Pobierz opis

Łukasz Czupkałło
„Ocena systemu RANK/RANKL/OPG w płynie dziąsłowym u kobiet w ciąży
fizjologicznej oraz pacjentek ciężarnych z chorobą przyzębia.’’
STRESZCZENIE
Choroba przyzębia jest
procesem zapalnym polegającym na destrukcji struktur
podtrzymujących zęby. Zachwianie równowagi pomiędzy biofilmem płytki bakteryjnej
i odpowiedzią immunologiczną organizmu skutkuje w nadekspresji cytokin prozapalnych
i następowej destrukcji kości. Na poziomie molekularnym, resorpcja kości regulowana
jest poprzez wzajemne oddziaływanie ligandu aktywatora receptora jądrowego NF- κ B
(RANKL) i osteoprotegeryny (OPG), czyli systemu dwóch białek należących do grupy białek
czynnika martwicy nowotworów (TNF). Odkrycia z ostatnich lat odnośnie białek RANKL
i OPG pozwoliły rozjaśnić wcześniej niewyjaśniony fenomem podstaw resorpcji kości.
Badania potwierdziły, że zarówno białko OPG, jak i RANKL mogą być wykryte
w płynie dziąsłowym, który stał się „oknem na świat” w nieinwazyjnej analizie wskaźników
stanu tkanek przyzębia, potwierdzając podwyższony poziom białka RANKL w chorobie
przyzębia, podczas gdy poziom białka OPG obniża się. Resorpcja kości zapoczątkowana jest
poprzez
związanie białka RANKL z receptorami RANK obecnymi na powierzchni
dojrzałych osteoklastów, a także ich prekursorów,
co doprowadza do różnicowania
i aktywacji osteoklastów. OPG będący inhibitorem RANKL ma skolei przeciwstawne
właściwości do RANKL, powodując obniżenie procesu osteoklastogenezy. Mimo wszystko,
dokładny mechanizm resorpcji kości nie został do tej pory wyjaśniony.
Niewiele jest doniesień naukowych dotyczących wpływu ciąży na utratę przyczepu
łącznotkankowego (CAL). Przypuszcza się, że utrata przyczepu łącznotkankowego następuje
w wyniku długotrwałego, przewlekłego zapalenia dziąseł, trwającego dłuższy okres czasu
od samej ciąży.
Celem mojej pracy jest ocena zmian białek szlaku odpowiedzialnego za proces
resorpcji kości w płynie dziąsłowym oraz surowicy krwi u kobiet w okresie ciąży
fizjologicznej, a więc bez cech zapalenia przyzębia oraz pacjentek ciężarnych z chorobą
przyzębia.
We
współpracy
z
Wojewódzką
Przychodnią
Ginekologiczno-Położniczą
w Lublinie zbadano parametry kliniczne stanu przyzębia, pobrano płyn dziąsłowy oraz krew,
a następnie określono metodą immunoenzymatyczną ELISA stężenie białek szlaku
1
RANKL/RANK/OPG. Przeprowadzono także badania biochemiczne surowicy krwi
w kierunku indykatorów stanu zapalnego w przyzębiu tj. aminotransferazy asparaginianowej
oraz fosfatazy alkalicznej.
Przeprowadzone badania stężenia białek RANKL i OPG u pacjentek ciężarnych
w ciąży fizjologicznej oraz ze stwierdzoną chorobą przyzębia miały na celu uzyskanie
odpowiedzi na pytania:
1. Czy materiał pobrany ze szczeliny dziąsłowej lub kieszonki przyzębnej może być
przydatnym materiałem diagnostycznym?
2. Czy istnieją różnice w stężeniu białek RANKL i OPG w materiale pobranym
z kieszonki dziąsłowej lub przyzębnej i surowicy krwi obwodowej?
3. Czy
istnieją
korelacje
pomiędzy
poziomami
białek
RANKL
i
OPG
w płynie ze szczeliny dziąsłowej a ich poziomami w surowicy krwi?
4. Czy istnieje różnica w stężeniu badanych białek (RANKL, OPG) w grupie
pacjentek ciężarnych cierpiących na chorobę przyzębia w stosunku do pacjentek
z ciążą fizjologiczną (bez stwierdzonego periodontitis)?
5. Jak zmieniają się wskaźniki periodontologiczne w obydwu grupach kobiet
ciężarnych?
6. Czy istnieją korelacje
pomiędzy stężeniami
cytokin OPG i
RANKL,
a parametrami periodontologicznymi stanu przyzębia w obydwu grupach?
7. Jakie inne czynniki mogą wpłynąć na poziom stężenia badanych białek?
Jak zmieniają się poziomy cytokin RANK, OPG, ALP i AST u kobiet ciężarnych
w zależności od wieku, wykształcenia czy wykonywanej pracy?
Badaniem objęto łącznie 30 kobiet będących w III trymestrze ciąży.
Kobiety były
pacjentkami Wojewódzkiej Przychodni Ginekologiczno-Położniczej przy Samodzielnym
Publicznym Szpitalu Wojewódzkim im. Jana Bożego w Lublinie. Badania zostały
przeprowadzone na dwóch grupach pacjentek:
- grupie badanej (B) utworzonej przez 12 pacjentek ciężarnych z rozpoznaną badaniem
klinicznym chorobą przyzębia,
- grupie kontrolnej (K) złożonej z 18 kobiet w okresie ciąży fizjologicznej bez uchwytnej
choroby przyzębia (periodontitis).
Spotkałem się z obiektywnymi trudnościami z uzyskaniem materiału do badań
od pacjentek ciężarnych. W mojej pracy doktorskiej zdecydowałem się na wykorzystanie
2
komórek płynu dziąsłowego i surowicy krwi. Procedura pobrania płynu dziąsłowego jest
nieinwazyjna, prosta i tania w wykonaniu, w związku z tym jest przydatną metodą uzyskania
materiału
komórkowego
do
badań.
Jednakże
wiele
z
badanych
kobiet
nie chciało się poddać badaniu ze względu na pobranie krwi obwodowej, która jest już
inwazyjną metodą, jednakże niezbędną dla przeprowadzenia zaplanowanych badań. Materiał
pobierany był zawsze po uzyskaniu pisemnej zgody pacjentki. Przed przystąpieniem
do badania każdej pacjentce przedstawiono do wypełnienia kwestionariusz osobowy oraz
ankietę odnośnie stanu zdrowia, higieny i ewentualnych nałogów, a także oceniono poziom
higieny jamy ustnej. Do oceny stanu przyzębia i dziąseł posłużyłem się wskaźnikami SBI
(Sulcus Bleeding Index), PPD (Pocket Probing Depth) oraz CAL (Clinical Atachment Loss).
Po przeprowadzeniu badania klinicznego stanu przyzębia kwalifikowałem kobietę ciężarną
do jednej z dwóch grup. W kolejnym etapie badania pobierano próbki płynu dziąsłowego oraz
krew żylną z żyły łokciowej, po odwirowaniu i zabezpieczeniu zamrażano i transportowano
do
laboratorium
Zakładu
Patofizjologii
Instytutu
Medycyny
Wsi
w Lublinie celem przeprowadzenia części laboratoryjnej badań.
W niniejszej pracy podjąłem się próby oceny znaczenia liganda receptora
aktywującego jądrowy czynnik κB i współzawodniczącej z nią osteoprotegeryną
oraz znalezienia ewentualnych zależności pomiędzy nimi, wartościami fosfatazy alkalicznej,
aminotransferazy
asparaginianowj,
a
parametrami
klinicznymi
stanu
przyzębia.
Chororba przyzębia powiązana jest z infekcją bakteriami G-, która skutkuje
w lokalnym i ogólnym zwiększeniu poziomów cytokin i prostaglandyn prozaplanych.
W zapaleniu przyzębia dochodzi do dowierzchołkowej migracji przyczepu łącznotkanowego,
co skutkuje destrukcją kości wyrostka zębodołowgo i tkanki łącznej.
Co więcej, istnieje wystarczjąco dużo dowodów na wnikanie tych bakterii
do krwioobiegu poprzez mechanizmy angażujące mediatory zapalne, co skutkować może
w bezpośrednim wtargnięciu bakterii do płynu owodniowego.
Wszelkie patologie w obrębie jamy ustnej przyszłej matki mogą mieć negatywne
konsekwekcje dla płodu, wliczając w to niską masę urodzeniową noworodków,
przedwczesny
poród,
a
w
rzadkich
przypadkach
nawet
obumarcie
płodu.
Zapalenie dziąseł jest odwracalnym procesem, który nie wpływa na utratę przyczepu
łącznotkankowego. W zapaleniu przyzębia zaś dochodzi do nieodwracalnej utraty włókien
kolagenowych, tkanek miękkich i kości, co skutkuje w zwiększeniu ruchomości zębów,
aż w końcu ich wypadnięcięciem.
3
Jedynie tylko kilka publikacji poświęconych zostało wpływowi ciąży na poziom
przyczepu łącznotkankowego przyzębia.
Wyniki moich badań wskazują na podwyższony poziom RANKL w płynie
dziąsłowym
u
kobiet
ciężarnych
z
chorobą
przyzębia
w
porównaniu
z grupą kontrolną. Poziom RANKL w surowicy krwi pacjentek ciężarnych z dolegliwościami
ze
strony
przyzębia
także
okazał
się
wyższy
porównując
do grupy bez cech zapalnych. W moich badaniach poziomy OPG w surowicy krwi okazały
się bardzo zbliżone do siebie. Różnice pomiędzy grupami były nieistotne statystycznie.
Przeprowadzone przeze mnie badania udowodniły, że różnice w zawartości OPG w płynie
dziąsłowym pomiędzy grupą badaną i kontrolną są istotne statystycznie.
Stężenie RANKL wśród kobiet ciężarnych ze schorzeniem przyzębia było 14 razy wyższe
w GCF w porównaniu do poziomu w surowicy krwi, natomiast wśród ciężarnych ze zdrowym
przyzębiem stosunek ten był niewiele mniejszy (13 razy wyższy). Poziom OPG zaś w płynie
dziąsłowym
w grupie badanej okazał się być ponad 400 krotnie wyższy, a w grupie
kontrolnej
ponad
250-krotnie
wyższy
niż
poziomy
tej
cytokiny
w surowicy.
Na podstawie analizy statystycznej wyników badań udało się ustalić istotne
statystycznie korelacje w grupie badanej pomiędzy stężeniami OPG w surowicy krwi,
a płynem dziąsłowym, pomiędzy stężeniem OPG w surowicy krwi, a stężeniem RANKL
w
surowicy
krwi,
pomiędzy
stężeniem
OPG
w
surowicy
krwi,
a stężeniem RANKL w płynie dziąsłowym, pomiędzy stężeniem OPG w płynie dziąsłowym ,
a
stężeniem
RANKL
i RANKL w płynie dziąsłowym
w
surowicy,
pomiędzy
stężeniami
OPG
oraz pomiędzy stężeniami RANKL w surowicy krwi,
a płynem dziąsłowym.
W grupie kontrolnej zaś stwierdzono istotną statystycznie ujemną zależność liniową
pomiędzy poziomami w surowicy krwi cytokin OPG oraz RANKL.
W obydwu grupach kobiet zanotowałem wiele istotnych statystycznie korelacji
związanych z cytokinami OPG i RANK oraz ze wskaźnikami stanu przyzębia.
Pomiary biochemicznych markerów przebudowy tkanki kostnej odzwierciedlają
procesy, które zachodzą w obrębie szkieletu i stosowane są często do oceny tempa procesu
tworzenia i resorpcji kości. Uznanym markerem kościotworzenia jest fosfataza alkaliczna 4
enzym charakterystyczny dla dojrzałych i aktywnych osteoblastów. Jest nieswoistym
enzymem hydrolitycznym, który jest związany z procesami wapnienia oraz remodellingu
tkanki kostnej. Stężenie ALP w ślinie, a tym bardziej w płynie szczeliny dziąsłowej
jest nieporównywalnie wyższe u osób z cechami zapalenia przyzębia, niż u pacjentów
ze zdrowymi dziąsłami albo zapaleniem dziąseł.
Stężenie fosfatazy alkalicznej w surowicy to parametr, który jest najczęściej
oznaczany do oceny metabolizmu tkanki kostnej. W moich badaniach zdecydowałem się
także na oznaczenie właśnie fosfatazy alkalicznej, jako markera kościotworzenia uzyskując
liczne korelacje istotne statystycznie.
W badaniu własnym wykazałem także, że w płynie dziąsłowym pomiędzy grupą
kontrolną, a badaną istnieją statystycznie bardzo istotne różnice w stężaniach fosfatazy
zasadowej oraz w stężeniach aminotransferazy asparaginianowej.
W badaniu uzyskałem istotną statystycznie dodatnią korelację jedynie pomiędzy
poziomem AST w surowicy krwi z wartością głębokości kieszonki dziąsłowej w grupie
kontrolnej.
Zdecydowałem się również na określenie stosunku RANKL do OPG w płynie
szczeliny dziąsłowej oraz surowicy krwi. Stosunek RANKL/OPG może być uważany
za podstawową determinantę metabolizmu
kości. W wielu systuacjach resorpcja kości
stymulowana jest zarówno poprzez zwiększony poziom RANKL i obniżony OPG, które
oddziałują jako sygnały proresorpcyjne.
Wskazana jest współpraca lekarzy ginekologów z lekarzami dentystami w celu
szerzenia świadomości wśród ciężarnych pacjentek odnośnie konieczności utrzymania
właściwej higieny jamy ustnej, a co za tym minimalizacji schorzeń dziąseł i przyzębia.
Celowe się wydaje również wprowadzenie obligatoryjnych badań stomatologicznych
u ciężarnych na początku oraz w trakcie jej trwania. Potrzeba także większej świadomości
wśród
przyszłych
matek
o
konsekwencjach
dla kobiety ciężarnej, a w szczególności dla płodu.
5
wszelkich
schorzeń
przyzębia