CTX - Wiki

Wydział Biologii UW
Zakład Mikrobiologii
Stosowanej
ul. Miecznikowa 1
02-096 Warszawa
Cytotoksyny – wykorzystanie w biotechnologii i wakcynologii
Prowadzenie i przygotowanie:
Dr Tomasz Jagielski, mgr Katarzyna Roeske oraz dr Radosław Stachowiak
Wstęp
Zainteresowanie badaczy na świecie bakterią Listeria monocytogenes wynika przede
wszystkim z faktu, iż bakteria ta jest podstawowym organizmem modelowym w badaniach nad
mechanizmami bakteryjnej patogenezy oraz odpowiedzią immunologiczną1. Określenie funkcji
LLO (listeriolizyna – hemolizyna L. monocytogenes) oraz znalezienie genu hly (gen strukturalny
LLO) i innych genów kodujących determinanty patogenezy L. monocytogenes było możliwe
dzięki izolacji i charakterystyce serii mutantów insercyjnych. Wszystkie mutanty pozbawione
hemolizyny nie były zdolne do wzrostu wewnątrzkomórkowego w hodowlach tkankowych i były
awirulentne dla myszy2.
Tak jak większość enteropatogenów L. monocytogenes w celu rozpoczęcia procesu
chorobowego musi pokonać barierę nabłonka jelitowego. Komórki Listeria w procesie
penetracji mogą podobnie jak inne enteropatogeny wykorzystać wyspecjalizowane komórki
M występujące w nabłonku FAE pokrywającym kopuły kępek Peyera (Rys. 1) lub wnikać
bezpośrednio przez komórki nabłonka wykorzystując jedną z adhezyn, internalinę A.
Po przeniknięciu przez ochronne warstwy śluzu bakterie chorobotwórcze przylegają
do zewnątrzkomórkowej matrix ssaków (ECM, mammalian extracellular matrix) występującej na
powierzchni
tkanki
nabłonkowej
gospodarza. Przezwyciężają w ten
sposób
mechaniczne
systemy
obronne występujące na powierzchni
tkanek
i
inicjują
kolonizację
specyficznych nisz tkankowych.
W większości zainfekowanych
tkanek L. monocytogenes dociera do
wnętrza komórek dzięki zdolności do
indukcji fagocytozy (internaliny) przez
komórki,
które
normalnie
nie
fagocytują. Dokładniejsze badania
wykazały, że podczas infekcji ma
miejsce szereg interakcji pomiędzy
bakterią, a komórką gospodarza.
Rys. 1. Wnikanie L. monocytogenes do
Inwazja
komórek
gospodarza
wnętrza kępki Peyera.
1
Ikonomidis G., Frankel F.R., Portnoy D.A., Paterson Y. 1995. Listeria monocytogenes: a novel
live vaccine vector. Vaccines 13: 317-326. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2
Camilli A., Paynton C. R. and D. A. Portnoy. 1989. Intracellular methicillin selection of Listeria
monocytogenes mutants unable to replicate in a macrophage cell line. Proc.Natl.Acad. Sci. USA 86:
5522-5526
1
rozpoczyna się od internalizacji komórki bakteryjnej na drodze fagocytozy w przypadku
makrofagów lub indukcji fagocytozy w przypadku komórek normalnie niefagocytujących.
Inwazja bakteryjna rozpoczyna się od otaczana bakterii błoną endocytoplazmatyczną.
Proces wnikania do wnętrza komórki różni się od obserwowanego w przypadku infekcji
Salmonella i Shigella marszczenia błony (ang. membrane ruffling) nazwanego
mechanizmem „trigger” i został określony jako „zipper”. W tym przypadku zamykanie się
błony nad bakterią przebiega łagodniej i przypomina zamykający się suwak.
Zamknięcie komórek Listeria w fagosomie nie trwa długo gdyż bakteria bardzo szybko,
już po około 30 minutach od
rozpoczęcia wnikania wydostaje
się z wakuoli. W ten sposób
bakterie unikają strawienia, które
jest
naturalny
procesem
przebiegającym
prawie
natychmiast po połączeniu się
fagosomu z lizosomem. Zdolność
przenikania bakterii przez błony
wakuoli
jest
uwarunkowana
aktywnością
hemolityczną3.
Głównym czynnikiem wirulencji
L. monocytogenes
jest
białko
hemolityczne - listeriolizyna O
(LLO) należąca do cytolizyn
zależnych od cholesterolu - CDC
(Cholesterol
Dependent
Cytolysins), tej samej rodziny
białek
co
streptolizyna
O
Streptococcus
pyogenes
i perfringolizyna O Clostridium
perfringens.
Charakterystyczną
cechą LLO odróżniającą ją od
reszty toksyn z rodziny CDC,
unikalną zresztą również w skali
Rys. 2.
wszystkich hemolizyn bakteryjnych
jest niska aktywność w neutralnym
Cykl życiowy L. monocytogenes.
pH z optimum aktywności w niskim
pH. Dzięki tej właściwości LLO L. monocytogenes nie pozostaje długo zamknięta wewnątrz
fagolizosomu. Insercja listeriolizyny wewnątrz błony wywołuje wytworzenie kanałów w błonie
fagosomu, a w końcu rozpad błony fagosomu. Proces ten wspomagają dwie fosfolipazy: A
i B.
Ruch bakteri w cytoplazmie jest możliwy dzięki zjawisku kontrolowanej polimeryzacji
filamentów aktynowych znajdujących się w cytoplazmie gospodarza. Odpowiedzialny za ten
proces ze strony komórki bakteryjnej jest produkt genu actA. Zadaniem białka ActA jest
organizacja kompleksów białkowych zawartych w komórkach gospodarza w celu
pośrednictwa przy tworzeniu filamentów aktynowych na jednym z biegunów komórki
bakteryjnej, dzięki którym Listeria jest efektywnie przesuwana w jednym kierunku. Powstaje
charakterystyczna struktura, zwana kometą listeryjną, która umożliwia przemieszczanie się
bakterii nawet do sąsiednich komórek w organizmie gospodarza. Po przejściu do sąsiedniej
komórki L. monocytogenes zostaje zamknięta w podwójnej błonie fosfolipidowej – jednej
z komórki w której dotychczas przebywała i drugiej, do której właśnie przeniknęła. Ucieczka
z podwójnej wakuoli jest odpowiednio trudniejsza – o ile w przypadku pojedynczej
czynnikiem niezbędnym, a zarazem wystarczającym jest sama LLO to liza podwójnej błony
3
Bielecki J., Youngman P., Connely P., Portnoy D.A. 1990. Bacillus subtilis expressing haemolysin
gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells. Nature 345: 175-176
2
nie jest możliwa bez udziału fosfolipaz, w szczególności PlcB. Po ucieczce z podwójnej
wakuoli patogen znajduje się w cytoplazmie sąsiedniej komórki i cykl się zamyka. Cykl
obrazuje rys. nr 2.
Jak zaznaczono na rys. 2, wiele bakterii ulega degradacji w fagosomie. Fakt ten ma
również
konsekwencje
dla
odpowiedzi
immunologicznej
wywoływanej
przez
L. monocytogenes.
W
przypadku
profesjonalnych komórek prezentujących
antygen (ang. Antigen Presenting Cells komórki
dendrytyczne,
makrofagi,
limfocyty B) obce białka poddane
działaniu enzymów proteolitycznych
obecnych w fagosomie, przyłączają się
do rowka wiążącego antygen cząsteczki
MHC (ang. Major Histocompatibilty
Complex) - układu zgodności tkankowej,
który dotej pory był zablokowany przez
peptyd
CLIP
(class
II-associated
peptide). Po czym cząsteczki są
transportowane na powierzchnie komórki
i prezentowane w kompleksie zgodności
tkankowej klasy II (MHC II). Prowadzi to
do aktywacji limfocytów T pomocniczych
(CD4+), które pomagają ograniczyć
postęp infekcji, gdyż wspomagają
Rys. 3.
zarówno
odpowiedź
humoralną
Szlaki prezentacji antygenów.
(produkcja przeciwciał przez limfocyty B
i aktywacja
układu
dopełniacza)
i odpowiedź komórkową przez stymulację limfocytów T.
Najbardziej charakterystycznym efektem infekcji L. monocytogenes jest wysoce wydajna
aktywacja limfocytów CD8 które są niezbędne do eradykacji infekcji. Cecha a ma
pierwszorzędne znaczenie w licznych projektach wykorzystania tej bakterii jako szczepionki,
które zostaną przedstawione w kolejnych rozdziałach. Cytolizyna warunkuje uwolnienie
bakterii do cytozolu, a wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii powoduje prezentacje białek
patogena na powierzchni komórki przy udziale MHC klasy I oraz indukcje specyficznych
limfocytów T cytotoksycznych. Białka (antygeny) wydzielane przez obecne w cytozolu
komórki Listeria ulegają proteolizie przez cytoplazmatyczne enzymy. Umożliwia to
dostarczenie dostarczenie rozpuszczalnych antygenów do TAP - zależnego szlaku
cytoplazmatycznego (Transporter Associated with antigen Processing), dostarczenie ich do
retikulum endoplazmatcznego i w konsekwencji prezentację antygenu w kompleksie z MHC I
co może prowadzić do generowania limfocytów CD8+ przeciw antygenom wydzielanym
przez wewnątrzkomórkową L. monocytogenes. Ilustruje to rys. 3.
Powyżej przedstawiony właściwości L. monocytogenes sprawiają, że jest on idealnym
kandydatem na szczepionkę nowej generacji, zdolnej do indukcji odpowiedzi komórkowej.
Zalety L. monocytogenes jako szczepionki można podsumować w następujących
punktach:
•
•
•
•
•
•
•
Indukcja odpowiedzi komórkowej
Infekcja APC
Niska częstość zakażeń w populacji
Łatwość manipulacji genetycznych
Bezpieczeństwo
Stabilność
Ekonomiczna
3
Naturalnie zastosowanie każdego organizmu patogennego jako szczepionki wymaga
jego atenuacji. Alternatywą jest zastosowanie bakterii niepatogennej, która nabywa
w pewnym stopniu zdolności inwazyjnych dzięki sklonowaniu wybranych determinant
patogenezy. Taki proces jest swego rodzaju odwrotnością atenuacji.
B. subtilis zawierający wklonowany do kasety SPAC gen kodujący hemolizynę
L. monocytogenes (Rys. 4) stał się zdolny do wniknięcia do wnętrza komórek
eukariotycznych. Wprowadzenie jednego obcego genu umożliwia komórkom Bacillus
dostanie się do cytoplazmy i przeżycie w tym całkowicie obcym środowisku. Do wnętrza
kasety SPAC można doklonować następne konstrukcje genetyczne umożliwiające
wydzielanie przez bakterie znajdujące się wewnątrz cytoplazmy dodatkowych białek.
Tak skonstruowany szczep bakteryjny staje się biologiczną strzykawką, nośnikiem służącym
do indukcji oporności typu komórkowego skierowanej przeciwko dowolnemu organizmowi
Rys. 4. Mapa fizyczna sekwencji zintegrowanych w chromosomie B. subtilis
umożliwiających ekspresję listeriolizyny O pod kontrolą indukowanego przez IPTG
promotora pspac . pBR- sekwencje pochodzące z plazmidu pBR322; Tn- sekwencje
pochodzące z transpozonu Tn 917; strzałka ciągła oznacza konstytutywną
transkrypcję z promotora p.pcn; strzałka przerywana oznacza transkrypcję
z promotora p.spac indukowaną obecnością IPTG.
patogennemu. Przedstawiony system immunizacyjny wykorzystujący B. subtilis jest wysoce
bezpieczny ponieważ:
szczep jest niesporogennym mutantem delecyjnym nie posiadającym zdolności
do wzrostu poza środowiskiem laboratoryjnym,
wprowadzone geny znajdują się w zintegrowanej z bakteryjnym chromosomem
kasecie SPAC, są one pod silną i ścisłą kontrolą.
Szczep wykorzystywany do immunizacji powinien zawierać wkolowany w kasecie SPAC
gen kodujący LLO i białko przeciwko któremu miała by powstać odpowiedź immunologiczna
organizmu. Konstrukcje genetyczne wytwarzane w naszym laboratorium posiadają
dodatkowo kopie innych białek biorących udział w przebiegu procesu patogenezy Listeria.
W celu zwiększenia wydajności internalizacji komórek Bacillus subtilis do wnętrza tkanki
nabłonkowej do konstrukcji pAG58hly doklonowano następne geny Listeria. Dalsze prace
przeprowadzone w naszym laboratorium pozwoliły rozszerzyć rodzinę plazmidów pAG58hly.
Otrzymano konstrukcje np. eksprymujące listeryjną hemolizynę i fosfolipazę. Uzyskany
zestaw konstrukcji genetycznych pozwoli zbadać współdziałanie determinant procesu
patogenezy Listeria, umożliwi zbadanie wpływu eksprymacji hemolizyny i fosfolipazy na
komórki eukariotyczne.
Reakcje PCR (PCR, ang. polymerase chain reaction) umożliwiają wyizolowanie z masy
DNA chromosomalnego bakterii pojedynczych genów i uzyskanie ich w dużej ilości. PCR
czyli łańcuchowa reakcja polimeryzacji jest metodą powielania łańcuchów DNA in vitro,
polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Istotną zaletą tej
techniki jest fakt, że wybrany do powielania segment DNA nie musi być oddzielony od reszty
genomowego DNA przed rozpoczęciem amplifikacji. Po powieleniu segment z łatwością daje
zwizualizować dzięki elektroforezie na żelu agarozowym. Do środowiska reakcji
4
wprowadzamy matrycowy DNA chromosomalny badanego szczepu, trifosforany
deoksyrybonukleotydów, primery zawierające sekwencje flankujące interesujące nas geny
oraz termostabilną polimerazę (np. polimeraza Taq pochodzącą z bakterii Termofilus
aquaticus). W wyższej temperaturze pękają wiązania wodorowe, i podwójna helisa rozdziela
się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej do każdego łańcuch przyłączają
się primery i każdy łańcuch dobudowuje sobie drugi komplementarny dołączając
odpowiednie nukleotydy. Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji
z jednej molekuły otrzymalibyśmy 2n molekuł. W praktyce wydajność jest mniejsza, co nie
zmienia faktu że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w diagnostyce klinicznej
(wykrywanie L. monocytogenes poprzez amplifikację genu hly), klonowanie genów
(przeniesienie genu hly z L. monocytogenes do B. subtilis) oraz kontroli GMO
(w analizowanym przypadku wykrywanie zrekombinowanego szczepu B. subtilis, niosącego
gen hly).
Przebieg ćwiczenia
Podczas ćwiczeń studenci izolują próbkę DNA chromosomowego zrekombinowanych
szczepów Bacillus subtilis i przygotowują PCR na matrycy uzyskanego preparatu DNA
(dzień I.), a następnie mierzą aktywność hemolityczną badanych szczepów (dzień II.).
Materiały i metody
Szczepy bakterii:
979 - B. subtilis MB4 (wt -kontrola),
BR1S - B. subtilis pAG/hly
Dzień I. – Izolacja DNA chromosomowego B. subtilis i PCR
Izolacja DNA chromosomowego B. subtilis
(przygotowują prowadzący dzień wcześniej)
1. Założyć hodowlę nocną B. subtilis
(praca grup studenckich)
1. Zwirować 1,5 mL nocnej hodowli bakterii (8 tys. RPM / 5 min.)
2. Zlać supernatant, usunąć resztki supernatantu przy pomocy pipety
3. Osad zawiesić w 0,5 mL 0,1 x SSC
4. Zwirować jak w pkt. 1.
5. Zlać supernatant, osad zawiesić w 0,1 mL roztworu Lys (zawiera lizozym)
6. Inkubować 30-60 min. w temperaturze 37oC
7. Dodać 0,2 mL roztworu LT i 20 µL roztworu Proteinazy K (pK)
8. Całość wymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37oC
9. Przenieść próbkę do 75oC i inkubować 5 min.
10. Próbkę intensywnie worteksować 20 sek.
11. Wirować 3 min. przy 14 tys. RPM
12. Pobrać supernatant i nanieść na kolumnę do oczyszczania genomowego DNA
13. Wirować 1 min. przy 14 tys. RPM
14. Wyjąć minikolumnę z probówką i dodać do kolumny 0,5 mL roztworu płuczącego A1
15. Wirować 1 min. przy 14 tys. RPM
16. Przenieść kolumnę do nowej probówki à 2 mL i dodać do kolumny 0,4 mL roztworu A1
5
17. Wirować 2 min. przy 14 tys. RPM
18. Osuszoną kolumnę umieścić w nowej probówce à 1.5 mL i do złoża na dnie kolumny
dodać 0,1 mL buforu Tris (10 mM Tris.HCl; pH 8.5) uprzednio ogrzanego do temperatury
75oC
19. Inkubować próbkę przez 5 min. w temperaturze pokojowej
20. Wirować 1 min. przy 14 tys. RPM
21. Minikolumnę usunąć, a preparat oczyszczonego DNA użyć do nastawienia PCR
Przygotowanie PCR (praca jałowa!):
Do jałowej mini-probówki dodać:
16 µL jałowej wody dejonizowanej (H2O)
2 µL buforu (B)
0,4 µL dNTPs
0,5 µL startera prawego pRhly2200 (2 µM)
0,5 µL startera lewego pLhly2200 (2 µM)
0,1 µL polimerazy Taq (POL)
0,5 µL preparatu chromosomowego DNA
Dzień II.
Analiza produktu reakcji PCR (z dnia I.)
1. 10 µL produktu PCR przenieść do nowej probówki
1. dodać 2 µL barwnika
2. Próbki nanieść do dołków
3. Nałożyć wzorzec (5 µL)
4. Próbki rozdzielić na 0,7% żelu agarozowym
5. Żel barwić w roztworze bromku etydyny o stężeniu 10 µg x ml-1
6. Sporządzić dokumentację fotograficzną rozdziału DNA
6
Określenie aktywności hemolitycznej supernatantu pohodowlanego
Wykonanie testu:
1. Przygotowanie krwi:
0,2 mL krwi baraniej zawiesić w 0,8 mL PBS o odpowiednim pH, zwirować (1200
RPM, 5 min., 4oC), odrzucić supernatant, krwinki zawiesić w PBS (dodać PBS do
objętości 1 mL); płukanie powtórzyć jeszcze dwukrotnie - wykonać łącznie
3 wirowania.
2. Przygotowanie próbek do testu (każda próba i kontrole w 3 powtórzeniach)
880 µL (lub 800 µL) PBS + 100 µL zawiesiny erytrocytów w PBS, preinkubować
w 37oC przez 15 min.
3. Do próbek (z pkt. 2.) dodać po 20 µL (lub 100 µL) otrzymanego supernatantu, SDS
0,5% (kontrola+), wody (kontrola-) i inkubować w 37oC przez 30 min.
4. Przygotować probówki eppendorfa do rozcieńczeń (rozpipetować po 900 µL wody)
5. Po 30 min. zwirować próbki (1,2 tys. RPM, 5 min.)
6. 100 µL supernatantu rozcieńczyć 10x w odpowiednich probówkach eppendorfa.
7. Zmierzyć absorbancję przy 410 nm. (próba ślepa = kontrola-)
8. Obliczenie aktywności w jednostkach hemolitycznych [HU, ang. haemolytic units] przy
następujących założeniach: absorbancja kontroli - = 0 HU, absorbancja
kontroli+(SDS)= 100 HU
7