recenzja_2

Kraków 10.05.2016
Prof. dr hab. Maria Słomczyńska
Zakład Endokrynologii
Katedra Fizjologii Zwierząt
Instytut Zoologii
Uniwersytet Jagielloński
OCENA
rozprawy doktorskiej mgr. Piotra Kaczyńskiego „Rola receptora PGF2α w
interakcjach pomiędzy zarodkiem a endometrium podczas wczesnej ciąży u
świni”.
Przedstawiona do recenzji praca składa się z dwóch oryginalnych publikacji
eksperymentalnych
opublikowanych
w
Theriogenology
(2013)
i
w
Reproduction (2016). Powyższe publikacje stanowią cykl powiązanych
tematycznie badań, których celem było potwierdzenie hipotezy o roli
prostaglandyny F2α i jej receptora w procesie implantacji i rozwoju wczesnej
ciąży u świni. Opublikowane prace zostały załączone w formie pdf oraz full
text, poprzedzone obszernym opracowaniem (36 stron) w języku polskim. W
załączonych oświadczeniach współautorzy prac opisują zakres swojego
uczestnictwa w opracowaniu koncepcji, wykonywaniu doświadczeń i
przygotowaniu każdej z prac do druku.
Matczyne rozpoznanie ciąży u zwierząt i ludzi to niezwykle interesujący okres
decydujący o powodzeniu rozwoju embrionu i później płodu. Najnowsze
doniesienia z laboratoriów w Stanach Zjednoczonych i w Wielkiej Brytanii, w
których używano do badań 13 dniowych embrionów ludzkich wzbudziły
ogromne zainteresowanie wśród naukowców zaangażowanych w szeroko
rozumiane procesy biologii rozrodu.
Nic więc dziwnego, że okres wczesnej ciąży, matczynego rozpoznania ciąży
oraz implantacji został wybrany przez Doktoranta do przeprowadzenia badań
w ramach pracy doktorskiej. Co więcej, ten okres ciąży świni jest modelowy
dla
wielokierunkowych
badań
prowadzonych
w
Zakładzie
Działania
Hormonów Instytutu Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii
Nauk w Olsztynie. W okresie matczynego rozpoznania ciąży oraz implantacji
obserwowana jest wysoka zamieralność zarodków, sięgająca nawet 40%.
Jednym z ważnych czynników regulujących prawidłowy proces rozrodczy
(oprócz hormonów, cytokin, czynników wzrostu czy też miRNA) są
prostaglandyny. Prostaglandyna F2α uważana jest za czynnik inicjujący
procesy regresji ciałka żółtego, a równocześnie w okresie implantacji jej
zawartość w świetle macicy świni jest wyższa niż w odpowiadającym okresie
cyklu rujowego, co uważa się za mechanizm ochronny przed luteolizą ciałka
żółtego. Jednakże podwyższona synteza PGF2α przez endometrium w okresie
rozpoczęcia implantacji zwróciły uwagę badaczy na inną potencjalną rolę tej
prostaglandyny działającej przez specyficzne receptory we wczesnej ciąży u
świni i innych zwierząt. Celem pracy stało się zatem przedstawienie nowej roli
prostaglandyny F2α i jej receptora w interakcji endometrium macicy z
zarodkami obecnymi w macicy. Badania prowadzone in vitro i in vivo miały
potwierdzić postawiona hipotezę badawczą.
Estrogeny wydzielane głównie przez zarodki oraz prostaglandyny i
wymienione wcześniej czynniki, warunkują ustanowienie ciąży. Uważa się, że
estrogeny zarodkowe zmieniają kierunek sekrecji PGF2α w macicy z
endokrynnego (do naczyń) na egzokrynny (do światła macicy). Mechanizm
przeciwprądowego przenikania ma swój udział w zwrotnym transferze PGF2α
do światła macicy. Z drugiej strony, jak wykazano wcześniej, estradiol
stymuluje ekspresję enzymów zaangażowanych w syntezę luteotropowej
prostaglandyny E2. Opisane tu procesy skutkują zwiększeniem stosunku
luteotropowej PGE2 do luteolitycznej PGF2α. Pozostaje więc do wyjaśnienia
jaką rolę pełni wydzielana w okresie implantacji do światła macicy PGF2α, jaki
udział w procesach związanych z rozwojem odgrywa jej receptor (PTGFR),
jakie szlaki transdukcji sygnału zostają uruchomione i które geny,
uczestniczące we właściwym przygotowaniu błony śluzowej macicy do
implantacji, wykazały zmianę ekspresji.
Badania rozpoczęto od ustalenia zmian ekspresji genu i białka PTGFR w
endometrium świni w wybranych dniach cyklu rujowego oraz w wybranych
dniach ciąży. Następny krok stanowiły doświadczenia in vitro, gdzie izolowane
endometrium w 11 dniu cyklu było materiałem do hodowli kokultur komórek
epitelialnych i stromy. Medium uzyskane po hodowli zarodków z 11. i 15. dnia
ciąży zawierało szereg czynników, które jak się okazało miały wpływ na zmianę
ekspresji PTGFR w powierzchniowym endometrium. Doktorant zauważył, że
blokowanie receptora estrogenowego hamowało wzrost ekspresji receptora
PGF2α. Tak więc pośrednio potwierdzony został udział estradiolu w stymulacji
ekspresji tego genu. W tym miejscu nasuwa się pytanie, czy badano skład
chemiczny medium otrzymanego po inkubacji zarodków aby określić jakie
związki oprócz estradiolu mogą się w nim znajdować?
Badania prowadzone in vivo na modelu, w którym wykorzystuje się
jednostronną ciążę, pozwoliły na wykazanie, że sygnały zarodkowe mogą być
transportowane lokalnie lub systemowo przez krew i/lub limfę. Zastosowanie
takiego właśnie modelu pozwala na wykazanie, które sygnały obserwowane w
endometrium macicy pochodzą miejscowo od zarodka, a które mogą być
transportowane do rogu „izolowanego”, w którym zarodki się nie rozwijały.
Ten model, jak można zauważyć z licznych publikacji, jest stosowany z dużym
powodzeniem w Zakładzie Mechanizmów Działania Hormonów PAN.
W kolejnym doświadczeniu wykorzystano model, w którym do obydwu rogów
macicy dokonywano infuzji hormonalnych mających naśladować sygnał
zarodkowy. Wykazano, że estradiol podawany tylko do jednego rogu macicy,
działając systemowo, stymulował ekspresję białka receptora PGF2α w
endometrium pochodzącym z obu rogów. Nie obserwowano natomiast
wpływu estradiolu na ekspresję genu PTGFR w badanym układzie
doświadczalnym. Czy wiadomo dlaczego zmiany obserwowane były tylko na
poziomie białka, a nie mRNA?
Doktorant wykazał, że PGF2α stymuluje kinazy MAP, a te z kolei mają swój
udział w zwiększeniu ekspresji, a następnie sekrecji czynnika VEGF.
Stwierdzone zostało również, że zmiany w proliferacji komórek endotelialnych
endometrium były regulowane przez szereg innych czynników badanych przez
doktoranta. Media kondycjonowane po inkubacji skrawków endometrium z
PGF2α zostały wykorzystane do badań z zastosowaniem linii komórkowych,
gdzie użyto specyficznych inhibitorów/antagonistów pozwalających na
sprecyzowanie roli jaką pełnią w proliferacji komórek szlaki sygnalizacyjne
uruchamiane przez PGF2α. Ten fragment badań został podsumowany na
bardzo dobrym schemacie zamieszczonym w publikacji w Reproduction.
Cele pracy zostały jasno zdefiniowane, a zastosowana metodyka pozwoliła na
realizację założeń pracy. Otrzymane wyniki przyczyniły się do wyjaśnienia
nowej, nieznanej dotąd roli prostaglandyny F2α i jej receptora podczas
wczesnej ciąży u świni.
Rolą recenzenta jest nie tylko skupianie się na walorach recenzowanej pracy,
lecz
także
wskazanie
zauważonych
niedociągnięć
lub
elementów
wymagających wyjaśnienia.
Nie mam właściwie, żadnych istotnych uwag do strony merytorycznej
recenzowanej rozprawy. Dwie prace, opublikowane w czasopismach z Listy
Filadelfijskiej ułatwiają zadanie recenzentowi. Otrzymane wyniki, ich wartość
naukową potwierdzili również recenzenci akceptujący przyjecie prac do druku.
Po przeczytaniu prac nie mam żadnych wątpliwości, że doktorant uzyskał
nowe interesujące wyniki, które przynoszą ciekawe informacje dotyczące
wpływu zarodka na ekspresję receptora PGF2α w endometrium świni, a także
udziału PGF2α w ustanowieniu ciąży poprzez wpływ na ekspresję genów
zaangażowanych w angiogenezę, remodeling tkanek i interakcję zarodekmatka.
Jednakże…
Rozprawa doktorska, która składa się z kilu opublikowanych prac powinna być
opatrzona stosunkowo krótkim wstępem oraz dyskusją komentująca
otrzymane wyniki. Wszystkie pozostałe informacje są zawarte w załączonych
publikacjach i stanowią podstawę do oceny wartości naukowej rozprawy
doktorskiej.
Czytając rozdział Wyniki odsyłani jesteśmy ciągle do obu publikacji, w tym do
Supplementary Materials, których z kolei opisy znajdują się jeszcze w innym,
wcześniejszym fragmencie maszynopisu. To rozproszenie nie ułatwia z
pewnością skoncentrowania się na czytaniu tekstu.
Zastrzeżenie moje budzi używanie określenia „receptor PTGFR”, ponieważ
stanowi to pewne powtórzenie. Prawidłową nomenklaturę stosowano
natomiast w publikacjach, gdzie mowa była o receptorze PGF2α lub PTGFR.
Przy tak skonstruowanej rozprawie doktorskie zabiegiem ułatwiającym ocenę
pracy jest dobra korelacja między zaprezentowaniem zamierzeń do realizacji
(rozdział Materiał i Metody) i otrzymanych wyników (rozdział Wyniki).
Konsekwentna numeracja opisów doświadczeń i zastosowanych procedur
znajduje odzwierciedlenie w organizacji rozdziału Wyniki, gdzie podobna
numeracja dotyczy otrzymanych wyników.
Wnioski ze zrealizowanych badań zamieszczone w Streszczeniu (str.5) nie są
tożsame z tymi wnioskami, prezentowanymi w końcowej części opracowania
(str.40).
Za najważniejsze osiągnięcia pracy uznaję wykazanie, że:
- zarodki i sygnały przez nie produkowane (estradiol) regulują ekspresje
receptora PGF2α, pokazując że prostaglandyna F2α jest mediatorem sygnałów
zarodkowych
- procesy zachodzące podczas implantacji zarodka i rozwoju łożyska są
kontrolowane przez czynnik VEGF, który z kolei na drodze auto- lub
parakrynnej jest regulowany przez PGF2α
- PGF2α stymuluje ekspresję genów, których udział jest rozważany w
procesach przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej, procesu istotnego dla
prawidłowej interakcji pomiędzy endometrium a rozwijającymi się zarodkami.