AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary)
Transkrypt
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary)
AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokosto wa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, 39 11, email info @no vazym.co m fax +48 0 61 610 AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) Gotowy premix zawierający polimerazę hot-start i barwnik fluorescencyjny EvaGreen® do prowadzenia analiz ilościowych metodą Real-time qPCR (dedykowany do aparatów kapilarnych) Numer katalogowy produktu EVQ-0500C (500 reakcji) EVQ-1000C (1000 reakcji) Wydanie 1 (Grudzień 2012) Novazym Polska s.c., ul. Żywokosto wa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP 9721099648, email [email protected], www.novazym.com AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) 1. Przeznaczenie Premix przeznaczony jest do prowadzenia ilościowych reakcji PCR z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR). W Real-time PCR wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne lub sondy molekularne w celu monitorowania przyrostu ilości produktu amplifikacji, w każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym. Dzięki temu cała procedura analizy jest bardzo szybka i pozwala wyeliminować etap rozdziału i oceny produktu po zakończeniu reakcji. Umożliwia ona także wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie ilości DNA w matrycy podanej do reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej reakcji PCR. Ponadto ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest minimalizowane dzięki temu, że reakcja i detekcja produktu odbywa się w jednym zamkniętym naczyniu. AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) jest gotową do użycia mieszaniną do prowadzenia analiz qPCR. Premix zawiera wszystkie niezbędne komponenty reakcji, czyli: polimerazę hot-start, mieszaninę ultra czystych dNTPs [10 pmol/µl], MgCl 2 oraz wiążący się do dsDNA barwnik EvaGreen®. Aby przygotować reakcję, należy do premixu dodać wodę, startery oraz matrycę DNA. Polimeraza hot-start jest aktywowana przez 15-minutową inkubację w 95 °C. Ta właściwość uniemożliwia wydłużanie starterów, które hybrydyzują do matrycy w miejscach niespecyficznych oraz zapobiega powstawaniu dimerów starterów w niskiej temperaturze podczas reakcji qPCR. EvaGreen® jest barwnikiem fluorescencyjnym nowej generacji, który wiąże się ilościowo do dwuniciowego DNA. W przypadku braku dsDNA fluorescencja pozostaje na bardzo niskim poziomie (1-4 % false positive). Zakres widma barwnika EvaGreen® jest podobny do barwnika SYBR® Green, jednak może stanowić lepszą alternatywę do analiz qPCR ze względu na kilka cech tj. wysoka stabilność, nie inhibuje reakcji PCR oraz udowodniono, że nie jest mutagenny ani cytotoksyczny. EvaGreen® jest kompatybilny z większością dostępnych platform do analiz Real-time PCR, po ustawieniu tych samych parametrów, jak dla SYBR ® Green lub FAM. EvaGreen® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy BIOTUM, INC. AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) może być z powodzeniem wykorzystywany w następujących aplikacjach: analiza jakościowa i ilościowa materiału genetycznego DNA i cDNA profilowanie ekspresji genów detekcja mikrobiologiczna określanie obciążeń wirusowych. 2 AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) 2. Zasada działania testu W reakcji Real-time PCR analizowany jest przyrost ilości produktu w czasie rzeczywistym. Przyrost ilości kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowany w każdym cyklu reakcji amplifikacji. W technice Real-time PCR wyznacznikiem początkowej ilości matrycy DNA w reakcji jest ilość cykli (C T), po których kinetyka reakcji wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu. Ilość produktu w reakcji PCR wzrasta wykładniczo z każdym cyklem, aż do momentu, wyczerpania się któregoś z komponentów reakcji. Zawartość zestawu Lp. [1] KOLOR Niebieski [2] [3] Żółty Biały ELEMENT AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) MgCl2 [25 mM] H2 O MQ do reakcji PCR 500 reakcji 1 1000 reakcji 4 1 1 1 1 Skład mieszaniny AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) Polimeraza DNA hot-start Bufor reakcyjny 5x EvaGreen® qPCR buffer MgCl 2 12.5 mM Mix dNTPs 10 pmol/µl Barwnik EvaGreen® BSA. Przechowywanie -20 °C Chronić przed światłem Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. 3. Przeprowadzenie testu PCR Zalecany program reakcji Real-time qPCR Etap reakcji Denaturacja wstępna Amplifikacja Krzywa topnienia Chłodzenie Metoda analizy - Ilość cykli 1 Quantification 40 Melting 1 (2) - 1 denaturacja (1) hybrydyzacja elongacja denaturacja hybrydyzacja elongacja Temperatura Czas 95 °C 15 min Pomiar fluorescencji - 95 °C 60 - 65 °C 15 s 20 s - 72 °C 90 °C 75 °C 95 °C slope = 0,1 °C/s 40 °C 20 s 15 s 15 s 0s single continuous 30 s 3 AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej SKŁADNIK OBJĘTOŚĆ STĘŻENIE KOŃCOWE [1] AmpliQ 5x HOT EvaGreen® (1) qPCR Mix Plus [5x] 4 µl [1x] [2] Starter forward [10 pmol/µl] 0,16 – 0,5 µl [80 – 250 nM] [3] Starter reverse [10 pmol/µl] 0,16 – 0,5 µl [80 – 250 nM] 1 - 5 µl [0,01 – 10 ng/µl] [2.5 – 5 mM] Lp. [4] Matryca DNA [5] Opcjonalnie MgCl2 MgCl 2 [25 mM] należy dostosować [6] H2O MiliQ do 20 µl RAZEM (1) 20 µl Premi x AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus [5x] zawiera w swoim składzie MgCl 2 w stężeniu 12.5 mM. Stężenie końcowe MgCl 2 w reakcji 1x PCR wynosi 2.5 mM. Stężenie MgCl 2 zaleca się modyfikowa ć w zakresie 2.5 – 5 mM. 4. Interpretacja najczęściej spotykanych problemów w reakcji PCR W przypadku braku produktu lub pojawienia się niespecyficznych produktów reakcji PCR zalecamy przeprowadzenie optymalizacji metody poprzez zastosowanie: gradientu temperatury hybrydyzacji starterów w zakresie +/- 5 °C od średniej Tm starterów gradientu stężenia MgCl 2 w zakresie od 1.5 - 5 mM kontroli pozytywnej reakcji, pozwalającej ocenić poprawność przebiegu amplifikacji docelowego produktu kontroli negatywnej reakcji, pozwalającej ocenić czystość odczynników używanych do reakcji PCR (zamiast matrycy DNA do reakcji należy podać tę samą objętość wody). Lot nr Exp. date Ograniczenia w zastosowaniu: Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych z produkcją leków. UWAGA! Pewne składniki buforu reakcyjnego oraz buforu służącego do przechowywania mogą działać silnie drażniąco. Radzimy podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP. 4 AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) SHORT ENGLISH PROTOCOL Description: AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) is an optimized ready-to-use solution for real-time quantitative PCR assays, incorporating EvaGreen® dye. It comprises all the components necessary to perform qPCR: hot-start DNA Polymerase, 10 pmol/µl ultrapure dNTPs, MgCl 2 and EvaGreen® dye. The user simply needs to add water, template and primers. Shipping and Storage conditions: Routine storage: -20 °C Shipping and temporary storage for up to 1 month at room temperature has no detrimental effects on the quality of AmpliQ 5x HOT EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary). Hot-start DNA Polymerase is activated by a 15 min incubation step at 95 °C. This prevents extension of non-specifically annealed primers and primerdimers formed at low temperatures during qPCR setup. Recommended qPCR reaction mix: AmpliQ 5x HOT 4 µl ® EvaGreen qPCR Mix Plus Primer For [10 µM] 0.16-0.5 µl Primer Rev [10 µM] 0.16-0.5 µl DNA template 1-5 µl H2O PCR grade up to 20 µl Applications: Detection and quantification of DNA and cDNA targets Profiling gene expression Microbial detection Viral load determination Recommended qPCR cycles: Initial 95 °C denaturation Denaturation 95 °C Annealing 60-65 °C Elongation 72 °C Mix Composition: Hot-start DNA Polymerase 5x EvaGreen® qPCR buffer MgCl 2 12.5 mM (1x PCR solution - 2.5 mM MgCl 2) dNTPs mix 10 pmol/µl EvaGreen® dye BSA Safety warnings and precautions: EvaGreen® Dye: EvaGreen® is a DNA-binding dye with many features that make it a superior alternative to SYBR® Green I for qPCR. Apart from having similar spectra, EvaGreen® has three important features that set it apart from SYBR® Green I: EvaGreen® has much less PCR inhibition, is extremely stable dye and has been shown to be nonmutagenic and noncytotoxic. EvaGreen® is compatible with all common realtime PCR cyclers - simply select the standard settings for SYBR ® Green or FAM! 1x 80-250 nM 80-250 nM 0.01-10 ng/µl 15 min x1 15 s 20 s 20 s x40 This product and its components shoul d be handled onl y by persons trained in labora tory techniques . It is advisable to wear suitable protecti ve clothing, such as labora tory overalls, gloves and safety glasses. Ca re should be taken to a void contact wi th skin or eyes. In case of conta ct wi th skin or eyes, wash immediately wi th wa ter. EvaGreen ® is a registered tradema rk of BIOTIUM, INC. The purchase of this product conveys to the buyer the nontransferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer, w here such research does not include testing, analysis or screening servi ces for any third pa rty in return for compensation on a per tes t basis. The buyer cannot sell or otherwise transfer (a ) this product, (b) i ts components or (c) ma terials made using this product or i ts components to a thi rd pa rty or otherwise use this product or its com ponents or materials made using this product or i ts components for Commercial Purposes. SYBR ® is a registered tradema rk of Molecula r Probes, Inc. ® LightCycler is a registered tradema rk of Roche Molecular Sys tems , Inc. Some applications this product is used in may requi re a li cense which is not provided by the purchase of this product. Users should obtain the li cense if required .