AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix

AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix
Novazym Products
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10,
39 11, email [email protected]
fax +48 0 61 610
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR
SuperMix
Gotowy premix zawierający polimerazę hot-start i barwnik fluorescencyjny
EvaGreen® do prowadzenia analiz ilościowych metodą Real-time qPCR
Numer katalogowy produktu
EVQ-0500S (500 reakcji)
EVQ-1000S (1000 reakcji)
Wydanie 1 (Maj 2013)
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP
9721099648, email [email protected], www.novazym.com
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix
1. Przeznaczenie
Premix przeznaczony jest do prowadzenia ilościowych reakcji PCR z analizą ilości
produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR). W Real-time PCR wykorzystuje się barwniki
fluorescencyjne lub sondy molekularne w celu monitorowania przyrostu ilości produktu
amplifikacji, w każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym. Dzięki temu cała procedura analizy jest
bardzo szybka i pozwala wyeliminować etap rozdziału i oceny produktu po zakończeniu reakcji.
Umożliwia ona także wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie ilości DNA
w matrycy podanej do reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej reakcji PCR. Ponadto ryzyko
zanieczyszczenia badanej próby jest minimalizowane dzięki temu, że reakcja i detekcja produktu
odbywa się w jednym zamkniętym naczyniu.
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix jest gotową do użycia mieszaniną do prowadzenia
analiz qPCR. Premix zawiera wszystkie niezbędne komponenty reakcji, czyli: polimerazę hot-start,
mieszaninę ultra czystych dNTPs [10 pmol/µl], MgCl2 oraz wiążący się do dsDNA barwnik
EvaGreen®. Aby przygotować reakcję, należy do premixu dodać wodę, startery oraz matrycę DNA.
Polimeraza hot-start jest aktywowana przez 12-minutową inkubację w 95 °C. Ta właściwość
uniemożliwia wydłużanie starterów, które hybrydyzują do matrycy w miejscach niespecyficznych
oraz zapobiega powstawaniu dimerów starterów w niskiej temperaturze podczas reakcji qPCR.
EvaGreen® jest barwnikiem fluorescencyjnym nowej generacji, który wiąże się ilościowo do
dwuniciowego DNA. W przypadku braku dsDNA fluorescencja pozostaje na bardzo niskim poziomie
(1-4 % false positive). Zakres widma barwnika EvaGreen® jest podobny do barwnika SYBR® Green,
jednak może stanowić lepszą alternatywę do analiz qPCR ze względu na kilka cech tj. wysoka
stabilność, nie inhibuje reakcji PCR oraz udowodniono, że nie jest mutagenny ani cytotoksyczny.
EvaGreen® jest kompatybilny z większością dostępnych platform do analiz Real-time PCR, po
ustawieniu tych samych parametrów, jak dla SYBR® Green lub FAM.
EvaGreen® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy BIOTUM, INC.
Szeroka kompatybilność z aparatami do Real-time PCR (niezależnie od wymagań barwnika ROX):
 Applied BioSystems: QuantStudio™ 12K Flex, ViiA™ 7, 7900HT, 7500, 7700,
StepOneTM & StepOnePlusTM
 Stratagene: MX3000PTM , MX3005PTM
 Bio-Rad: CFX96™ & CFX384™, iQ™5
& MyiQ™, Chromo4™, Opticon®
2 & MiniOpticon®
 Qiagen: Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 6000
 Eppendorf: Mastercycler®: ep realplex2 & ep realplex4
 Illumina: The Eco™
 Roche: LightCycler® 480
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix może być z powodzeniem wykorzystywany
w następujących aplikacjach:




analiza jakościowa i ilościowa materiału genetycznego DNA i cDNA
profilowanie ekspresji genów
detekcja mikrobiologiczna
określanie obciążeń wirusowych.
2
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix
Korzyści ze stosowania AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix:





bardzo specyficzne i powtarzalne analizy Real-time PCR
doskonała wydajność reakcji w przypadku małej ilości materiału
możliwość traktowania próbek UNG, dzięki obecności mieszaniny dUTP/dTTP
doskonała wydajność reakcji na matrycach długich (>500pz) oraz bogatych w pary GC
niebieski barwnik w premixie ułatwia pipetowanie
2. Zasada działania testu
W reakcji Real-time PCR analizowany jest przyrost ilości produktu w czasie rzeczywistym.
Przyrost ilości kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowany w każdym cyklu
reakcji amplifikacji. W technice Real-time PCR wyznacznikiem początkowej ilości matrycy DNA w
reakcji jest ilość cykli (CT), po których kinetyka reakcji wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu. Ilość
produktu w reakcji PCR wzrasta wykładniczo z każdym cyklem, aż do momentu, wyczerpania się
któregoś z komponentów reakcji.
Zawartość zestawu
Lp.
[1]
KOLOR
Pomarańczowy
[2]
[3]
Żółty
Biały
ELEMENT
AmpliQ 5x HOT EvaGreen®
qPCR SuperMix
MgCl2 [25 mM]
H2O MQ do reakcji PCR
500 reakcji
1
1
1
1000 reakcji
4
1
1
Skład mieszaniny AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix








Polimeraza DNA hot-start
Bufor reakcyjny 5x EvaGreen® qPCR buffer
MgCl2 12.5 mM
Mix dNTPs zawierający mieszaninę dUTP/dTTP
Barwnik EvaGreen®
Wewnętrzny barwnik referencyjny na bazie ROX
GC-enhancer
Niebieski barwnik wizualizacyjny
Przechowywanie
-20 °C
Chronić przed światłem
Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
3
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix
3. Przeprowadzenie testu PCR
Zalecany program reakcji Real-time qPCR
Etap
reakcji
Denaturacja
wstępna
Amplifikacja
Krzywa
topnienia
Chłodzenie
1)
Metoda
analizy
Ilość
cykli
Temperatura
Czas
-
1
95 °C
12 min
Pomiar
fluoresce
ncji
-
Quantification
40
denaturacja
hybrydyzacja
95 °C
60 - 65 °C
15 s
(1)
20-30 s
-
elongacja
denaturacja
hybrydyzacja
elongacja
72 °C
90 °C
75 °C
95 °C
slope = 0,1 °C/s
40 °C
(2)
Melting
-
1
1
(1)
20-30 s
15 s
15 s
0s
single
continuo
us
30 s
Należy zastosować czas 20 sek do amplifikacji matryc o długości < 150 pz
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
SKŁADNIK
AmpliQ 5x HOT EvaGreen®
(2)
qPCR SuperMix [5x]
OBJĘTOŚĆ
STĘŻENIE KOŃCOWE
4 µl
[1x]
[2]
Starter forward [10 pmol/µl]
0,2 – 0,4 µl
[100 – 200 nM]
[3]
Starter reverse [10 pmol/µl]
0,2 – 0,4 µl
[100 – 200 nM]
1 - 5 µl
[0,002 – 2 ng/µl]
[2.5 – 5 mM]
Lp.
[1]
[4]
Matryca DNA
[5]
Opcjonalnie MgCl2
MgCl2 [25 mM]
należy
dostosować
[6]
H2O MiliQ
do 20 µl
RAZEM
2)
20 µl
Premix AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix [5x] zawiera w swoim składzie MgCl2 w stężeniu 12.5 mM.
Stężenie końcowe MgCl2 w reakcji 1x PCR wynosi 2.5 mM. Stężenie MgCl2 zaleca się modyfikować w zakresie 2.5 – 5
mM.
4. Opcjonalnie - traktowanie próbek UNG
Program reakcji
Etap
reakcji
Traktowanie
UNG
Denaturacja
wstępna
Amplifikacja
Metoda
analizy
Ilość
cykli
Temperatura
Czas
-
1
50 °C
2 min
Pomiar
fluoresce
ncji
-
-
1
95 °C
12 min
-
Quantification
40
95 °C
60 - 65 °C
15 s
(1)
20-30 s
-
(2)
denaturacja
hybrydyzacja
elongacja
1)
72 °C
(1)
20-30 s
single
Należy zastosować czas 20 sek do amplifikacji matryc o długości < 150 pz
4
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
SKŁADNIK
AmpliQ 5x HOT EvaGreen®
(2)
qPCR SuperMix [5x]
OBJĘTOŚĆ
STĘŻENIE KOŃCOWE
4 µl
[1x]
[2]
Starter forward [10 pmol/µl]
0,2 – 0,4 µl
[100 – 200 nM]
[3]
Starter reverse [10 pmol/µl]
0,2 – 0,4 µl
[100 – 200 nM]
[4]
UNG (Uracil-N-glycosylase)
x µl
Lp.
[1]
[4]
Matryca DNA
(3)
1 - 5 µl
[0,002 – 2 ng/µl]
[2.5 – 5 mM]
[5]
Opcjonalnie MgCl2
MgCl2 [25 mM]
należy
dostosować
[6]
H2O MiliQ
do 20 µl
RAZEM
[0,01 U/µl]
20 µl
2)
Premix AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix [5x] zawiera w swoim składzie MgCl2 w stężeniu 12.5 mM.
Stężenie końcowe MgCl2 w reakcji 1x PCR wynosi 2.5 mM. Stężenie MgCl 2 zaleca się modyfikować w zakresie 2.5
– 5 mM.
3)
Należy zastosować ilość UNG podaną przez producenta odczynnika.
5. Interpretacja najczęściej spotykanych problemów w reakcji PCR
W przypadku braku produktu lub pojawienia się niespecyficznych produktów reakcji PCR zalecamy
przeprowadzenie optymalizacji metody poprzez zastosowanie:
gradientu temperatury hybrydyzacji starterów w zakresie +/- 5 °C od średniej Tm starterów
gradientu stężenia MgCl2 w zakresie od 1.5 - 5 mM
kontroli pozytywnej reakcji, pozwalającej ocenić poprawność przebiegu amplifikacji docelowego
produktu
kontroli negatywnej reakcji, pozwalającej ocenić czystość odczynników używanych do reakcji PCR
(zamiast matrycy DNA do reakcji należy podać tę samą objętość wody).
Lot nr
Exp. date
Ograniczenia w zastosowaniu: Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został przetestowany
w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych z produkcją leków.
UWAGA! Pewne składniki buforu reakcyjnego oraz buforu służącego do przechowywania mogą działać silnie drażniąco. Radzimy podczas
pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP.
5
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix
SHORT ENGLISH PROTOCOL
Description:
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix is an
optimised ready-to-use solution for real time
quantitative PCR assays, including EvaGreen® dye.
It comprises all the components necessary,
excluding the template and primers, to perform
highly sensitive qPCR.
Hot-start DNA Polymerase is activated by a 12 min
incubation step at 95°C. Hot-start mechanism
prevents extension of non-specifically annealed
primers and primer-dimers formed at low
temperatures during qPCR setup.
Wide instrument compatibility:
5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix is
designed for use with standard cycling mode on
standard and fast qPCR platforms regardless of
requirements in ROX. The mix is compatible with:
Applied BioSystems: QuantStudio™ 12K Flex,
ViiA™ 7, 7900HT, 7500, 7700, StepOneTM &
StepOnePlusTM
Stratagene: MX3000PTM , MX3005PTM
Bio-Rad: CFX96™ & CFX384™, iQ™5 & MyiQ™,
Chromo4™, Opticon® 2 & MiniOpticon®
Qiagen: Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 6000
Eppendorf: Mastercycler®: ep realple x2 & ep
realplex4
Illumina: The Eco™
Roche: LightCycler® 480
Benefits:
Highly specific and reproducible real time PCR
Excellent efficiency in case of low copy
number targets
UNG treatment capability due to dNTP blend
of dUTP/dTTP
Superior performance with long (up to 500 bp)
and GC-rich templates
Blue visualisation dye for easy pipetting
Applications:
Detection and quantification of DNA and
cDNA targets
Profiling gene expression
Microbial detection
Viral load determination
Mix Composition:
Hot-start DNA Polymerase
5x EvaGreen® qPCR buffer
MgCl2 12.5 mM (1x PCR solution - 2.5 mM MgCl2)
dNTPs dNTP blend containing dUTP/dTTP
EvaGreen® dye
Internal reference based on ROX dye
GC-enhancer
Blue visualisation dye
EvaGreen® Dye:
EvaGreen® is a DNA-binding dye with many features
that make it a superior alternative to SYBR® Green I for
qPCR. Apart from having similar spectra, EvaGreen®
has three important features that set it apart from
SYBR® Green I: EvaGreen® has much less PCR
inhibition, is extremely stable dye and has been
shown to be nonmutagenic and noncytotoxic.
EvaGreen® is compatible with all common real-time
PCR cyclers - simply select the standard settings for
SYBR® Green or FAM!
Shipping and Storage conditions:
Routine storage: -20 °C
Shipping and temporary storage for up to 1 month
at room temperature has no detrimental effects
on the quality of AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR
SuperMix.
Recommended qPCR reaction mix:
AmpliQ 5x HOT
4 µl
EvaGreen® qPCR SuperMix
Primer For [10 µM]
0.2-0.4 µl
Primer Rev [10 µM]
0.2-0.4 µl
DNA template
1-5 µl
H2O PCR grade
up to 20 µl
Recommended qPCR cycles:
Initial
95 °C
denaturation
Denaturation
95 °C
Annealing
60-65 °C
Elongation
72 °C
1x
100-200 nM
100-200 nM
0.002-2 ng/µl
12 min
x1
15 s
20 s
20 s
x40
IMPORTANT: To activate the polymerase, follow the incubation step at
95ºC for 12 minutes at the beginning of the qPCR cycle.
Use 20 sec for annealing and elongation for templates shorter than 150
bp.
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR SuperMix
OPTIONAL – UNG TREATMENT
Recommended qPCR reaction mix
additional UNG treatment
AmpliQ 5x HOT
4 µl
®
EvaGreen qPCR SuperMix
Primer For [10 µM]
0.2-0.4 µl
Primer Rev [10 µM]
0.2-0.4 µl
UNG
x µl
(Uracil-N-glicosylase)
DNA template
1-5 µl
H2O PCR grade
up to 20 µl
Recommended qPCR cycles
UNG treatment:
UNG Treatment 50 °C
Initial
95 °C
denaturation
Denaturation
95 °C
Annealing
60-65 °C
Elongation
72 °C
in case of
1x
100-200 nM
100-200 Nm
0,01 U/µl
0.002-2 ng/µl
in case of additional
2 min
12 min
x1
x1
15 s
20 s
20 s
x40
IMPORTANT: To activate the polymerase, follow the incubation step at
95ºC for 12 minutes at the beginning of the qPCR cycle.
Use 20 sec for annealing and elongation for templates shorter than 150
bp.
Please add UNG according to manufacturer’s specification.
Safety warnings and precautions:
This product and its components should be handled
only by persons trained in laboratory techniques. It
is advisable to wear suitable protective clothing, such
as laboratory overalls, gloves and safety glasses.
Care should be taken to avoid contact with skin or
eyes. In case of contact with skin or eyes, wash
immediately with water.
EvaGreen® is a registered trademark of BIOTIUM,
INC.
The purchase of this product conveys to the
buyer the non-transferable right to use the
purchased amount of the product and components
of the product in research conducted by the
buyer, where such research does not include
testing, analysis or screening services for any third
party in return for compensation on a per test basis.
The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this
product, (b) its components or (c) materials made
using this product or its components to a third party
or otherwise use this product or its components or
materials made using this product or its
components for Commercial Purposes.
SYBR® is a registered trademark of Molecular Probes,
Inc. LightCycler® is a registered trademark of Roche
Molecular Systems, Inc. Some applications this
product is used in may require a license which is
not provided by the purchase of this product. Users
should obtain the license if required.
7