„Globalna analiza regulatorowych miejsc RNA rozpoznawanych

Nr wniosku: 149550, nr raportu: 12716. Kierownik (z rap.): dr hab. Krzysztof Sobczak
„Globalna analiza regulatorowych miejsc RNA rozpoznawanych przez czynnik
splicingowy MBNL1 - Implikacje dla patomechanizmu dystrofii miotonicznej (DM)”
Białka należące do rodziny MBNL są regulatorami metabolizmu cząsteczek RNA i uczestniczą
w potranskrypcyjnej modulacji ekspresji setek genów. W prawidłowym rozwoju wielu tkanek,
takich jak mięśnie szkieletowe, mięsień sercowy i mózg, uczestniczą w tworzeniu
alternatywnych produktów genów na drodze stymulacji lub represji alternatywnego splicjingu i
alternatywnej poliadenylacji cząsteczek prekursorowych pre-mRNA oraz decydują o stabilizacji
i lokalizacji subkomórkowej cząsteczek mRNA. Aby pełnić swoją funkcję białka te wiążą się do
specyficznych miejsc w RNA. Wcześniej stwierdzono, że jest to motyw sekwencyjny (YGCY,
gdzie Y to dowolna pirymidyna). Nie zostały jednak określone wymagania strukturalne jakie
musi spełnić region RNA, aby mógł być specyficznie rozpoznany przez te białka. Wcześniejsze
badania dowiodły również, że niedobór tych białek wpływa na wywołanie stanów
patologicznych. W dystrofii miotonicznej (DM), która jest dość częstą chorobą genetyczną
objawiającą się głównie zmianami patologicznymi tkanki mięśniowej, dochodzi do ekspansji
powtórzeń trójnukleotydowych CTG w genie DMPK. Produktem zmutowanego genu jest
mRNA, który zawiera w regionie 3’UTR długi region powtórzeń CUG (CUGexp) wykazujący
bardzo wysokie powinowactwo do białek MBNL. Okazało się, że w DM dochodzi do bardzo
wydajnej sekwestracji tych białek na CUGexp a w konsekwencji funkcjonalnego niedoboru
MBNL do zaburzeń metabolizmu setek jądrowych i cytoplazmatycznych cząsteczek RNA.
Głównym celem niniejszego projektu było zarówno określenia i charakterystyka miejsc
wiązania MBNL w ludzkim i mysim traskryptomie, używając do tego celu wielkoskalowej
metody CLIP-Seq, poznanie konsekwencji niedoboru MBNL, prowadzących do zaburzeń
splicingowych kilku genów na kształtowanie patomechanizmu DM, ale również opracowanie
podejść terapeutycznych i diagnostycznych tej choroby.
Realizacja niniejszego projektu pozwoliła na lepsze poznanie natury oddziaływania białek
MBNL z RNA oraz efektu tego oddziaływania na regulację zarówno alternatywnego splicingu
jak i alternatywnej poliadenylacji, dla której po raz pierwszy wyjaśniliśmy regulacyjny
mechanizm działania MBNL. Poznaliśmy mapę miejsc w całym transkryptomie, które mogą
być specyficznie rozpoznawane przez MBNL prowadząc do wywołania określonych efektów
molekularnych. Ponadto wykazaliśmy, że nie tylko sekwencja tego miejsca, ale w znaczącym
stopniu również jego struktura przyczyniają się do efektywnego wiązania badanych białek.
Nasze badania w znaczący sposób przyczyniły się do wyjaśnienia efektów zaburzeń
alternatywnego splicingu w mięśniach szkieletowych pacjentów cierpiących na DM
wynikających z funkcjonalnego niedoboru białek MBNL. Wykazaliśmy w jaki sposób
zaburzenia splicingu konkretnych genów, głównie CELF1 i MBNL1, wpływają na kształtowanie
molekularnego patomechanizmu tej choroby. W dalszej kolejności, na podstawie precyzyjnie
wyselekcjonowanych biomarkerów, jakimi były zaburzenia alternatywnego splicingu kilkunastu
genów, opracowaliśmy efektywny i powtarzalny test molekularny pozwalający na
monitorowanie postępu choroby, ale również skutków działań testowanych terapeutyków.
Wreszcie opracowaliśmy kilka eksperymentalnych strategii terapeutycznych, znoszących
patogenne oddziaływanie MBNL z CUGexp i prowadzące do korekty zaburzeń splicingowych.
W przyszłości mogą one zostać wykorzystane w opracowaniu skutecznej strategii
terapeutycznej dedykowane pacjentom z dystrofią miotoniczną.
Wynikiem realizacji niniejszego projektu są cztery prace opublikowane w prestiżowych
czasopismach naukowych. Trzy inne prace zostały już wysłane do recenzji wydawniczej a kilka
kolejnych znajduje się w ostatniej fazie przygotowań. Uzyskane wyniki prezentowaliśmy
również w formie wykładów oraz prezentacji plakatowych na kilku międzynarodowych
konferencjach naukowych.