(Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS623

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human CD8
Klon C8/144B
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS623
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human CD8, klon C8/144B, Ready-to-Use, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako
Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciała dają odczyn z cytotoksycznymi/supresyjnymi limfocytami T. Są przydatne
w identyfikacji tych limfocytów jak równieŜ w nowotworowych odpowiednikach tych komórek (1). Interpretacja
kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem
odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem
historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
CD8 to glikoproteina przezbłonowa o masie cząsteczkowej 68 kDa. Wykazuje ekspresję jako heterodimer z wiązaniem
dwusiarczkowym, składający się z łańcucha α o masie 32-34 kDa oraz z łańcucha β o masie 30-32 kDa albo jako
homodimer składający się z dwóch łańcuchów α. Zarówno CD8α, jak i CD8β mają w swojej pozakomórkowej części
N-końcowej typową dla immunoglobulin zmienną domenę przypominającą region, przez co zaliczane są do nadrodziny
immunoglobulin. CD8 podlega ekspresji głównie jako heterodimer αβ w większości tymocytów oraz w dojrzałych
cytotoksycznych/supresyjnych limfocytach T naleŜących do klasy l głównego kompleksu zgodności tkankowej.
Ekspresja CD8 w postaci homodimeru αα zachodzi w części limfocytów T γδ i NK (2).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części
instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: C8/144B (1). Izotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Peptyd syntetyczny o sekwencji odpowiadającej aminokwasom z 13 C-końcowym fragmentem domeny
cytoplazmatycznej ludzkiego CD8α połączonego z tyreoglobuliną (1).
Swoistość
Analiza SDS-PAGE immunoprecypitatów wytwarzanych w reakcji między lizatami ludzkich limfoblastów T
znakowanych izotopem 125I a przeciwciałem wykazuje, Ŝe reakcja zachodzi głównie z polipeptydami o masie 32 kDa
odpowiadającymi CD8α (1).
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł‚ biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
(118315-003)
Dako Denmark A/S
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem
z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
IS623/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przygotowanie
próbek oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako
Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych
odczynników)
Autoprogram: CD8 (bez barwienia kontrastowego) lub CD8H (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku
programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy
płukania.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje
zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako
Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny
być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym
nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu
uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować migdałki, natomiast
we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej
tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse,
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750).
Interpretacja
wybarwienia
Komórki znakowane przez przeciwciała wykazują odczyn błonowy.
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: Przeciwciała dają odczyn z cytotoksycznymi/supresyjnymi limfocytami T w odpowiednich
obszarach śledziony i migdałków oraz z komórkami wyściełającymi zatoki śledziony (1). W bioptatach z
okręŜnicy/odbytu przeciwciała dają odczyn z cytotoksycznymi/supresyjnymi limfocytami T z odbytu, esicy, okręŜnicy
zstępującej, poprzecznicy i okręŜnicy wstępującej oraz z kątnicy (3). Opisywane przeciwciała dają odczyn z
naturalną cytokeratyną 15 w ludzkich keratynocytach wypukłości mieszków włosowych i w wyodrębnionym obszarze
zewnętrznej otoczki pnia w pobliŜu mięśnia włosa, nie dają natomiast odczynu z pozostałą częścią mieszka
włosowego (4). Komórki T w międzygrudkowych obszarach migdałków wykazują odczyn z zakresu od
umiarkowanego do silnego.
Tkanki patologiczne: W zapaleniu okręŜnicy wywołanym zakaŜeniem, chorobie Crohna i wrzodziejącym zapaleniu
okręŜnicy przeciwciała wykazywały znacznie większe zagęszczenie cytotoksycznych/supresyjnych limfocytów T w
miejscach dotkniętych chorobą niŜ w kontrolach prawidłowych (3). W przypadku ziarniniaka grzybiastego przeciwciała
CD8 wraz z anty-CD4 wykazywały w naskórku stosunek CD4:CD8 wyŜszy niŜ w zmianach zapalnych (5).
Piśmiennictwo
1.
Mason DY, Cordell JL, Gaulard P, Tse AGD, Brown MH. Immunohistological detection of human
cytotoxic/suppressor T cells using antibodies to a CD8 peptide sequence. J Clin Pathol 1992:45:1084-8.
2.
Nakauchi H. TC9. CD8 Workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM,
Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of
the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland
Publishing Inc.; 1997. p. 65-7.
3.
Yamagata K, Tanaka M, Kudo H. A quantitative immunohistochemical evaluation of inflammatory cells at the
affected and unaffected sites of inflammatory bowel disease. J Gastroenterol 1998;13:801-8.
4.
Lyle S, Christofidou-Solomidou M, Liu Y, Elder DE, Albelda S, Cotsarelis G. Human hair follicle bulge cells are
biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype. J Investig Dermatol Symp Proc
1999;4:296-301.
5.
Nuckols JD, Shea CR, Horenstein MG, Burchette JL, Prieto VG. Quantitation of intraepidermal T-cell subsets in
formalin-fixed, paraffin-embedded tissue helps in the diagnosis of mycosis fungoides. J Cutan Pathol
1999;26:169-75.
(118315-003)
Dako Denmark A/S
IS623/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
(118315-003)
Dako Denmark A/S
IS623/PL/MNI/2009.12.04 str. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17