O α - Wydział Chemii UW

Syntezy izotopomerów L-tyrozyny
i ich wykorzystanie do badania
mechanizmu działania β-tyrozynazy
Wojciech Augustyniak
Promotor: prof. dr hab. Marianna Kańska
Pracownia Peptydów
Wydział Chemii UW
1
Plan
Wstęp – ogólna charakterystyka β-tyrozynazy
Syntezy L-tyrozyny znakowanej:
• węglem 14C w pozycjach 1, 2, 3 i 1’ L-tyrozyny
• deuterem i trytem we wszystkich nielabilnych pozycjach L-tyrozyny
Badania mechanizmu działania β-tyrozynazy:
• mechanizm proponowany w literaturze
• wyniki i wnioski z badań kinetycznych efektów izotopowych:
wodoru 1H/2H i 1H/3H na kcat/Km, oraz 1H/3H na kcat
we wszystkich pozycjach w L-tyrozynie
węgla 12C/14C na kcat/Km w pozycjach 2, 3 i 1’ L-tyrozyny
• propozycja kinetycznego mechanizmu działania β-tyrozynazy
Podsumowanie
2
β-tyrozynaza
COOH
HO
NH2
+
O
TPL
H2O
PLP
HO
+
COOH
+
NH3
podczas reakcji ulega rozerwaniu wiązanie pomiędzy alifatycznym
i aromatycznym atomem węgla
proton z pozycji α jest częściowo przenoszony na atom węgla 1’ reszty aromatycznej
katalizuje także reakcję syntezy L-tyrozyny z pochodnych fenolu i pirogronianu,
racemizację alaniny, wymianę atomu wodoru α w kilku L-aminokwasach
oraz deaminację atomu węgla α
do aktywności katalitycznej konieczne są kationy jednowartościowe
(K+, Rb+, Cs+ lub NH4+); jony Na+ i Li+ to inhibitory TPL
3
β-tyrozynaza
inaczej: fenololiaza tyrozynowa
TPL, E.C. 4.1.99.2.
występowanie: Gram-ujemne
Enterobacteriaceae i niektóre stawonogi
budowa: białko α/β
wymiary 135Å x 60Å x 144Å
4 podjednostki po 51kDa
symetria P212121
znana struktura krystalograficzna
zastosowanie:
biotechnologiczne otrzymywanie dopy
oznaczanie PLP w materiale biologicznym
utylizacja odpadów fenolowych
4
Synteza [1-14C]-L-tyrozyny
Cl
COONa
K 14C N
NaOH
14
N C
HO
COOH
48%
14
C
COOH
O
CHO
82%
14
HO
C
NH2
O
OH
OH
OH
PMO
48%
14
C
NH2
O
PAL
14
C
O
37%
5
Synteza [2-14C]-L-tyrozyny
COOH
H
14
H
C
COOH
CHO
+
H
14
85%
44%
HO
H2 N
14
H
C
COOH
PMO
63%
C
COOH
PAL
H2 N
14
H
C
COOH
6
Synteza [3-14C]-L-tyrozyny
O
OH
14
C H
H
14
YADH
C
H
22%
14
COOH
H HOOC
COOH
C
63%
5.0%
H
14
HO
H
H
C
PAL
COOH
NH2
PMO
28%
14
H
C
COOH
NH2
7
Synteza [1’-14C]-L-tyrozyny
O
COOEt
H214C
COOH AgNO3
COOAg
H214C
80%
COOH
EtI
COOEt
O
COOEt
70%
H214C
60%
COOAg
14
C
OH
96%
COOH
S
HO
NH2
14
C
COOH
NH2
COOH
H
14
C
TPL
12%
NaOH
14
Cu
C
∆
OH
2.4%
OH
8
Syntezy [2-2H]-L-tyrozyny
OH
+
S
COOH
NH2
COOH
D
NH2
TPL
D2O
HO
24%
100%
HO
Trpaza
D2O
COOH
NH2
9
Syntezy [2-3H]-L-tyrozyny
CHO
COOH
COOH
HTO
61%
COOH
COOH
T
COOH
T
77%
40%
PAL
COOH
T
NH2
82%
COOH
HO
NH2
Trpaza
HTO
HO
PMO
COOH
T
NH2
98%
10
Synteza [3R-2H]- i [3R-3H]-L-tyrozyny
D
COOH
PAL
D
COOH
D
PMO
NH2
COOH
HO
T
T
COOH
PAL
20%
NH2
1.9%
T
COOH PMO
NH2
COOH
95%
HO
NH2
11
Synteza [3S-2H]- i [3S-3H]-L-tyrozyny
D
COOH
COOH
PAL
D2O
HO
NH2
HO
0.46%
T
COOH
COOH
PAL
HTO
HO
NH2
HO
5.8%
OH
14
C
O
T
PAL
HTO
OH
14
C
NH2
O
T
PMO
82%
OH
14
HO
C
O
NH2
10%
12
Syntezy [2’,6’-3H2]-L-tyrozyny
T
K2PtCl4
HCl
HTO
OH
85%
T
T
T
T
OH
T
T
HCl
H2O
79%
OH
COOH
S
10%
NH2
TPL
T
T
COOH
T
NH2
COOH
PMO
58%
HO
T
NH2
13
Mechanizm działania β-tyrozynazy
-
O-
-O P
O
O
K257
N
O-
HO
-O P
N
HO
+
O
COO -
- OOC
NH
+ 3
HO
O
P
+
N
H
-OOC
O-O P
O
OH
O
O
+
O
N
COOH
NH
+
-O
O
O-
O-O P
O
HO
O
- OOC
+
N
H
-O
O
OH
NH
+
O
O P
O
O
-OOC
NH
+
+
N
H
-O
+
N
H
O
O
O
NH
+
+
NH3
14
Kinetyczne efekty izotopowe
α = vL/vH
Metody wyznaczania KIE:
niekonkurencyjna (KIE na Vmax i na Vmax/Km) poprzez bezpośrednie pomiary
parametrów kinetycznych dla reakcji z obydwoma izotopologami badanego
związku o wzbogaceniu bliskim 100%; KIE oblicza się z bezpośredniego
porównania Vmax i Vmax/Km dla reakcji z obydwoma izotopologami. Zaleta
metody – wyznaczenie KIE na Vmax; wada – duże błędy eksperymentalne
konkurencyjna (KIE na Vmax/Km) poprzez pomiary względnej zawartości
izotopologów w ich mieszaninie w substratach (R0) i produktach reakcji (Rp);
KIE oblicza się z równania Bigeleisena:
R
ln(1− f ∗ p )
R0
α=
ln(1− f)
Zaleta metody – duża precyzja; wada – nie można zmierzyć KIE na Vmax
15
Metoda niekonkurencyjna wyznaczania KIE
w reakcji katalizowanej przez β-tyrozynazę
COOH
HO
NH2
+
H2O
1U/ml TPL
50µM PLP
pH 8.3
0.1M KPi
0.2M KCl
1mM DTT
O
+
COOH
HO
+
NH3
20U/ml LDH
0.4mM NADH
OH
COOH
Dodatek NADH i dużego nadmiaru LDH czyni
reakcję nieodwracalną i umożliwia bezpośredni
pomiar kinetyki poprzez spektrofotometryczny
pomiar spadku absorpcji przy 340nm
Pomiar szybkości reakcji dla różnych stężeń
L-tyrozyny umożliwia wyznaczenie Vmax i Km
z równania Michaelisa-Menten
v
Vmax
0.5 Vmax
v=
Km
Vmax ∗ [S]
(K m + [S])
[S]
16
Metoda konkurencyjna wyznaczania KIE
w reakcji katalizowanej przez β-tyrozynazę
COOH
HO
NH2
+
H2O
1U/ml TPL
50µM PLP
O
+
pH 8.3
0.1M KPi
0.2M KCl
1mM DTT
COOH
HO
+
NH3
20U/ml LDH
2eq NADH
OH
COOH
W badaniach stosowałem metodę podwójnego znakowania stosując znacznik 1-14C
(podczas określania KIE 1H/3H), oraz 3’,5’-3H2 (KIE 12C/14C) jako standardy wewnętrzne
NADH i LDH przekształcają nietrwały pirogronian w trwały L-mleczan
Po rozdziale produktów i substratów za pomocą chromatografii jonowymiennej
wyznaczałem radioaktywność właściwą wyjściowych substratów (R0), produktów (Rp)
i stopień konwersji (f); KIE obliczałem używając równanie Yankwicha-Tonga:
ln(1 − f ∗
α=
R0
)
Rp
ln(1 − f)
17
1H/3H
HO
KIE w pozycji α
Reakcja w H2O
COOH
H
NH2
R0/Rp rośnie podczas reakcji od wartości
odpowiadającym odwrotnemu KIE do dużych
wartości normalnych
R0/Rp nie zależy w prosty sposób od stężeń
produktów i substratów reakcji oraz od czasu
reakcji
Eksperyment 1H-NMR wykazał szybką wymianę
protonu α z wodą na początku reakcji
Początkowa wymiana trytu z wodą powoduje
obniżenie wartości R0/Rp na początku reakcji, i jej
wzrost w miarę zachodzenia reakcji eliminacji
Mniej niż 1% trytu z pozycji α jest przenoszone
na atom węgla 4’ powstającego fenolu
3,00
2,50
2,00
R0/Rp
1,50
1,00
0,50
-
0,10
0,20
0,30
0,40
f
Reakcja w D2O
4,00
3,50
3,00
2,50
R0/Rp
2,00
1,50
1,00
0,50
-
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
f
18
1H/2H
KIE w pozycji α
Kinetyczny
efekt izotopowy
HO
COOH
H
NH2
αV
Rozpuszczalnikowy
efekt izotopowy
αV
αV/K
1.49
± 0.06
1.81
± 0.25
[2-2H]-L1.46
tyrozyna ± 0.11
1.67
± 0.31
αV/K
H2O
3.34
2.42
± 0.25 ± 0.29
D2O
3.28
2.24
± 0.13 ± 0.61
L-tyrozyna
Pierwszorzędowe KIE świadczą o bezpośrednim zaangażowaniu atomu
wodoru α podczas reakcji
Niezależność KIE α i rozpuszczalnikowego efektu izotopowego
świadczy o tym, że atom wodoru α i cząsteczka wody biorą udział w tym
samym stanie przejściowym
Porównanie KIE α na Vmax i na Vmax/Km wskazuje na to, że oderwanie
protonu α ma większe znaczenie dla szybkości reakcji, niż jego następcza
wymiana z rozpuszczalnikiem
19
KIE wodoru w pozycjach β
H
H
COOH
COOH
NH2
HO
HO
NH2
Tα
V/K = 1.09 ± 0.03
5,00
4,00
Tα
V/K
H H
3,00
COOH
2,00
1,00
HO
-
0,10
0,20
f
0,30
0,40
NH2
Dα = 1.09 ± 0.04
V
Dα
V/K = 0.98 ± 0.10
KIE trytu w pozycji βS jest normalny i rośnie podczas reakcji do wartości
typowych dla efektów pierwszorzędowych, podczas gdy KIE trytu w pozycji βR
jest drugorzędowy i nie zmienia się podczas reakcji
Tryt w powstającym pirogronianie ulega szybkiej i całkowitej wymianie z wodą;
nie ma wymiany trytu wyjściowej L-tyrozyny z rozpuszczalnikiem
20
KIE wodoru w pierścieniu aromatycznym
H
COOH
HO
H
NH2
Tα
V/K = 0.917 ± 0.015
Dα = 1.04 ± 0.05
V
Dα
V/K = 0.99 ± 0.12
COOH
H
NH2
HO
H
Tα
V/K = 1.003 ± 0.007
Dα = 1.26 ± 0.06
V
Dα
V/K = 0.99 ± 0.11
Odwrotny KIE trytu w pozycji 2’,6’ L-tyrozyny świadczy o podobieństwie
otoczenia tych atomów wodoru pomiędzy stanem przejściowym najwolniejszego
etapu a fenolem (produktem reakcji) związanym z enzymem
Znaczący KIE deuteru na Vmax w pozycji 3’,5’ L-tyrozyny może być wywołany
bliskością grupy hydroksylowej zaangażowanej w dearomatyzację i rearomatyzację układu podczas reakcji
KIE deuteru na Vmax w pozycji 3’,5’ L-tyrozyny w porównaniu do KIE na Vmax/Km
świadczy o istotności tych atomów wodoru dla dysocjacji kompleksu enzymfenol
21
12C/14C
H H
C
COOH
C H
NH2
HO
KIE
NH2
HO
14α
V/K
1,05
COOH
= 1.045 ± 0.015
1,00
αV/K
C
0,95
HO
0,90
COOH
NH2
14α
V/K
= 1.004 ± 0.007
0,85
-
0,10
0,20
0,30
0,40
f
22
Kinetyczny model reakcji
katalizowanej przez β-tyrozynazę
E + S
k1
k-1
EQ
k2
PhOH
k-2
PhOH
Szybkość reakcji:
Vmax / K m =
k3
EA
E + P
Początkowa szybkość reakcji:
k 3 ∗ k 2 ∗ k 1 ∗ [E]
k 3 ∗ k 2 + k 3 ∗ k −1 + k −1 ∗ k − 2 ∗ [PhOH ]
Vmax / K m =
k 2 ∗ k 1 ∗ [E]
k 2 + k −1
Stała inhibicji mieszanej dla fenolu:
Vmax /K m
k ∗ k −1 ∗ [PhOH]
[PhOH]
=1+
= 1 + −2
(Vmax /K m ) i
Ki
k 3 ∗ (k 2 + k −1 )
Ki =
k 3 ∗ (k 2 + k −1 )
k −2 ∗ k −1
substrat
rozpuszczalnik
Ki
[µM]
L-tyrozyna
H2O
144 ± 28
L-tyrozyna
D2O
149 ± 38
[3-2H2]-L-tyrozyna
H2O
96 ± 25
23
Podsumowanie
Wykonałem syntezę czterech izotopomerów L-tyrozyny znakowanych 14C w pozycjach
1, 2, 3 i 1’; trzech izotopomerów znakowanych deuterem w pozycjach 2, 3R i 3S; oraz
czterech izotopomerów znakowanych trytem w pozycjach 2, 3R, 3S i 2’,6’. W celu
otrzymania powyższych związków użyłem nowych podejść syntetycznych, które
umożliwiły mi otrzymanie powyższych związków po raz pierwszy
Otrzymane związki użyłem do wyznaczenia kinetycznych efektów izotopowych
w reakcji hydrolitycznego rozkładu L-tyrozyny katalizowanego przez fenololiazę
tyrozynową. 1H/2H KIE wyznaczałem metodą niekonkurencyjną używając pomiarów
kinetyki, a do badań efektów 1H/3H i 12C/14C użyłem metody konkurencyjnej
radiochemicznej. Łącznie wyznaczyłem 3 efekty węgla, 16 efektów deuteru
i 8 efektów trytu, a także poczyniłem wiele dodatkowych obserwacji
Wykonane przez mnie badania pozwoliły zaobserwować istotne i nieznane wcześniej
zjawiska (np. względną zmianę szybkości poszczególnych etapów procesu podczas
reakcji powodującą zmianę KIE; zaangażowanie protonu α i cząsteczki wody podczas
tego samego stanu przejściowego reakcji; oderwanie protonów z pozycji β i ich różne
zachowanie się podczas reakcji; istotność atomów wodoru w pozycji 3’,5’ podczas
końcowych etapów reakcji), które rzuciły nowe światło na badany przeze mnie
mechanizm
24
Podziękowania
prof. Marianna Kańska
dr Ryszard Kański
Koleżanki i koledzy z zespołu (w szczególności dr Jacek Jemielity, dr Jarosław
Bukowski, mgr Piotr Suchecki, mgr Elżbieta Boroda, mgr Małgorzata Kozłowska,
mgr Edyta Panufnik); i uczestnicy programu Krajowego Funduszu na rzecz Dzieci:
Radosław Lipiński, Łukasz Jaremko, Mariusz Jaremko, Joanna Sekuła i Jarosław
Prus
prof. Robert Phillips (University of Georgia)
prof. Floris Rutjes, Christien Schortinghuis i pozostali członkowie grupy prof. Rutjesa
z University of Nijmegen
mgr Agnieszka Brzezińska (IBD PAN)
dr Aleksandra Wysłouch-Cieszyńska, mgr Joanna Żuberek, Lilia Żukowa, mgr Jacek
Olędzki (IBB PAN)
mgr Paweł Okulski, mgr Grzegorz Wrona (IBD PAN)
prof. Piotr Paneth (Politechnika Łódzka)
mgr Grzegorz Łach (Pracownia Chemii Kwantowej)
mgr Marcin Nowogródzki (IChO PAN)
25