Tęcza w próbówce: jak dobierać barwniki sond w reakcjach multiplex?

Tęcza w próbówce: jak dobierać
barwniki sond w reakcjach
multiplex?
Jeżeli projektujecie reakcje Real-Time PCR (szczególnie pośredniego
ilościowania), warto zastanowić się nad wersją multiplex: zastosowanie
kilku par starterów i sond jest najwygodniejszym, najszybszym i
najbardziej precyzyjnym sposobem na ilościową ocenę kilku transkryptów.
Pojawia się jednak istotny problem: jakie barwniki do sond będą
najbardziej odpowiednie?
Każdy z barwników posiada specyficzne spektrum absorpcji i emisji fali
świetlnej. Fluorescencja jest skutkiem wybicia niosącego wysoką energię
elektronu z cząsteczki barwnika i emisji części pochłoniętej podczas tego procesu
energii. Cząsteczka barwnika pochłania odpowiedni kwant światła o wyższej
energii (absorpcja), a po wybiciu elektronu emituje kwant o niższej energii
(emisja). Od struktury cząsteczki i rozkładu powłok elektronowych zależy, jak
duża porcja energii musi być dostarczona- dlatego różne barwniki wymagają
odmiennych długości fali świetlnej (niosących różną energię) do wzbudzenia.
Dobór odpowiedniego zestawu barwników, których spektra emisji i absorpcji jak
najmniej się pokrywają, jest bardzo istotny: pozwala na minimalizację tła i nie
prowadzi do niespecyficznego odczytu fluorescencji. W sieci dostępne jest kilka
zestawień, które ułatwiają dokonanie wyboru, jednak w żadnym z nich nie ma
pełnej gamy barwników, oferowanej obecnie na rynku. Poniżej przedstawiam kilka
takich zestawień.
1. Multiplexing qPCR recomendations, Biosearch Technologies
Moja ulubiona aplikacja do wyboru sond. Z jednej strony mamy możliwość
przejrzenia tabeli sond oferowanych przez BT, idealnych dla danego
termocyklera, z drugiej możemy sami zestawić niemal dowolnie spektra absorpcji
i emisji dwudziestu barwników, które zostały wprowadzone do bazy aplikacji
„Spectral Overlay Chart„.
2. Qiagen Multiplex Real-Time PCR Resource Center
Qiagen opublikował na swojej stronie ciekawe poradniki dot. multiplex RQ-PCRu,
jednak najprzydatniejsza jest tabela zestawień barwników w kombinacjach pod
dany termocykler. Mamy tu większy wybór niż w przypadku tabeli BT.
3. Zestawienie sond Genomedu
Ciekawe zestawienie 74 kombinacji barwnik-quencher, porównujące chyba
wszystkie potrzebne nam parametry. Wygodna zakładka w lewym górnym rogu
pozwala „odsiać” tylko te sondy, które zawierają interesujący nas barwnik lub
quencher. Estetycznie i kolorowo.
Wybór sondy
do qPCR może być nie lada wyzwaniem, zważywszy na szeroki ich wybór na
rynku.
Jakie znaczenie ma wybór odpowiednich barwników?
Pytanie na pozór proste, wcale takie nie jest. Przede wszystkim musimy wiedzieć,
jakie kanały fluorescencji odczytuje nasz termocykler. Ta podstawowa informacja
powinna znajdować się w opcjach oprogramowania oraz w instrukcji urządzenia.
W starszych termocyklerach mieliśmy do wyboru np. tylko 2 kanały (zielony pod
FAM i SYBR i żółty pod JOE). Obecnie większość cyklerów ma możliwość odczytu
co najmniej 5 kanałów, co daje nam prawie nieograniczoną dowolność w doborze
kolorów.
Ważne są także długości fali wzbudzenia i emisji lasera naszego urządzenia.
Warto wybierać takie barwniki, których maksima absorpcji/emisji są zbliżone do
wartości zdefiniowanych w cyklerze. W tej materii przychodzą nam z pomocą
wspomniane wcześniej tabele.
Pozostaje jeszcze kwestia quencherów: skąd mamy wiedzieć, jaki „wyciszacz”
będzie najlepszy dla sond typu FRET, jeżeli mamy do wyboru kilka z nich? Żeby
odpowiedzieć sobie na to pytanie zapoznajmy się ze spektrum absorpcji
quenchera i spektrum emisji barwnika fluorescencyjnego. Idealny quencher
absorbuje na tych samych długościach fali, na których barwnik emituje.
Ostatnia z uwag dotyczących barwników: nie wszystkie barwniki są tak samo
wydajne jeśli chodzi o fluorescencję. Np. sondy oparte o FAM w porównaniu z
większością „nowoczesnych” barwników (w sondzie o tej samej sekwencji i
stęzeniu) mają ponad dwukrotnie niższą fluorescencję. Nie jest to problemem,
musimy jednak zoptymalizować tzw. „gain” w opcjach oprogramowania cyklera
(dla danego barwnika i dla danej reakcji) który pozwoli nam do pewnego stopnia
znormalizować różnice we fluorescencji różnych barwników.
Data publikacji: 14.05.2016r.