23
2,03
0,74
0,73
1,82
1,76
0,89
0,45
2,98
1,09
0,80
0,49
3,60
0,78
1,07
0,43
0,0012
0,0219
0,5806
0,0084
0,0004
0,0138
0,2107
0,0006
0,005
0,0046
0,3510
0.0010
0,0136
0,0017
0,8667
0.0001
0,0492
0,0003
0,0252
0,1523
0,0159
0.0096
0,1282
0,0955
0,0978
0,0629
0,6168
0,0016
0,0127
0,8025
0,4560
0,0201
0,0135
0,4988
0,8531
0,0213
* Współczynnik hazardu z powodu 10-krotnego zwiększenia HIV-1 RNA lub zmniejszenia liczby CD4 o 100.
Rysunek 10
Szacunkowe przeżycia (metoda Kaplana i Meiera) – grupa badania NV14256: SAQ 600 mg
Pacjenci przeżywający bez ADE 8 tygodni
Przeżycie ADE (%)
Ostatni poziom RNA: tydzień 8
Dolna jedna trzecia
Środkowa jedna trzecia
Górna jedna trzecia
Tygodni po 8. tygodniu
45/52
Rysunek 11
Szacunkowe przeżycia (metoda Kaplana i Meiera) – grupa badania NV14256: ddC
Przeżycie ADE (%)
Ostatni poziom RNA:
tydzień 8
Dolna jedna trzecia
Rysunek 12
Szacunkowe przeżycia (metoda Kaplana i Meiera) – grupa badania NV14256: ddC + SAQ 600 mg
Przeżycie ADE (%)
Ostatni poziom RNA: tydzień 8
Dolna jedna trzecia
46/52
HIV-1 MONITOR
Rysunek 13
Współczynnik hazardu dla czasu pierwszego ADE – Pacjenci przeżywający bez ADE
4 tygodnie – badanie NV14256
Wskaźnik ryzyka
21
16
11
6
1
3,8
4,2
4,6
5,0
5,4
5,8
log10 (ostatni RNA)
Rysunek 14
Współczynnik hazardu dla czasu pierwszego ADE – Pacjenci przeżywający bez ADE
16 tygodni – badanie NV14256
Wskaźnik ryzyka
21
16
11
6
1
3,8
4,2
4,6
5,0
5,4
5,8
log10 (ostatni RNA)
47/52
Piśmiennictwo
1.
Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F. 1983. Isolation of
a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired
immunodeficiency syndrome. Science 220:868-871.
2.
Popovic, M., Sarngadharan, M.G., Read, E., et al. 1984. Detection, isolation
and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from
patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224:497-500.
3.
Gallo, R.C., Salahuddin, S.Z., Popovic, M., et al. 1984. Frequent detection
and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS
and at-risk for AIDS. Science 224:500-502.
4.
Curran, J.W., Jaffe, H.W., Hardy, A.M., et al. 1988. Epidemiology of HIV
Infection and AIDS in the United States. Science 239:610-616.
5.
Gaines, H., von Sydow, M.A., von Stedingk, L.V. 1990. Immunological
changes in primary HIV-1 infection. AIDS 4:995-999.
6.
Tindall, B., and Cooper, D.A. 1991. Primary HIV-1 infection: host responses
and intervention strategies. AIDS 5:1-14.
7.
Daar, E.S., Moudgil, T, Meyer. R.D., et al. 1991. Transient high levels of
viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1
infection. New England Journal of Medicine 324:961-964.
8.
Clark, S.J., Saag, M.S., Decker, W.D. 1991. High titers of cytopathic virus in
plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New England
Journal of Medicine 324:954-960.
9.
Albert, J., Abrahamsson, B., Nagy, K. 1990. Rapid development of isolatespecific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent
emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera.
AIDS 4:107-112.
10. Hornsburgh, C.R., Jason, J., Longini, I.M., et al. 1989. Duration of human
immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet
26:637-640.
11. Schnittman, S.M., Psallidopoulos, M.C., Lane, H.C., et al. 1989. The
reservoir for HIV-1 in human peripheral blood is a T cell that maintains
expression of CD4. Science 245:305-308.
12. Schnittman, S.M., Greenhouse, J.J., Psallidopoulos, M.C. 1990. Increasing
viral burden in CD4+ T cells from patients with human immunodeficiency
virus (HIV) infection reflects rapidly progressive immunosuppression and
clinical disease. Annals of Internal Medicine 113:438-443.
13. Pantaleo, G., Graziosi, C., Fauci, A.S. 1993. New concepts in the
immunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection.
New England Journal of Medicine 328:327-335.
48/52
HIV-1 MONITOR
14. Piatak, N., Saag, M.S., Yang, L.C., et al. 1993. High levels of HIV-1 in
plasma during all stages of infection determined by competitive PCR.
Science 259:1749-1754.
15. Fauci, A.S., Schnittman, S.M., Poli, G., et al. 1991. NIH conference:
immunopathogenic mechanisms in human immunodeficiency virus (HIV)
infection. Annals of Internal Medicine 114:678-693.
16. Coffin, J.M. 1995. HIV-1 population dynamics in vivo: Implications for
genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science 267:483-489.
17. Ho, D.D., Neumann, A.U., Perelson, A.S., et al. 1995. Rapid turnover of
plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 373:123-126.
18. Wei, X., Ghosh, S.K., Taylor, M.E., et al. 1995. Viral dynamics in human
immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 373:117-122.
19. O’Brien, W.A., Hartigan, P.M., Martin, D. et al. 1996. Changes in plasma
HIV-1 RNA and CD4 lymphocyte counts and the risk of progression to
AIDS. New England Journal of Medicine 334:426-431
20. Welles, S.L., Jackson, J.B., Yen-Leiberman, B., et al. 1996. Prognostic value
of plasma Human Immunodeficiency Virus Type I (HIV-1) RNA levels in
patients with advanced HIV-1 disease and with little or no zidovudine
therapy. Journal of Infectious Diseases 174:696-703.
21. Coombs, R.W., Welles, S.L., Hooper, C., et al. 1996. Association of plasma
Human Immunodeficiency Virus Type I RNA level with risk of clinical
progression in patients with advanced infection. Journal of Infectious
Diseases 174:704-712.
22. Hammer, S., Crumpacker, C., D’Aquila, R., et al. 1993. Use of virologic
assays for detection of human immunodeficiency virus in clinical trials:
Recommendations of the AIDS Clinical Trials Group Virology Committee.
Journal of Clinical Microbiology 31:2557-2564.
23. Schochetman, G., George, J.R., ed. AIDS testing: a comprehensive guide to
technical, medical, social, legal and management issues. 2nd ed. New York:
Springer-Verlag, 1994.
24. Mulder, J. McKinney, N., Christopherson, C., et al. 1994. Rapid and simple
PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in
plasma: Application to acute retroviral infection. Journal of Clinical
Microbiology 32:292-300.
25. Dewar, R.L., Highbarger, H.C., Sarmiento, M.B., et al. 1994. Application of
branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency
virus type 1 burden in human plasma. Journal of Infectious Diseases
170:1172-1179.
26. van Gemen, B., Kievits, T., Schukkink, R., et al. 1993. Quantification of
HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1 primary infection.
Journal Virological Methods 43:177-188.
49/52
27. Saiki, R.K. Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of
β−globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of
Sickle Cell Anemia. Science 230:1350-1354.
28. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., et al. 1988. Primer-directed enzymatic
amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science
239:487-491.
29. Mullis, K.B., Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335-350.
30. Myers, T.W., and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA
amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry
30:7661-7666.
31. Kwok, S., Sninsky, J.J. 1993. PCR detection of human immunodeficiency
virus type 1 proviral DNA sequences. In: Diagnostic Molecular Biology:
Principles and Applications. eds. Persing, D.H., Smith, T.F., Smith, F.C., et
al. ASM, Washington, D.C.
32. Longo, M.C., Berninger, M.S., Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain
reactions. Gene 93:125-128.
33. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
34. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory
Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline–Third
Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA: CLSI, 2005.
35. International Air Transport Association Dangerous Goods Regulations, 41st
Edition. 2000. 704 pp.
36. Holmes, H., Davis, C., Heath, A., et al. 2001. An international collaborative
study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in
nucleic acid-based techniques. Journal Virological Methods 92:141-150.
37. Yen-Lieberman, B., Brambilla, D., Jackson, B. et al. 1996. Evaluation of a
quality assurance program for quantitation of Human Immunodeficiency
Virus Type 1 RNA in plasma by the AIDS Clinical Trials Group Virology.
Journal of Clinical Microbiology 34:2695-2701.
38. Dale, J., Dondero, T.J., Rayfield, M.A. et al. 1996. The emerging genetic
diversity of HIV. JAMA 275:210-216.
39. Gao, F., Morrison, S.G., Robertson, D.L. et al. 1996. Molecular cloning and
analysis of functional envelope genes from Human Immunodeficiency Virus
Type 1 sequence subtypes A through G. Journal of Virology 70:1651-1667.
40. Layne, S.P., Merges, M.J., Dembo, M. et al. 1992. Factors underlying
spontaneous inactivation and susceptibility to neutralization of Human
Immunodeficiency Virus. Virology 189:695-714.
50/52
HIV-1 MONITOR
41. Louwagie, J.J., McCutchan, F., Brennan, T. et al. 1993. Phylogenetic analysis
of gag genes from seventy international HIV-1 isolates provides evidence for
multiple genotypes. AIDS 7:769-780.
42. Louwagie, J.J., Delwart, E.L., Mullins, J.I. et al. 1994. Genetic analysis of
HIV-1 isolates from Brazil reveals presence of two distinct genetic subtypes.
AIDS Research and Human Retroviruses 10:561-567.
43. Louwagie, J.J., Janssens, W., Mascola, J.J. et al. 1995. Genetic diversity of
the envelope glycoprotein from Human Immunodeficiency Virus Type 1
isolates of African origin. Journal of Virology 69:263-271.
44. Mascola, J.J., Louwagie, J.J., McCutchan, F.E. et al. 1993. Two antigenically
distinct subtypes of human immunodeficiency virus type 1: viral genotype
predicts neutralization serotype. Journal of Infectious Diseases 169:48-54.
45. McCutchan, F.E., Hegerich, P.A., Brennan, T.P. et al. 1992. Genetic variants
of HIV-1 in Thailand. AIDS Research and Human Retroviruses 8:1887-1895.
46. Michael, N. The Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C.
Personal communication.
47. Carr, J.K., Salminen, M.O., Albert, J. et al. 1998. Full genome sequences of
human immunodeficiency virus type 1 subtypes G and A/G intersubtype
recombinants. Virology. 247:22-31.
48. Carr, J.K., Salminen, M.O., Koch, C. et al. 1996. Full-length sequence and
mosaic structure of a human immunodeficiency virus type 1 isolate from
Thailand. Journal of Virology 70:5935-5943.
49. McCutchan, F.E., Artenstein, A.W., Sanders-Buell, E. et al. 1996. Diversity
of the envelope glycoprotein among human immunodeficiency virus type 1
isolates of clade E from Asia and Africa. Journal of Virology 70:3331-3338.
50. McCutchan, F.E., Ungar, B.L., Hegerich, P. et al. 1992. Genetic analysis of
HIV-1 isolates from Zambia and an expanded phylogenetic tree for HIV-1.
Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome 5:441-449.
51. Porter, K.R., Mascola, J.R., Hupudio, H. et al. 1997. Genetic, antigenic and
serologic characterization of human immunodeficiency virus type 1 from
Indonesia. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human
Retrovirology 14:1-6.
52. Salminen, M.O., Johansson, B., Sonnerborg, A. et al. 1996. Full-length
sequence of an ethiopian human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) isolate
of genetic subtype C. AIDS Research and Human Retroviruses. 12:1329-1339.
51/52
"
Distributed by
Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ 08876 USA
Członek Grupy Roche
Roche Diagnostics
Indianapolis, IN 46256 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics
H7V 4A2 Laval, Quebec
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics
F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH
D-68298 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics SpA
Piazza Durante 11
I-20131 Milano
Roche Diagnostics S.L.
E-08006 Barcelona
Distribuidor em Portugal:
Roche Farmacêutica Química, Lda
P-2700 Amadora
ROCHE, COBAS, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPERASE, AMPLIPREP,
TAQMAN, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, FORTOVASE, HIVID i INVIRASE
są znakami towarowymi firmy Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche.
CRIXIVAN® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Merck & Co., Inc.
Dynabeads® cząsteczki paramagnetyczne są wykorzystywane na zasadzie licencji dla
patentu posiadanego przez firmę Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia.
Dynabeads® jest zarejestrowanym znakiem towarowym Dynal Biotech ASA, Oslo,
Norwegia, licencjonowanym dla Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis,
Indiana.
Eppendorf Multipette® i Eppendorf Combitip® są zarejestrowanymi znakami
towarowymi firmy Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy.
EPIVIR® i ZIAGEN®
GlaxoSmithKline.
są
zarejestrowanymi
znakami
towarowymi
firmy
NORVIR® jest zarejestrowanym znakiem towarowym Abbott Laboratories.
ProClin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym Rohm and Haas Company.
SUSTIVA® jest zarejestrowanym
Pharmaceuticals Company.
znakiem
towarowym
firmy
DuPont
VIRAMUNE® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Roxane
Laboratories, Inc.
Copyright 2007. Roche Molecular Systems, Inc.
Wszelkie prawa zastrzeżone.
6/2007
(00058003436-05ENGL)
04497856001-03
52/52

Przeznaczenie

Transkrypt

Podobne dokumenty

QConnect™ HIVNAT Kontrola pozytywna

Listy do Redakcji • Letters

Kontrola QConnect™ HIVp24 - Thermo Fisher Scientific

AcroMetrix™ Kontrola o wysokiej zawartości HIV-1

AcroMetrix™ Kontrola o niskiej zawartości HIV-1

6.2 Część VI.2 Podsumowanie planu zarządzania ryzykiem