streszczenie -

STRESZCZENIE
Analiza bioprocesu wytwarzania diosgeniny – surowca do produkcji leków.
Diosgenina jest sapogeniną steroidową o dużym potencjale farmakologicznym obejmującym
działanie przeciwcukrzycowe, obniżające poziom cholesterolu we krwi oraz silne działania
antynowotworowe wobec szerokiego spektrum rodzaju komórek rakowych. Jest także jednym
z najważniejszych surowców stosowanych w przemyśle farmaceutycznym do produkcji
związków steroidowych, takich jak hormony płciowe czy kortykosteroidy.
Szlak biosyntezy saponin steroidowych nie został dotychczas w pełni wyjaśniony.
Z dostępnych informacji wynika, że szlak biosyntezy fitosteroli stanowi podstawę do syntezy
szkieletu węglowego oraz domniemywa się o udziale cholesterolu jako jednego z produktów
pośrednich. Dlatego też za cel badań postawiono sobie analizę szlaku biosyntezy diosgeniny
i identyfikację genów kodujących enzymy zaangażowane w ten proces.
Pracę rozpoczęto od wyprowadzenia kultur in vitro kozieradki pospolitej, aby utrzymać
stabilne warunki wzrostu genotypów i zminimalizować wpływ czynników zewnętrznych.
Zoptymalizowano także metodę ekstrakcji i ilościowego oznaczenia diosgeniny. Następnie
rośliny traktowano elicytorami (kwas salicylowy, jasmonian metylu) oraz prekursorami
szlaku steroli (skwalen, cholesterol), aby zaindukować biosyntezę docelowego analitu.
W uzyskanym materiale roślinnym dokonano analizy ilościowej poziomu diosgeniny oraz
wyselekcjonowano rośliny o najwyższej (od 185 do 481 µg/g świeżej masy) i najniższej (od
31 do 49 µg/g świeżej masy) zawartości tego metabolitu. Materiał ten posłużył do
przeprowadzenia analiz proteomicznych
i transkryptomicznych.
Wykonano
analizę
porównawczą profili białkowych, otrzymanych z roślin traktowanych i kontrolnych,
uzyskanych na wysokorozdzielczych mapach białkowych. Jednak zdecydowana większość
zidentyfikowanych białek była związana pośrednio lub bezpośrednio z reakcją na stres.
Następnie dokonano analizy ekspresji genów metodą mikromacierzy oligonukleotydowych
oraz przeprowadzono identyfikację transkryptów różnicujących dwie pule o skrajnych
poziomach diosgeniny dzięki zastosowaniu techniki reprezentatywnej analizy różnicowej
cDNA (cDNA-RDA). Zsekwencjonowano także zaindukowane transkryptomy otrzymane po
traktowaniu oraz dokonano ich analizy bioinformatycznej. Ponadto, poziom ekspresji
wybranych transkryptów względem genów referencyjnych został zweryfikowany za pomocą
ilościowej reakcji PCR.
Analizy transkryptomu pozwoliły na zidentyfikowanie kluczowych genów kodujących
enzymy ze szlaku biosyntezy fitosteroli (do etapu syntezy β-sitosterolu) oraz wskazanie
potencjalnych transkryptów mogących uczestniczyć w biosyntezie diosgeniny. Ponadto,
ekspresja metylotransferaz była zahamowana zarówno w eksperymencie mikromacierzowym,
jak i w indukowanych transkryptomach. W każdym z przeprowadzonych doświadczeń
proteomicznych i transkryptomicznych zidentyfikowano cytochrom z grupy CYP72A, który
uczestniczy w reakcjach utleniania triterpenów, a potwierdzenie jego roli w biosyntezie
diosgeniny wymaga dodatkowych analiz funkcjonalnych. Walidacja poziomu ekspresji
wybranych
transkryptów
potwierdziła
ich
nadekspresję
w
próbach
traktowanych
w porównaniu do kontroli.
Otrzymane wyniki skłoniły do zaproponowania szlaku biosyntezy diosgeniny poprzez ścieżkę
syntezy cholesterolu z cykloartenolu z wykorzystaniem enzymów ze szlaku fitosteroli, jednak
z pominięciem aktywności metylotransferaz. Etapy od cholesterolu do diosgeniny obejmują
siedem reakcji, dla których zaproponowano odpowiednie enzymy. Wnioskuje się o udziale
22α-hydroksylazy steroidu CYP90B1 i niespecyficznej monooksygenazy (o numerze
EC:1.14.1.4.1) podczas hydroksylacji odpowiednio węgla C22 i C16. Natomiast
hydroksylacja węgla C26 może być katalizowana przez cytochrom CYP18A1 lub CYP734A1
o
aktywności 26-hydroksylazy.
Kolejne reakcje prowadzą do
utworzenia
formy
furostanolowej, a ostatnie dwa etapy polegają na zamknięciu pierścienia F i utworzeniu
spiroketalu. Najpierw glikozylacji ulega węgiel C26, a reakcja jest katalizowana przez UDPglukozylotransferazę (EC:2.4.1.-), a następnie cząsteczka glukozy jest usuwana przez βglukozydazę (EC:3.2.1.21) tworząc pierścień spiro w cząsteczce diosgeniny.
ABSTRACT
The analysis of diosgenin synthesis bioprocess as the material for drugs production.
Diosgenin is steroidal sapogenin with great pharmacological potential through its antidiabetic
activity, decreasing cholesterol levels in blood and strong anticancer activity against a broad
spectrum type of cancer cultures. It is also one of the most important substrate used in the
pharmaceutical industry for the synthesis of steroid compounds, such as sex hormones or
corticosteroids.
The biosynthesis pathway of steroidal saponins has not been elucidated yet. The available
information suggests that the biosynthetic pathway of phytosterols is the basis for the
synthesis of carbon skeleton and participation of cholesterol as the intermediate is proposed.
Therefore, the aim of the study was the analysis of diosgenin biosynthesis pathway and
identification of genes encoding enzymes involved in this process.
At the first stage, fenugreek plants were cultivated in vitro to maintain stable growth
conditions for genotypes and minimize the impact of external factors. The methods for
diosgenin extraction and quantitative determination were optimized. Next, the plants were
treated with elicitors (salicylic acid, methyl jasmonate) and sterol pathway precursors
(squalene, cholesterol) to induce the biosynthesis of the targeted analyte. The obtained plant
material was used for quantitative analysis of diosgenin level and plants with the highest
(from 185 to 481 µg/g fresh weight) and the lowest (from 31 to 49 µg/g fresh weight) content
of this metabolite were selected. These plants were used to carry out the proteomic and
transcriptomic analyzes. A comparative analysis of protein profiles obtained from treated and
control plants on high resolution protein maps was carried out. However, the vast majority of
identified proteins were associated directly or indirectly in response to stress. Subsequently,
the gene expression was analyzed using oligonucleotide microarrays. Next, the transcripts
different between the two pools with extreme levels of diosgenin were identified through the
use of representative difference analysis of cDNA (cDNA-RDA) method. Induced
transcriptomes were sequenced and annotated using bioinformatic tools. Finally, the level of
expression of selected transcripts relative to reference genes were verified by quantitative
PCR.
Transcriptome analysis allowed us to identify the key genes encoding enzymes of
phytosterols biosynthesis (to stage of β-sitosterol biosynthesis) and an indication of the
potential transcripts that may participate in the biosynthesis of diosgenin. Furthermore,
expression of methyltransferases was inhibited in both microarray experiment and in induced
transcriptomes. In both the proteomic and transcriptomic experiments we identified
cytochrome from the group CYP72A, which participated in the reaction of oxidation of
triterpenes and their role in the biosynthesis of diosgenin requires functional analyzes. For the
selected transcripts overexpression in treated samples compared to the control was confirmed.
Finally, diosgenin biosynthesis pathway leading through the path of cholesterol synthesis
from cycloartenol using enzymes from the phytosterols pathway, without methyltransferase
activity is proposed. Steps from cholesterol to diosgenin include seven reactions and the
candidate enzymes able to catalyze these reactions are proposed and partially sequenced. It is
proposed to the participation of steroid C-22 hydroxylase CYP90B1 and unspecific
monooxygenase (EC:1.14.14.1) during the hydroxylation of carbon C22 and C16,
respectively. While the carbon C26 hydroxylation can be catalyzed by cytochrome CYP18A1
or CYP734A1 with 26-hydroxylase activity. Subsequent reactions lead to formation of
furostanol form and the last two stages are based on the closure of the F ring and created
spiroketal. First, the C26 is glycosylated and the reaction is catalyzed by UDPglucosyltransferase (EC: 2.4.1.-), and then glucose molecule is removed by β-glucosidase
(EC: 3.2.1.21) to form a spiro ring in diosgenin structure.