AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)

AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)
Novazym Products
Novazym Polska ul. Żywokosto wa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10,
39 11, email info @no vazym.co m
fax +48 0 61 610
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR
Mix Plus (ROX)
Gotowy premix zawierający polimerazę hot-start i barwnik fluorescencyjny
EvaGreen® do prowadzenia analiz ilościowych metodą Real-time qPCR
(zawiera barwnik referencyjny ROX)
Numer katalogowy produktu
EVQ-0500R (500 reakcji)
EVQ-1000R (1000 reakcji)
Wydanie 1 (Grudzień 2012)
Novazym Polska s.c., ul. Żywokosto wa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP
9721099648, email [email protected], www.novazym.com
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)
1. Przeznaczenie
Premix przeznaczony jest do prowadzenia ilościowych reakcji PCR z analizą ilości
produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR). W Real-time PCR wykorzystuje się
barwniki fluorescencyjne lub sondy molekularne w celu monitorowania przyrostu ilości
produktu amplifikacji, w każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym. Dzięki temu cała
procedura analizy jest bardzo szybka i pozwala wyeliminować etap rozdziału i oceny
produktu po zakończeniu reakcji. Umożliwia ona także wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym
idzie pozwala na oszacowanie ilości DNA w matrycy podanej do reakcji, co jest niemożliwe
w konwencjonalnej reakcji PCR. Ponadto ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest
minimalizowane dzięki temu, że reakcja i detekcja produktu odbywa się w jednym
zamkniętym naczyniu.
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX) jest gotową do użycia mieszaniną do
prowadzenia analiz qPCR. Premix zawiera wszystkie niezbędne komponenty reakcji, czyli:
polimerazę hot-start, mieszaninę ultra czystych dNTPs [10 pmol/µl], MgCl 2 , wiążący się do
dsDNA barwnik EvaGreen® oraz barwnik referencyjny ROX. Aby przygotować reakcję,
należy do premixu dodać wodę, startery oraz matrycę DNA.
Polimeraza hot-start jest aktywowana przez 15-minutową inkubację w 95 °C. Ta właściwość
uniemożliwia wydłużanie starterów, które hybrydyzują do matrycy w miejscach
niespecyficznych oraz zapobiega powstawaniu dimerów starterów w ni skiej temperaturze
podczas reakcji qPCR.
EvaGreen® jest barwnikiem fluorescencyjnym nowej generacji, który wiąże się ilościowo do
dwuniciowego DNA. W przypadku braku dsDNA fluorescencja pozostaje na bardzo niskim
poziomie (1-4 % false positive). Zakres widma barwnika EvaGreen® jest podobny do barwnika
SYBR® Green, jednak może stanowić lepszą alternatywę do analiz qPCR ze względu na kilka
cech tj. wysoka stabilność, nie inhibuje reakcji PCR oraz udowodniono, że nie jest mutagenny
ani cytotoksyczny. EvaGreen® jest kompatybilny z większością dostępnych platform do analiz
Real-time PCR, po ustawieniu tych samych parametrów, jak dla SYBR ® Green lub FAM.
EvaGreen® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy BIOTUM, INC.
ROX jest wewnętrznym pasywnym barwnikiem referencyjnym, który umożliwia normalizację
sygnału fluorescencyjnego reportera, generowanego w reakcji qPCR.
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX) może być z powodzeniem wykorzystywany
w następujących aplikacjach:
 analiza jakościowa i ilościowa materiału genetycznego DNA i cDNA
 profilowanie ekspresji genów
 detekcja mikrobiologiczna
 określanie obciążeń wirusowych.
2
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)
2. Zasada działania testu
W reakcji Real-time PCR analizowany jest przyrost ilości produktu w czasie
rzeczywistym. Przyrost ilości kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest
monitorowany w każdym cyklu reakcji amplifikacji. W technice Real -time PCR wyznacznikiem
początkowej ilości matrycy DNA w reakcji jest ilość cykli (C T), po których kinetyka reakcji
wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu. Ilość produktu w reakcji PCR wzrasta wykładniczo
z każdym cyklem, aż do momentu, wyczerpania się któregoś z komponentów reakcji.
Zawartość zestawu
Lp.
[1]
KOLOR
Żółty
[2]
[3]
Żółty
Biały
ELEMENT
AmpliQ 5x HOT EvaGreen®
qPCR Mix Plus (ROX)
MgCl2 [25 mM]
H2 O MQ do reakcji PCR
500 reakcji
1
1
1
1000 reakcji
4
1
1
Skład mieszaniny AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)






Polimeraza DNA hot-start
Bufor reakcyjny 5x EvaGreen® qPCR buffer
MgCl 2 12.5 mM
Mix dNTPs 10 pmol/µl
Barwnik EvaGreen®
Barwnik referencyjny ROX.
Przechowywanie



-20 °C
Chronić przed światłem
Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
3. Przeprowadzenie testu PCR
Zalecany program reakcji Real-time qPCR
Etap
reakcji
Denaturacja
wstępna
Amplifikacja
Krzywa
topnienia
Chłodzenie
Metoda
analizy
-
Ilość
cykli
1
Quantification
40
Melting
1
(2)
-
1
denaturacja
(1)
hybrydyzacja
elongacja
denaturacja
hybrydyzacja
elongacja
Temperatura
Czas
95 °C
15 min
Pomiar
fluorescencji
-
95 °C
60 - 65 °C
15 s
20 s
-
72 °C
90 °C
75 °C
95 °C
slope = 0,1 °C/s
40 °C
20 s
15 s
15 s
0s
single
continuous
30 s
3
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
SKŁADNIK
OBJĘTOŚĆ
STĘŻENIE KOŃCOWE
[1]
AmpliQ 5x HOT EvaGreen®
(1)
qPCR Mix Plus [5x]
4 µl
[1x]
[2]
Starter forward [10 pmol/µl]
0,16 – 0,5 µl
[80 – 250 nM]
[3]
Starter reverse [10 pmol/µl]
0,16 – 0,5 µl
[80 – 250 nM]
1 - 5 µl
[0,01 – 10 ng/µl]
[2.5 – 5 mM]
Lp.
[4]
Matryca DNA
[5]
Opcjonalnie MgCl2
MgCl 2 [25 mM]
należy
dostosować
[6]
H2O MiliQ
do 20 µl
RAZEM
(1)
20 µl
Premi x AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus [5x] zawiera w swoim składzie MgCl 2 w stężeniu 12.5 mM.
Stężenie końcowe MgCl 2 w reakcji 1x PCR wynosi 2.5 mM. Stężenie MgCl 2 zaleca się modyfikowa ć w zakresie
2.5 – 5 mM.
4. Interpretacja najczęściej spotykanych problemów w reakcji PCR




W przypadku braku produktu lub pojawienia się niespecyficznych produktów reakcji PCR
zalecamy przeprowadzenie optymalizacji metody poprzez zastosowanie:
gradientu temperatury hybrydyzacji starterów w zakresie +/- 5 °C od średniej Tm starterów
gradientu stężenia MgCl 2 w zakresie od 1.5 - 5 mM
kontroli pozytywnej reakcji, pozwalającej ocenić poprawność przebiegu amplifikacji
docelowego produktu
kontroli negatywnej reakcji, pozwalającej ocenić czystość odczynników używanych do reakcji
PCR (zamiast matrycy DNA do reakcji należy podać tę samą objętość wody).
Lot nr
Exp. date
Ograniczenia w zastosowaniu: Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został
przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych
z produkcją leków.
UWAGA! Pewne składniki buforu reakcyjnego oraz buforu służącego do przechowywania mogą działać silnie drażniąco. Radzimy
podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP.
4
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)
SHORT ENGLISH PROTOCOL
Description:
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX)
is an optimized ready-to-use solution for real-time
quantitative PCR assays, incorporating EvaGreen®
dye. It comprises all the components necessary to
perform qPCR: hot-start DNA Polymerase, 10
pmol/µl ultrapure dNTPs, MgCl 2, EvaGreen® dye
and ROX reference dye. The user simply needs to
add water, template and primers.
Hot-start DNA Polymerase is activated by a 15 min
incubation step at 95 °C. This prevents extension
of non-specifically annealed primers and primerdimers formed at low temperatures during qPCR
setup.
Applications:
Detection and quantification of DNA and cDNA
targets
Profiling gene expression
Microbial detection
Viral load determination
Mix Composition:
Hot-start DNA Polymerase
5x EvaGreen® qPCR buffer
MgCl 2 12.5 mM (1x PCR solution - 2.5 mM MgCl 2)
dNTPs mix 10 pmol/µl
EvaGreen® dye
ROX dye
EvaGreen® Dye:
EvaGreen® is a DNA-binding dye with many
features that make it a superior alternative to SYBR®
Green I for qPCR. Apart from having similar spectra,
EvaGreen® has three important features that set it
apart from SYBR® Green I: EvaGreen® has much less
PCR inhibition, is extremely stable dye and has
been shown to be nonmutagenic and noncytotoxic.
EvaGreen® is compatible with all common realtime PCR cyclers - simply select the standard
settings for SYBR ® Green or FAM!
ROX Dye:
ROX is an internal passive reference dye used to
normalize the fluorescent reporter signal
generated in qPCR.
Shipping and Storage conditions:
Routine storage: -20 °C
Shipping and temporary storage for up to 1 month
at room temperature has no detrimental effects
on the quality of AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR
Mix Plus (ROX).
Recommended qPCR reaction mix:
AmpliQ 5x HOT
4 µl
®
EvaGreen qPCR Mix Plus
Primer For [10 µM]
0.16-0.5 µl
Primer Rev [10 µM]
0.16-0.5 µl
DNA template
1-5 µl
ng/µl
H2O PCR grade
up to 20 µl
Recommended qPCR cycles:
Initial
95 °C
denaturation
Denaturation
95 °C
Annealing
60-65 °C
Elongation
72 °C
1x
80-250 nM
80-250 nM
0.01-10
15 min
x1
15 s
20 s
20 s
x40
Safety warnings and precautions:
This product and its components should be handled only by
persons trained in labora tory techniques . It is advisable to wear
suitable protecti ve clothing, such as laboratory overalls, gloves
and safety glasses. Ca re should be taken to a void conta ct wi th
skin or eyes . In case of contact wi th skin or eyes , wash
immediately wi th wa ter.
EvaGreen ® is a registered tradema rk of BIOTIUM, INC.
The purchas e of this product conveys to the buyer the nontransferable right to use the purchased amount of the product
and components of the product i n research conducted by
the buyer, w here such resea rch does not i nclude testing,
analysis or screening servi ces for any thi rd pa rty in return for
compensation on a per tes t basis. The buyer cannot sell or
otherwise tra nsfer (a) this product, (b) i ts components or (c)
ma terials made using this product or i ts components to a thi rd
pa rty or otherwise use this product or its com ponents or
materials made usi ng this product or its components for
Commercial Purposes.
SYBR ® is a registered tradema rk of Molecular Probes, Inc.
LightCycler® is a registered trademark of Roche Molecular
Sys tems , Inc. Some applicati ons this product is used in ma y
requi re a li cense whi ch is not provi ded by the purchase of this
product. Users should obtain the li cense if required .