Wpływ etopozydu na aktywnośc enzymów stresu oksydacyjnego

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
7PŒYWETOPOZYDUNAAKTYWNOuCENZYMÌWSTRESUOKSYDACYJNEGO
ORAZSTØENIEDIALDEHYDUMALONOWEGOWHODOWLI
LUDZKICHKOMÌREKCZERNIAKAZŒOuLIWEGOLINII-EINVITRO
)NVITROSTUDYOFTHEEFFECTSOFETOPOSIDEONOXIDATIVE
STRESSENZYMEACTIVITIESANDMALONDIALDEHYDECONCENTRATION
INCULTUREOFHUMANMELANOMA-ECELLS
2AFAŒ*AKUB"UŒDAK2ENATA0OLANIAK-ICHAŒ+UKLA2OBERT+UBINA
!GATA+ABAŒA†$ZIK"OGNA,EWKOWICZ%WA"IRKNER+RYSTYNAˆWIRSKA†+ORCZALA
+ATEDRAI:AKŒAD&IZJOLOGIIW:ABRZUgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
+ATEDRAI:AKŒAD"IOCHEMII/GÌLNEJW:ABRZUgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
+ATEDRAI:AKŒAD0ATOLOGIIW3OSNOWCUgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Tworzenie reaktywnych form tlenu (RFT) w komórkach
nowotworowych występuje podczas ekspozycji na leki
przeciwnowotworowe takie jak: etopozyd, doksorubicyna, holoksan. Hodowlę prowadzono na komórkach
ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 w warunkach
standardowych. Komórki traktowano dwoma stężeniami
etopozydu: 20 μg/ml medium i 200 μg/ml medium. Grupę
kontrolną stanowiły komórki nie zawierające w medium
hodowlanym leku cytostatycznego. Medium zbierano po
24 godzinach od podania preparatu, wirowano i w supernatantach oznaczano aktywności badanych enzymów antyoksydacyjnych: mangano- zależnej (MnSOD) i cynkowo-miedziowej (Cu/ZnSOD) dysmutazy ponadtlenkowej,
peroksydazy glutationu (GSH-Px), reduktazy glutationu
(GR), katalazy (CAT) oraz stężenie dialdehydu malonowego (MDA). Aktywność enzymów antyoksydacyjnych
(MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px) uległa podwyższeniu po 24 godzinach stymulacji etopozydem zależnie od
użytej dawki leku. Aktywność GR uległa obniżeniu w mediach hodowlanych komórek linii Me45 stymulowanych
etopozydem w porównaniu do grupy kontrolnej. Etopozyd w stężeniu 20 μg/ml powoduje obniżenie stężenia
MDA w mediach hodowlanych komórek linii Me45. Etopozyd doprowadza do zwiększenia aktywności enzymów
antyoksydacyjnych (MnSOD, Cu/ZnSOD, CAT, GSH-Px)
i zapobiega procesowi peroksydacji lipidów w mediach
hodowlanych komórek linii Me45. Etopozyd obniża aktywność reduktazy glutationu (GR) w mediach hodowlanych ludzkich komórek czerniaka złośliwego linii Me45.
Reactive oxygen species (ROS) production in cancer cells
usually occurs following anticancer drug exposure such
as: etoposide, doxorubicin and holoxan treatment. The
culture of human melanoma Me45 cell line was performed
in standard conditions. The colonies were treated with
two concentrations of etoposide: 20 μg/ml and 200 μg/ml
of the culture medium. The control group were colonies
without a cytostatic in the culture medium. The medium
was collected at 24 hours from addition of the preparation
and used for determination of activity in the supernatants
of the following antioxidative enzymes: manganese dependent (MnSOD) and copper and zinc containing (Cu/
ZnSOD) superoxide dismutase, glutathione peroxidise
(GSH-Px), glutathione reductase (GR), catalase (CAT)
as well as the concentration of the malonate dialdehyde
(MDA). Following etoposide treatment, activity of the antioxidant enzymes (SOD isoenzymes, CAT, GSH-Px) is
increased in an dose - dependent manner compared with
the untreated group. GR media activity was significant decreased in both etoposide treated group when compared to
the control. Etoposide treatment in concentration of 20 μg/
ml decreased level of MDA concentration in Me45 media
cells. Etoposide leading to an increase antioxidative enzyme activities (MnSOD, CuZn/SOD, CAT, GSH-Px) and
prevent to lipid peroxidation in Me45 media cells. Etoposide leading to a decrease activity of glutathione reductase
(GR) in Me45 media cells.
Key words: etoposide, antioxidant enzyme activities, malondialdehyde, lipid peroxidation
Słowa kluczowe: etopozyd, enzymy antyoksydacyjne,
dialdehyd malonowy, peroksydacja lipidów
&ARM0RZEGL.AUK
Wstęp
Leki cytostatyczne takie jak: 5-fluorouracyl, pochodne
platyny, trójtlenek arsenu, doksorubicyna, etopozyd a także holoksan indukują powstawanie reaktywnych form tlenu
(RFT) w komórkach nowotworowych poddanych chemioterapii [1].
Etopozyd jest lekiem cytostatycznym, półsyntetyczną
pochodną podofilotoksyny, mechanizm jego działania nie
jest do końca poznany, wykazuje działanie uszkadzające
względem jadrowego DNA.
Leki z grup aminoakrydyn, antracyklin i podofilotoksyn
oddziałują prawdopodobnie z kompleksami rozszczepialnymi w DNA. Kompleksy rozszczepialne (z ang. cleavable complexes) tworzone są przez kowalencyjne związanie
DNA i topoizmerazy II. Leki te stabilizują kompleksy rozszczepialne uniemożliwiając prawidłowe funkcjonowanie
topoizomerazy II, skutkiem czego jest powstawanie uszkodzeń w DNA. Ubocznym działaniem leków cytostatycznych w tym etopozydu jest powstający stres oksydacyjny
w komórkach nowotworowych generowany przez powstające reaktywne formy tlenu [2].
Głównym źródłem reaktywnych form tlenu są mitochondria, gdzie powstają podczas procesu oddychania komórkowego, zarówno w komórkach prawidłowych jak i w komórkach nowotworowych in vivo oraz in vitro. Reaktywne
formy tlenu ulegają detoksyfikacji za pomocą enzymów
antyoksydacyjnych takich jak: izoenzymy dysmutazy ponadtlenkowej SOD, peroksydazy glutationowej (GSH-Px),
katalazy (CAT). Reaktywne formy tlenu są wysoce toksyczne dla komórek; przyczyniają się do utleniania zasad azotowych w DNA jądrowym i mitochondrialnym, mogą także
oddziaływać chemicznie i inaktywować białka czy fosfolipidy komórkowe [3].
Alexandre i wsp., na podstawie swoich badań wysunęli
trzy hipotezy mówiące o prawdopodobnej roli reaktywnych
form tlenu w nowotworach [1].
Pierwsza hipoteza zakłada, że powstające reaktywne
formy tlenu w komórkach są prekursorami procesu uszkodzenia tkanek; współistnieją tu w nierównowadze obok
procesu tworzenia reaktywnych form tlenu, procesy detoksyfikacji i naprawy uszkodzeń oksydacyjnych. Druga
hipoteza zakłada, że powstające reaktywne formy tlenu
stanowią przekaźnik w transdukcji sygnału prowadzącego
do regulacji szybkości proliferacji poprzez oddziaływania
na geny cyklu komórkowego. Niski wewnątrzkomórkowy
poziom nadtlenku wodoru (H2O2) będący wynikiem wysokiej aktywności enzymów katalazy, peroksydazy glutationu,
zwiększa szybkość proliferacji komórek nowotworowych in
vitro. Przeciwnie wysokie stężenie H2O2 w mitochondriach,
zaburza metabolizm komórek. Trzecia hipoteza zakłada, że
powstające reaktywne formy tlenu są drugorzędowym markerem śmierci komórek ulegających apoptozie lub nekrozie
w wyniku toksycznego działania substancji chemicznej [1].
Wskaźnikiem stresu oksydacyjnego jest wzrost lub obniżenie aktywności enzymatycznej bariery antyoksydacyjnej;
izoenzymy dysmutazy ponadtlenkowej, MnSOD, CuZn/SOD,
katalazy (CAT) oraz peroksydazy glutationu (GSH-Px).
Izoenzymy dysmutazy ponadtlenkowej, katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do nad-
tlenku wodoru i tym samym uniemożliwia powstawanie
innych toksycznych reaktywnych form tlenu między innymi., rodnika hydroksylowego (OH*-). Mangano - zależna
(MnSOD) oraz miedziowo - cynkowa (Cu/ZnSOD) dysmutaza ponadtlenkowa, jak również zewnątrzkomórkowa izoforma dysmutazy ponadtlenkowej (EcSOD) wykazują ścisłą
kompartmentację w komórce redukując stres oksydacyjny
w różnych przedziałach subkomórkowych [4, 5].
Katalaza (CAT) jest enzymem antyoksydacyjnym, katalizującym reakcję dysproporcjonowania nadtlenku wodoru.
Reakcja przebiega w dwóch etapach z udziałem jonów żelaza (II). Katalaza organizmów eukariotycznych jest homotetramerem o masie od 220 do 350 kDa. Każda podjednostka
posiada układ hemowy z centralnie położonym atomem żelaza (II), związanym z miejscem aktywnym wiązaniami koordynacyjnymi, z enzymem połączone są także cząsteczki
NADPH+ H+. Miejsce występowania katalazy to peroksysomy, ER, mitochondria komórek wątroby, nerek, erytrocytów
czy komórek szpiku [4, 6].
Peroksydazy glutationu (GSH-Px), stanowią pierwszą i drugą linię obrony przed reaktywnymi formami tlenu. Białka te wykazują zdolność redukcji nadtlenków nieorganicznych (H2O2)
oraz nadtlenków organicznych (ROOH) z wytworzeniem kwasu selenowego, jako produktu pośredniego. Peroksydazy glutationowe (GSH-Px); selenopeptydazy posiadają w centrum aktywnym selen pod postacią selenocysteiny, występują w kilku
izoformach w różnych kompartymentach i rodzajach komórek.
Katalizują reakcję pomiędzy nadtlenkiem wodoru a glutationem.
W wyniku reakcji redukcji nadtlenku wodoru, powstaje utleniona forma glutationu - disulfid glutationu (GSSG),
wykazujący działanie toksyczne względem białek komórkowych.W odtworzeniu zredukowanego glutationu pomaga
enzym reduktaza glutationu (GR), przy współudziale NADPH+H+. Oba enzymy GSH-Px oraz GR wykazują działanie
kompensacyjne i stanowią układ enzymatyczny usuwający
nadtlenek wodoru z komórek [4, 7].
Peroksydacja lipidów jest procesem utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych obecnych w lipidach. Peroksydacji podlegają reszty wielonienasyconych kwasów tłuszczowych wchodzących w skład fosfolipidów błon komórkowych. Jednym ze związków powstających w wolnorodnikowym procesie peroksydacji wielonienasyconych kwasów
tłuszczowych jest dialdehyd malonowy MDA (z ang. malondialdehyde). MDA jest związkiem bardzo reaktywnym
względem białek, może dezaktywować enzymy komórkowe.
Wykazano, że reaguje także z zasadami azotowymi kwasów
nukleinowych [8].
Znaczenie w patogenezie choroby nowotworowej odgrywają szczególnie dwa izoenzymy SOD: mangano - zależna (MnSOD) oraz cynkowo - miedziowa (Cu/ZnSOD)
dysmutaza ponadtlenkowa. Aktywność enzymów antyoksydacyjnych MnSOD, CuZnSOD CAT, GSH-Px w komórkach
nowotworowych jest zmienna.
Wyniki licznych prac wskazują, że zmiany aktywności
izoenzymów SOD występują w wielu typach nowotworów:
rak trzustki [9], gruczołu krokowego [10], nowotwory żołądka [11] oraz jamy ustnej [12] i przewodu pokarmowego
[13], na różnych etapach zaawansowania choroby nowotworowej: rak in situ, przerzuty [14, 12].
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Komórki nowotworowe wskutek podwyższonej aktywności enzymów antyoksydacyjnych mogą skutecznie adaptować się do stresu oksydacyjnego in vitro
oraz in vivo [15]. Wzrost aktywności izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy glutationu oraz katalazy
w komórkach nowotworowych może indukować chemooporność komórek nowotworowych, warunkującą powstawanie populacji komórek opornych na działanie użytego
leku cytostatycznego [16-19].
Celem pracy jest określenie wpływu różnych stężeń
etopozydu na aktywność enzymów antyoksydacyjnych
(MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px, GR) oraz stężenie
MDA (marker procesu peroksydacji lipidów) w mediach
hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii
Me45 in vitro.
Materiał i metody
Hodowla komórkowa
Po odbankowaniu komórek z ciekłego azotu, komórki
zostały namnożone w butelkach hodowlanych o powierzchni wzrostowej 25 cm2 (T25). Po namnożeniu komórki zostały wybarwione 0,25 % roztworem błękitu trypanu i policzone metodą bezpośrednią w komorze Bürkera (1 mm2) w celu
określenia ilości komórek żywych i martwych. Procent
martwych komórek wynosił mniej niż 5 %. Hodowla komórek czerniaka złośliwego Me45 prowadzona była w standardowych warunkach w 37 ºC oraz 5 % nasyceniem CO2.
Komórki hodowane były w medium DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium) ze zwiększoną zawartością glukozy 4,5 g/l (z dodatkiem 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS GOLD) pochodzącej z firmy (Sigma-Aldrich, St
Louis. Mo). Do medium hodowlanego z surowicą dodano
antybiotyki: penicylina (100 U/mL), streptomycyna (100
μg/ml) oraz amfoterycyna B (200000 jednostek/l). Komórki czerniaka złośliwego linii Me45 zostały umieszczone
w butelkach hodowlanych (T25) firmy Sarsted w ilości
1x106.
Komórki linii Me45 są komórkami adherentnymi
i w czasie wzrostu przylegają do dna butelki. Pasażu komórek adherentach dokonywano przed uzyskaniem całkowitej
monowarstwy na dnie butelki (80 % konfluencji), w czasie
wykładniczej fazy wzrostu. Na początku usuwano pożywkę
z naczynia hodowlanego, za pomocą sterylnych pipet. Następnie hodowle zalewano 1 ml roztworu trypsyny, w celu
odklejenia komórek od dna butelki hodowlanej i inkubowano w cieplarce ok. 3 min. Po inkubacji zalewano próbki 3 ml
medium z surowicą, w celu inaktywacji trypsyny. Następnie
zawiesinę komórek w medium rozdzielano w zależności od
potrzeb i przenoszono do nowych butelek hodowlanych, dodając odpowiednią ilość świeżego medium.
Przebieg doświadczenia
Komórki czerniaka złośliwego linii Me45 uzyskujące 90
% konfluencji, traktowano dwoma stężeniami etopozydu:
20 μg/ml oraz 200 μg/ml medium przez okres 24 godzin
(wykonano 6 powtórzeń). Grupę kontrolną stanowiły komórki nie zawierające w medium hodowlanym etopozydu
(wykonano 6 powtórzeń). Medium hodowlane zbierano po
24 godzinach po podaniu etopozydu a następnie wirowa-
no 2000 rpm/ 5 min. Po wirowaniu pobierano supernatant
i przystępowano do oznaczenia aktywności enzymów antyoksydacyjnych oraz stężenia MDA.
Podział na grupy badawcze
K - kontrola, komórki czerniaka złośliwego linii Me45 nie
traktowane etopozydem
B1 - komórki czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowane
etopozydem w stężeniu 20 μg/ml
B2 - komórki czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowane
etopozydem w stężeniu 200 μg/ml
Po wirowaniu medium hodowlanego w supernatantach
oznaczono
1. Aktywność całkowitą dysmutazy ponadtlenkowej
(SOD).
2. Aktywność mangano- zależnej dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD).
3. Aktywność cynkowo-miedziowej dysmutazy ponadtlenkowej (Cu/ZnSOD).
4. Aktywność peroksydazy glutationu (GSH-Px).
5. Aktywność reduktazy glutationu (GR).
6. Aktywność katalazy (CAT).
7. Stężenie dialdehydu malonowego (MDA), jako markera peroksydacji lipidów.
Aktywność izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej
została oznaczona wg metody Oyanagui [20], zmodyfikowanej w Katedrze i Zakładzie Biochemii Ogólnej w Zabrzu,
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach wykorzystując różną podatność enzymu (MnSOD) na inhibicję
cyjankiem potasu (KCN) i została wyrażona w jednostkach:
nitrowych/ml medium hodowlanego [NU/ml]. Jednostka nitrowa jest to taka ilość enzymu, która rozkłada w jednostce
czasu 50 % ilości powstającego anionorodnika ponadtlenkowego w warunkach metody. Metoda ta jest w pełni swoista dla dysmutazy ponadtlenkowej. Aktywność Cu/ZnSOD
została oszacowana zgodnie ze wzorem: Aktywność Cu/
ZnSOD = aktywność całkowita SOD – aktywność MnSOD
Aktywność peroksydazy glutationu (GSH-Px) oraz reduktazy glutationu (GR) została oznaczona wg metody
Paglia i Valentine’a [21]. Zasadą metody jest reakcja zredukowanego glutationu (GSH), w obecności peroksydazy,
z ponadtlenkiem t-butylu. Aktywność GSH-Px została wyrażona w jednostkach międzynarodowych/ l [IU/l].
Aktywność katalazy (CAT) oznaczono w oparciu o metodę kinetyczną Aebie’go [22] i wyrażono w jednostkach
[kIU/l].
Stężenie dialdehydu malonowego oznaczano wg metody Ohkawy i wsp. [23], wykorzystując jego reakcję z kwasem tiobarbiturowym i wyrażono w μmolach MDA/ml
medium hodowlanego. Pomiarów dokonano przy długości
fali 515nm (absorbancja) i 522nm (emisja). Stężenie MDA
odczytano z krzywej standardowej, stosując jako standard
1,1,3,3 tetraetoksypropan i zostało wyrażone w jednostkach
[μmol /ml].
Analiza statystyczna
Dane zgromadzono w arkuszu kalkulacyjnym Excel
2007 firmy Microsoft.
&ARM0RZEGL.AUK
Po przeprowadzeniu wstępnej kalkulacji dane przenoszono do bazy danych programu Statistica 7.0 firmy
StatSoft, przy pomocy którego przeprowadzono analizę.
Zgodność rozkładu zmiennych ciągłych z rozkładem normalnym Gaussa weryfikowano testem zgodności Shapiro-Wilka.
Analizę porównawczą dla zmiennych ciągłych realizowano
za pomocą testu parametrycznego t-Studenta. Wyniki badań przedstawiono, jako średnie arytmetyczne ± SEM (błąd
standardowy). Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany
przy poziomie istotności p<0,05 oraz p<0,001.
Wyniki
ku zastosowania 10 - krotnie wyższego stężenia etopozydu w hodowli komórek czerniaka złośliwego linii Me45
po 24 godzinach zaobserwowano tylko nieznaczny wzrost
aktywności tego enzymu w stosunku do aktywności GSH
-Px w medium hodowlanym komórek grupy kontrolnej,
odpowiednio; 127,4 ± 9,45 [IU/l] vs 93,51 ± 8,96 [IU/l],
(p< 0,001).
W niniejszej pracy zaobserwowano, 2 – krotnie mniejszą aktywność reduktazy glutationu w medium hodowlanym komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45
stymulowanych etopozydem w stężeniu 20 μg/ml, 200 μg/
ml w stosunku do aktywności GR w grupie kontrolnej, odpowiednio; 5,04 ± 0,15 [IU/l], 4,22 ± 0,22 [IU/l] vs 9,17 ±
0,91 [IU/l], (p<0,001).
Ponadto, zaobserwowano zmniejszenie stężenia MDA
w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowanych etopozydem w stężeniu
20 μg/ml w stosunku do grupy kontrolnej, odpowiednio;
0,92 ± 0,12 [μmol/ml] vs 1,49 ± 0,41 [μmol/ml], (p<0,05).
Wykazano brak znamienności statystycznej na poziomie
α=0.05 w grupie komórek stymulowanych etopozydem
w stężeniu 200 μg/ml względem kontroli (1,40 ± 0,31 [μmol/
ml] vs 1,49 ± 0,41 [μmol/ml].
Po stymulacji komórek czerniaka złośliwego linii Me45
etopozydem w stężeniu 20 μg/ml i 200 μg/ml (po 24 godz.)
zaobserwowano ponad 2 – krotne zwiększenie aktywności
całkowitej enzymu dysmutazy ponadtlenkowej SOD w mediach hodowlanych komórek linii Me45 w stosunku do aktywności tego enzymu w grupie kontrolnej, odpowiednio;
11,16 ± 0,34 [NU/ml], 12,04 ± 1,1 [NU/ml] vs 4,85 ± 0,16
[NU/ml] (p<0,001).
Zaobserwowano niewielki wzrost aktywności manganozależnej dysmutazy ponadtlenkowej MnSOD w mediach
hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 traktowanych etopozydem w stężeniu 20 μg/ml Dyskusja
przez okres 24 godzin względem aktywności tego izoenzymu w grupie kontrolnej, odpowiednio; 4,35 ± 0,22 [NU/ml]
Tworzenie RFT w komórkach nowotworowych, rozpovs 3,42 ± 0,12 [NU/ml], (p<0,05). Ponad 2 - krotny wzrost czyna się już w szóstej godzinie po ekspozycji na leki cyaktywności tego izoenzymu, zaobserwowano w mediach tostatyczne takie jak: kampotecynę, vinblastynę, cisplatynę,
hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego li- paklitaksel, etopozyd, mechanizm prowadzący do generonii Me45 stymulowanych etopozydem w stężeniu 200 μg/ wania reaktywnych form tlenu w wyniku działania leków
ml przez okres 24 godzin w stosunku do grupy kontrolnej, cytostatycznych pozostaje jednak nadal nieznany [1].
odpowiednio; 7,12 ± 0,56 [NU/ml] vs 3,42 ± 0,12 [NU/ml],
W niniejszej pracy zaobserwowano po 24 godzinach sty(p<0,05).
mulacji etopozydem komórek ludzkiego czerniaka złośliPonadto zaobserwowano wzrost aktywności izoenzymu;
cynkowo– miedziowej dysmutazy
ponadtlenkowej (Cu/ZnSOD) oraz
katalazy (CAT) w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 traktowanych dwoma stężeniami etopozydu
przez okres 24 godzin w stosunku
do aktywności tych enzymów w grupie kontrolnej, odpowiednio; (Cu/
ZnSOD; 6,8 ± 0,49 [NU/ml], 4,92
± 0,88 [NU/ml] vs 1,43 ± 0,27 [NU/
ml], p<0,001), (CAT; 30,49 ± 3,15
[kIU/l], 26,33 ± 2,25 [kIU/l] vs 7,55
± 0,89 [kIU/l], p< 0,001).
Zaobserwowano także ponad Ryc. 1. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność całkowitą en4,5 - krotny wzrost aktywności pe- zymu dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w medium hodowlanym komórek linii
roksydazy glutationu (GSH-Px) po Me45 (po 24h) wyrażona w [NU/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/
24 godzinnej stymulacji komórek ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM);
czerniaka złośliwego linii Me45 n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
etopozydem w stężeniu 20 μg/ml
w stosunku do aktywności tego en- Fig. 1. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on total activzymu w medium hodowlanym ko- ity of superoxide dismutase (SOD) in human melanoma Me45 media cells (after
mórek grupy kontrolnej, odpowied- 24 h) and expressed in [NU/ml]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide
nio; 450,45 ± 34 [IU/l] vs 93,51 ± (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM);
8,96 [IU/l], (p<0,001). W przypad- n=6; student’s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
peroksydacji lipidów w mediach
hodowlanych najprawdopodobniej
wynika z adaptacji komórek czerniaka złośliwego linii Me45 do stresu
oksydacyjnego indukowanego przez
lek cytostatyczny.
W piśmiennictwie dostępna jest
praca Polaniak i wsp. [24], w której autorzy porównywali aktywności izoenzymów SOD w mediach
hodowlanych komórek mysiego
raka płaskonabłonkowego linii AT478
traktowanych holoksanem. HolokRyc. 2. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność mangano - za- san jest lekiem cytostatycznym, geleżnej dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD) w medium hodowlanym komórek nerującym powstawanie RFT w kolinii Me45 (po 24h) wyrażona w [NU/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 mórkach poddanych terapii in vitro.
μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); W pracy tej zaobserwowano wzrost
aktywności izoenzymu MnSOD
n=6; test t-studenta: * p<0.05 vs K,
w mediach hodowlanych komórek
^ p<0.05 vs B1, # p<0.05 vs B2.
linii AT478 stymulowanych holoksaFig. 2. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of nem w stężeniu 10 μg/ml oraz 40 μg/
manganese dependent superoxide dismutase isoenzyme (MnSOD) in human me- ml przez okres 24 godzin, względem
lanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [NU/ml]. Abbreviations: aktywności tego izoenzymu w grupie
K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean kontrolnej, odpowiednio; 9,2 NU/ml,
14,69 NU/ml vs 1,2 NU/ml. Jednoczevalues ± standard error (SEM); n=6;
śnie
zaobserwowano wzrost aktywnostudent’s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
ści izoenzymu Cu/ZnSOD w mediach
analizowanych komórek względem
aktywności tego enzymu w grupie
kontrolnej, odpowiednio; 3,7 NU/ml,
4,1 NU/ml vs 1,4 NU/ml [24].
W niniejszej pracy obserwujemy
zróżnicowanie nasilenia aktywności izoenzymów SOD w zależności od użytego stężenia etopozydu
w hodowli komórek linii Me45.
Obydwa zastosowane stężenia etopozydu powodują większy wzrost
aktywności izoenzymu Cu/ZnSOD
w mediach komórek linii Me45
względem aktywności tego izoenzyRyc. 3. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność cynkowo - mu w mediach komórek linii AT478
miedziowej dysmutazy ponadtlenkowej (Cu/ZnSOD) w medium hodowlanym poddanych terapii holoksanem opisakomórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [NU/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- nej w pracy [24].
W piśmiennictwie dostępnych
Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd stanjest
zaledwie kilka prac [24, 27, 28],
dardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05
bezpośrednio
analizujących zmiany
vs B2.
aktywności enzymów antyoksydacyjFig. 3. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of nych w mediach hodowlanych komócopper and zinc containing superoxide dismutase isoenzyme (CuZnSOD) in hu- rek nowotworowych in vitro.
Dostępne są wyniki badań innych
man melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [NU/ml]. Abbreautorów
dotyczących wpływu nadeviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/
kspresji
genów
kodujących izoenzyml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student’s t-test: * p<0,001 vs K,
my
SOD
na
progresję
zmian nowo^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
tworowych in vitro oraz in vivo.
Wzrost aktywności enzymów
wego linii Me45 znaczący wzrost aktywności enzymów
antyoksydacyjnych (MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px) antyoksydacyjnych usuwających nadtlenek wodoru w kozależny od użytego stężenia leku cytostatycznego. Uzy- mórkach nowotworowych (CAT oraz GSH-Px) wiąże się
skany wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych z indukcją procesu chemooporności na leki cytostatyczne
w hodowli z jednoczesnym obniżeniem intensywności [15].
&ARM0RZEGL.AUK
ka złośliwego linii Me45. Etopozyd
w stężeniu 20 μg/ml po 24 godzinach spowodował blisko 5 - krotny
wzrost aktywność enzymu GSH-Px
w mediach hodowlanych komórek
względem nie traktowanej kontroli.
10-krotnie wyższe stężenie tego leku
cytostatycznego skutkowało tylko
nieznacznym wzrostem aktywności
tego enzymu względem grupy kontrolnej.
W pracach Dusre i wsp [17] oraz
Samuels i wsp. [18]., wykazano
wpływ aktywności enzymu GSH-Px
w komórkach nowotworowych na
Ryc.4. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność katalazy (CAT) indukcję procesu chemooporności
w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [kIU/l]. Skró- komórek nowotworowych na leki cyty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości tostatyczne.
średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0.05
Dusre i wsp. [17] zaobserwowali,
vs B1, # p<0.05 vs B2.
że komórki raka piersi linii MCF-7ADR
wykazujące oporność względem miFig.4. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of ca- tomycyny C oraz adriamycyny posiatalase (CAT) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in dają 14 – krotnie większą aktywność
[kIU/l]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposi- enzymu GSH-Px w porównaniu do
de (200 μg/ml). Mean values
komórek linii dzikiej. Stężenie mito± standard error (SEM); n=6; student’s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, mycyny C powodujące zahamowanie
# p<0,05 vs B2.
wzrostu 50 % komórek linii wielolekoopornej MCF-7ADR w hodowli (IC50)
osiągało wartość 22,5 μmol względem
stężenia 0,36 μmol tego leku cytostatycznego powodującego ten sam procent zahamowania wzrostu komórek
raka piersi linii dzikiej [17].
W pracy Samuels i wsp. [18] wykazano różną cytotoksyczność doksorubicyny względem różnych linii
komórek nowotworowych wywodzących się z tkanki łącznej. Komórki
nowotworowe linii STSAR90 izolowane z ludzkich mięsaków były 6 –
krotnie mniej wrażliwe na apoptozę
indukowaną przez doksorubicynę,
Ryc.5. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność peroksydazy względem komórek nowotworowych
glutationu (GSH-Px) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wy- linii STSAR11. Traktowanie obydwu
rażona w [IU/l]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd linii komórkowych doksorubicyną
(200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: w stężeniu 100 μg/ml, spowodowało
* p<0,001 vs K, ^ p<0,001 vs B1, # p<0,001 vs B2.
różną odpowiedź komórek na lek. Komórki linii STSAR90, wykazywały 6
Fig.5. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of - krotnie wyższą aktywność enzymu
glutathione peroxidase (GSH-Px) in human melanoma Me45 media cells (after 24 GSH-Px oraz 2 – krotnie wyższe stęh) and expressed in [IU/l]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ żenie glutationu w komórkach poddaml); B2 - Etoposide
nych terapii doksorubicyną. Wyższa
(200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student’s t-test: * p<0,001 aktywność enzymu GSH-Px w komórvs K,
kach nowotworowych linii STSAR90
^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
skutkowała większą opornością na
apoptozę i nekrozę indukowaną przez
ten lek cytostatyczny względem koW niniejszej pracy etopozyd w stężeniu 20 μg/ml oraz mórek nowotworowych linii STSAR11. Większa aktyw200 μg/ml powoduje blisko 4 - krotny wzrost aktywności ność enzymu GSH-Px, skutkuje także obniżeniem stężenia
CAT w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czernia- wewnątrzkomórkowego H O , tym samym zmniejszając
2 2
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
podając do hodowli inhibitor biosyntezy glutationu, butioninosulfoksymine (BSO) [18].
Z powyższych obserwacji wynika,
że wysoka aktywność enzymu GSH-Px
w komórkach nowotworowych może
być jednym z czynników warunkujących indukcję procesu oporności na
leki cytostatyczne w hodowli in vitro.
Kofaktorem enzymatycznym GSH
-Px jest enzym reduktaza glutationu
(GR), który współdziała z GSH-Px
w odtworzeniu zredukowanego glutationu [7].
W niniejszej pracy uzyskaliśmy
Ryc.6. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność reduktazy gluobniżenie aktywności GR w mediach
tationu (GR) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w
hodowlanych komórek ludzkiego
[IU/l]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml).
czerniaka linii Me45 traktowanych
Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K,
etopozydem względem komórek gru^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
py kontrolnej. Być może w skutek
niższej aktywności GR w hodowli
Fig.6. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of
stężenie disulfidu glutationu (GSSG)
glutathione reductase (GR) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and
wzrasta. GSSG jest ubocznym proexpressed in [IU/l]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml);
duktem reakcji enzymu GSH-Px
B2 - Etoposide
z nadtlenkiem wodoru i może on re(200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student’s t-test: * p<0,001
agować z grupami tiolowymi białek
vs K,
doprowadzając do ich dezaktywacji
^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
[4]. Niemniej jednak jak wynika z obserwacji dokonanych przez innych autorów indukcja oporności na leki cytostatyczne w komórkach nowotworowych może wynikać ze zwiększonej
aktywności GSH-Px, GR, CAT oraz
S-transferazy glutationu [25].
W niniejszej pracy wykazano, że
jedynie etopozyd w stężeniu 20 μg/
ml powodował istotne statystycznie
zmniejszenie intensywności procesu peroksydacji lipidów w mediach
komórkowych linii Me45 in vitro.
Obniżenie intensywności peroksydacji lipidów w komórkach linii Me45,
Ryc.7. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na stężenie dialdehydu malo- oceniane poprzez obserwowany spadek stężenia MDA wynika z wysokiej
nowego (MDA) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażoaktywności GSH-Px w mediach hone w [μmol/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd
(200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * dowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45. Zależp<0.05 vs K, ^ p<0.05 vs B1, # p<0.05 vs B2.
ność pomiędzy aktywnością GSH-Px
a stężeniem końcowym MDA wynika
Fig.7. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on malondialz faktu, że peroksydaza glutationu redehyde concentration (MDA) in human melanoma Me45 media cells (after 24
h) and expressed in [μmol/ml]. Abbreviations: K - control group; B1 - Etoposide dukuje nie tylko nadtlenek wodoru
(H2O2), ale także nadtlenki organicz(20 μg/ml); B2 - Etoposide
ne (ROOH). Nadtlenek organiczny
(200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student’s t-test: *
(ROOH) zostaje zredukowany do odp<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.
powiedniego alkoholu (ROH), stąd
wysoka aktywność enzymu GSH-Px
intensywność tworzenia rodnika hydroksylowego (OH*-) jest czynnikiem hamującym proces peroksydacji lipidów
w cyklu Fentona w hodowli komórek nowotworowych linii błonowych w komórkach [8].
STSAR90. Autorzy dodatkowo zwiększyli wrażliwość koW piśmiennictwie dostępne są prace dotyczące wpływu
mórek nowotworowych linii STSAR90 na doksorubicynę pola elektromagnetycznego o niskiej częstotliwości (ELF-
&ARM0RZEGL.AUK
MF) w kombinacji z różnymi antyoksydantami: witaminą
E [27] oraz melatoniną [28] na stężenie MDA w mediach
hodowlanych komórek mysiego raka płaskonabłonkowego
linii AT478. W obydwu cytowanych pracach wykazano,
że 16 minutowa ekspozycja komórek nowotworowych
linii AT478 na ELF-MF w kombinacji z antyoksydantem
zwiększa aktywność enzymów antyoksydacyjnych oraz
powoduje obniżenie stężenia MDA w mediach hodowlanych
W pracy Polaniak i wsp. [27], wykazano obniżenie stężenia MDA w mediach hodowlanych komórek linii AT478
stymulowanych ELF-MF oraz witaminą E (10%) względem grupy kontrolnej, odpowiednio; 4,42 μmol MDA/ml
vs 6,8 μmol MDA/ ml. Aktywność enzymu GSH-Px w mediach hodowlanych komórek linii AT478 po stymulacji
ELF-MF oraz witaminą E w stosunku do kontroli wzrosła
aż 9-krotnie [27]. Melatonina w stężeniu 10-5 M oraz 10-4
M w kombinacji z ELF-MF w tych samych warunkach
doświadczalnych efektywniej obniżała stężenie MDA
w mediach komórek linii AT478 w stosunku do nie traktowanej kontroli, odpowiednio; 1,64 μmol MDA/ ml, 3,65
μmol MDA/ml vs 6,79 μmol MDA/ ml [28].
Reasumując, w niniejszej pracy wykazaliśmy, że etopozyd zależnie od użytego stężenia powoduje zwiększenie
aktywności enzymów antyoksydacyjnych za wyjątkiem GR,
oraz obniża stężenie MDA w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45. Ponieważ
w piśmiennictwie istnieją doniesienia dotyczące zależności
pomiędzy aktywnością enzymów antyoksydacyjnych komórek nowotworowych a procesem oporności na leki cytostatyczne, w dalszej kolejności należy sprawdzić możliwość
zwiększania cytotoksyczności etopozydu w terapii czerniaka in vitro z użyciem inhibitorów enzymów antyoksydacyjnych.
Konieczność poszukiwania alternatywnych, markerów
rozwijającej się oporności na leki stosowane w terapii przeciwnowotworowej koresponduje z możliwością monitorowania aktywności enzymów antyoksydacyjnych w mediach
hodowlanych komórek nowotworowych in vitro. Istnieją
liczne doniesienia dotyczące prób zwiększenia skuteczności czy wrażliwości komórek nowotworowych na leki
cytostatyczne w metodzie opartej na modulacji stanu oksydacyjnego opornych na chemioterapeutyki komórek nowotworowych (ROS – mediated cancer therapy). Konieczność
poszukiwania alternatywnych leków przeciwnowotworowych o niskiej toksyczności względem prawidłowych komórek jest ściśle uzasadniona. Podczas konwencjonalnych
cykli chemioterapii, tworzą się w wyniku selekcji, klony
komórek nowotworowych opornych na stosowane cytostatyki w skutek rozwoju oporności wielolekowej (MDR)
[15].
Efferth i wsp. [26] wykazali skuteczność w eliminacji
doksorubicyno - opornych komórek białaczkowych za pomocą leku przeciwmalarycznego (ART) Artesunate. Lek
ten wywołuje apoptozę doksorubicyno - opornych komórek T białaczkowych, poprzez tworzenie i akumulacje RFT
w mitochondriach. Zastosowanie silnego antyoksydantu
– (NAC) N - acetylocysteiny; prekursora glutationu, uniemożliwia tworzenie i akumulacje RFT i znosi toksyczny
efekt ART względem komórek białaczkowych. Toksyczne,
synergistyczne działanie (DOX) oraz (ART.) wynika z różnych mechanizmów generowania mitochondrialnego stresu
oksydacyjnego w komórkach i może stanowić podstawę nad
badaniami klinicznymi nad włączeniem ART, jako leku drugiego rzutu w białaczkach [26].
Wnioski
1. Etopozyd zwiększa aktywność enzymów antyoksydacyjnych (MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px) w mediach hodowlanych komórek czerniaka złośliwego linii
Me45 i zapobiega procesowi peroksydacji lipidów.
2. Etopozyd zmniejsza aktywność reduktazy glutationu
(GR) w mediach hodowlanych ludzkich komórek czerniaka złośliwego linii Me45.
Praca została wykonana w ramach badań statutowych
(umowa KNW - 1-078/09), sfinansowana ze środków
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach.
Piśmiennictwo
1. Alexandre J i wsp. Improvement of the therapeutic index of anticancer drugs by the superoxide dismutase
mimic mangafodipir. J Natl Cancer Inst 2006; 98(4):
236-244.
2. Gupta A i wsp. Oxidative stress in non-small cell lung
cancer patients after chemotherapy: association with
treatment response. Respirology 2010; 15(2): 349-356.
3. Calabrese V, Cornelius C, Mancuso C, Lentile R, Stella
AM, Butterfield DA. Redox homeostasis and cellular
stress response in aging and neurodegeneration. Methods Mol Biol 2010; 610: 285-308.
4. Gałecka E, Jacewicz R, Mrowicka M, Florkowski A,
Gałecki P. Enzymy antyoksydacyjne, struktura, właściwości, funkcje. Pol Merkur Lek 2008; 25(147): 266268.
5. Valdivia A, Pérez-Alvarez S, Aroca-Aguilar JD, Ikuta I,
Jordán J. Superoxide dismutases: a physiopharmacological update. J Physiol Biochem 2009; 65(2): 195-208.
6. Kirkman HN, Gaetani GF. Mammalian catalase: a venerable enzyme with new mysteries. Trends Biochem Sci
2007; 32(1): 44-50.
7. Michelson AM. Selenium glutathione peroxidase: some
aspects in man. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1998;
17(3-4): 233-239.
8. Gaweł S, Wardas M, Niedworok E, Wardas P. Dialdehyd
malonowy (MDA) jako wskaźnik procesów peroksydacji lipidów w organizmie. Wiad Lek 2004; 57(9-10):
453-455.
9. Weydert C et al. Suppression of the malignant phenotype in human pancreatic cancer cells by the overexpression of manganese superoxide dismutase. Mol Cancer
Ther 2003; 2(4): 361-369.
10. Yilmaz MI et al. Antioxidant system activation in prostate cancer. Biol Trace Elem Res 2004; 98(1): 13-19.
11. Hur GC et al. Manganese superoxide dismutase expression correlates with chemosensitivity in human gastric
cancer cell lines. Clin Cancer Res 2003; 9(15): 57685775.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
12. Yokoe H et al. Characterization of intracellular superoxide dismutase alterations in premalignant and malignant
lesions of the oral cavity: correlation with lymph node
metastasis. J Cancer Res Clin Oncol 2009; 135(11):
1625-1633.
13. Kekec Y, Paydas S, Tuli A, Zorludemir S, Sakman G,
Seydaoglu G. Antioxidant enzyme levels in cases with
gastrointesinal cancer. Eur J Intern Med 2009; 20(4):
403-406.
14. Nelson KK et al. Elevated sod2 activity augments matrix metalloproteinase expression: evidence for the involvement of endogenous hydrogen peroxide in regulating metastasis. Clin Cancer Res 2003; 9(1): 424-432.
15. Trachootham D, Alexandre J, Huang P. Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nat Rev Drug Discov 2009; 8(7):
579-591.
16. Connor KM et al. Manganese superoxide dismutase
enhances the invasive and migratory activity of tumor
cells. Cancer Res 2007; 67(21): 10260-10267.
17. Dusre L et al. DNA interstrand cross-link and free radical formation in a human multidrug-resistant cell line
from mitomycin C and its analogues. Cancer Res 1990;
50(3): 648-52.
18. Samuels BL et al. Increased glutathione peroxidase activity in a human sarcoma cell line with inherent doxorubicin resistance. Cancer Res 1991; 51(2): 521-527.
19. Lenehan PF et al. Resistance to oxidants associated with
elevated catalase activity in HL-60 leukemia cells that overexpress multidrug-resistance protein does not contribute
to the resistance to daunorubicin manifested by these cells.
Cancer Chemother Pharmacol 1995; 35(5): 377-386.
20. Oyanagui Y. Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity. Anal
Biochem 1984; 142(2): 290-296.
21. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte
glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70(1):
158-169.
22. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol 1984; 105:
121-126.
23. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides
in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal
Biochem 1979; 95(2): 351-358.
24. Polaniak R i wsp. Wpływ holoksanu na aktywność izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej i stężenie dialdehydu malonowego w hodowli megakolonii komórek raka płaskonabłonkowego in vitro. Bromat Chem
Toksykol 2008; 1: 89-94.
25. Oberley TD, Oberley LW. Antioxidant enzyme levels in
cancer. Histol Histopathol 1997; 12(2): 525-535.
26. Efferth T et al. Artesunate induces ROS-mediated apoptosis in doxorubicin-resistant T leukemia cells. PLoS
One. 2007; 2(1): e693.
27. Polaniak R et al. Influence of an extremely low frequency magnetic field (ELF-EMF) on antioxidative
vitamin E properties in AT478 murine squamous cell
carcinoma culture in vitro. Int J Toxicol 2010; 29(2):
221-230.
28. Zwirska-Korczala K et al. Influence of extremelylow-frequency magnetic field on antioxidative melatonin properties in AT478 murine squamous cell carcinoma culture Biol Trace Elem Res 2004; 102(1-3):
227-243.
data otrzymania pracy: 02.06.2010 r.
data akceptacji do druku: 16.11.2010 r.
Adres do korespondencji:
mgr Rafał Jakub Bułdak
Katedra i Zakład Fizjologii
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
41-808 Zabrze, ul. Jordana 19
Tel.: +48 32 272 23 62
e-mail: [email protected]