cobas® TaqScreen DPX Test
Transkrypt
cobas® TaqScreen DPX Test
cobas® TaqScreen DPX Test for use on the cobas s 201 system DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. cobas® TaqScreen DPX Test ® cobas TaqScreen DPX Control Kit ® cobas TaqScreen Wash Reagent DPX 96 Tests P/N: 05509203 190 DPX CTL 12 Sets P/N: 05509181 190 5.1 L P/N: 04404220 190 TS WR ZASTOSOWANIE Test cobas® TaqScreen DPX do stosowania z systemem cobas s 201 jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego służącym do bezpośredniego ilościowego oznaczania DNA genotypów 1, 2 i 3 parwowirusa B19 i bezpośredniego wykrywania jakościowego RNA genotypów I, II i III wirusa zapalenia wątroby typu A (HAV) w ludzkim osoczu. Test cobas® TaqScreen DPX jest przeznaczony do użycia jako test wewnątrzprocesowy w celu oznaczania ilościowego wyłącznie DNA parwowirusa B19 lub jednoczesnego oznaczania ilościowego DNA parwowirusa B19 i wykrywania RNA wirusa zapalenia wątroby typu A w osoczu ludzkim przeznaczonym do dalszej obróbki. Można używać osocze z krwi pełnej (odzyskane) lub zebrane przez aferezę (osocze wyjściowe). Można testować próbki od wszystkich dawców lub pul produkcyjnych w formie pojedynczych próbek lub pul złożonych z równych objętości poszczególnych próbek. Ten test nie jest przeznaczony do stosowania z próbkami krwi pępowinowej. Ten test nie jest przeznaczony do stosowania jako narzędzie diagnostyczne. PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU ® W teście cobas TaqScreen DPX zastosowano kilka barwników, co umożliwia jednoczesne wykrywanie docelowych kwasów nukleinowych bez konieczności stosowania testów identyfikacyjnych. Na podstawie zainstalowanego pliku definicji testu (Test Definition File, TDF) test cobas® TaqScreen DPX przedstawia wyniki analizy ilościowej B19 i jakościowej HAV lub wyłącznie wynik analizy ilościowej B19. Ludzki parwowirus B19 (B19) należący do rodzaju Erythrovirus z rodziny Parvoviridae1 jest małym wirusem pozbawionym otoczki, zawierającym pojedynczą nić DNA. Wśród ludzkich erytrowirusów wyróżnia się trzy genotypy: genotyp 1 (szczepy B19), genotyp 2 (szczepy A6) i genotyp 3 (szczepy V9/D91.1)1. Wirus B19 występuje na całym świecie. Badania serologiczne wykazały, że u co najmniej 50% osób dorosłych występują we krwi przeciwciała IgG przeciwko wirusowi B19 wskazujące na 2, 3 przebyte zakażenie . Zakażenie wirusowe wiąże się z objawami klinicznymi, których manifestacja i nasilenie zależą od stanu immunologicznego i hematologicznego pacjenta4. W przypadku osób immunokompetentnych zakażenie przebiega bezobjawowo lub objawy są łagodne, obejmujące rumień zakaźny (choroba piąta) u dzieci i artropatię u dorosłych. Wirus B19 może jednak powodować również poważne schorzenia, takie jak przejściowa niedokrwistość aplastyczna u osób z zaburzeniami hematologicznymi i obrzęk uogólniony płodu, niedokrwistość wrodzoną oraz obumarcie płodu u ciężarnych4. Występowanie wirusa B19 w krwi i osoczu dawców może wahać się od 0,003% do 0,6% w zależności od tego, czy pobrano krew w sezonie epidemicznym czy poza nim5, 6. Wirus B19 przenosi się zwykle drogą kropelkową, możliwe jest jednak przeniesienie go przez produkty osoczopochodne, co jest związane z wielkością pul osocza, częstością występowania ostrych, niewidocznych klinicznie zakażeń wirusem B19, wysokim poziomem wirusa we krwi zakażonych dawców (do 1012 IU/ml) i opornością wirusa B19 na większość standardowych procedur inaktywacji/usuwania, takich jak metoda rozpuszczalnik/detergent (S/D) lub pasteryzacja7. Istnieją doniesienia o obecności DNA wirusa B19 w pulach osocza i produktach osoczopochodnych8–10 i liczne doniesienia o przenoszeniu wirusa B19 przez podanie produktów osoczopochodnych, zwłaszcza czynników krzepnięcia7, 11–13. Część Informacje dotyczące wersji dokumentu znajduje się na końcu niniejszego dokumentu. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 1 Wirus zapalenia wątroby typu A (HAV) należący do grupy hepatowirusów z rodziny Picornaviridae14 jest małym, pozbawionym otoczki wirusem RNA. HAV występuje na całym świecie, jest przenoszony drogą fekalno-oralną, głównie w przypadku bliskiego, osobistego kontaktu. Epidemie występują często w krajach rozwijających się, gdzie zakażenia występują głównie u osób we wczesnym okresie życia, co 15 skutkuje wysokim odsetkiem osób z przeciwciałami przeciwko HAV w populacji . Z kolei w krajach uprzemysłowionych spadek zapadalności spowodował, że zakażenia występują głównie u osób 16 dorosłych . Zakażenia HAV u ludzi mogą mieć różny przebieg, od bezobjawowych, głównie u małych dzieci, do zapalenia wątroby o gwałtownym przebiegu, i w niektórych przypadkach prowadzą do zgonu. W północnej Europie oraz w Japonii, Kanadzie i USA częstość występowania w ogólnej populacji jest niewielka (ok. 0,01%), a zachorowania występują głównie w grupach podwyższonego ryzyka, na 17 przykład u osób podróżujących do regionów endemicznego występowania wirusa . Wyróżniono kilka genotypów HAV (I–VI), przy czym u ludzi występują genotypy I, II i III18,19. Zakaźny HAV może być 20 wykryty we krwi w okresie okienka serologicznego , jednak ryzyko przeniesienia HAV jest niewielkie podczas transfuzji. Podobnie jak w przypadku wirusa B19, trudno jest inaktywować HAV metodą S/D lub przez pasteryzację. Istnieją też doniesienia o przeniesieniu HAV w produktach osoczopochodnych, głównie w czynnikach krzepnięcia21–23. Skażenie pul osocza wirusami B19 i HAV można wykryć testami wykorzystującymi kwasy nukleinowe. W związku z tym na początku XXI wieku niektórzy producenci osocza zainicjowali badania z wykorzystaniem kwasów nukleinowych (Nucleic Acid Testing, NAT) do wykrywania DNA wirusa B19 i RNA HAV w osoczu przeznaczonym do dalszej obróbki. Miały one na celu ograniczenie zawartości wirusa B19 w pulach osocza i wyeliminowanie próbek osocza zakażonych HAV. Takie badania są nazywane badaniami wewnątrzprocesowymi. Ze względu na doniesienia o obecności przeciwciał IgG przeciwko wirusowi B19 w pulach osocza i przenoszeniu wirusa B19 przez produkty zawierające > 104 IU/ml DNA B197 zaproponowano przyjęcie ograniczenia zawartości DNA B19 w puli osocza do 4 dalszej obróbki do < 10 IU/ml jako wymóg prawny amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) i Unii Europejskiej wobec osocza przeznaczonego do produkcji przeciwciał przeciwko antygenowi D i osocza poddanego obróbce mającej na celu inaktywację wirusów24, 25, 26. Nie określono obecnie wymogów prawnych dotyczących testów na obecność HAV w pulach osocza. Jednak zgodnie z wymogami prawnymi obowiązującymi na obszarze Unii Europejskiej testy NAT HAV pul osocza wykonywane w ramach badań wewnątrzprocesowych powinny umożliwiać wykrywanie kontroli 26 zawierających 100 IU/ml RNA HAV . Test cobas® TaqScreen DPX jest testem podwójnym, umożliwiającym jednoczesne wykrywanie parwowirusa B19 i wirusa HAV w próbkach ludzkiego osocza od pojedynczych dawców lub w pulach osocza. Stosowanie technologii wielu barwników umożliwia identyfikację każdego z docelowych wirusów bez konieczności stosowania dalszych testów identyfikacyjnych. Ponadto test umożliwia oznaczenie ilościowe (w IU/ml) wirusa B19 z zastosowaniem standardu Quantitation Standard (QS), opartego bezpośrednio na międzynarodowym standardzie WHO dla wirusa B1927. Standard QS wraz z kontrolą wewnętrzną (internal control, IC) (dla docelowego HAV) ulega ekstrakcji i amplifikacji jednocześnie ® z każdą próbką. Test cobas TaqScreen DPX wykorzystuje ogólną technikę przygotowywania kwasów nukleinowych w urządzeniu COBAS® AmpliPrep. DNA wirusa B19 i RNA wirusa HAV wraz z QS i IC są amplifikowane i wykrywane w pojedynczej próbówce przy użyciu zautomatyzowanej techniki PCR w ® ® czasie rzeczywistym w analizatorze COBAS TaqMan . Identyfikacja docelowych wirusów, QS i IC jest możliwa dzięki zastosowaniu sond wyznakowanych fluorescencyjnie i wykrywanych w osobnych ® ® kanałach analizatora COBAS TaqMan . W teście stosowany jest enzym AmpErase (uracylo-Nglikozylaza) umożliwiający redukcję potencjalnego zanieczyszczenia produktami amplifikacji przeprowadzonej uprzednio (amplikonem). ZASADY PROCEDURY Test cobas® TaqScreen DPX do stosowania z systemem cobas s 201 jest oparty na 4 głównych procesach: 1. Zautomatyzowane pulowanie próbek i pipetowanie kontroli przy użyciu urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB® STAR/STARlet IVD (opcjonalnie) 2. Zautomatyzowane przygotowywanie próbek przy użyciu urządzenia COBAS® AmpliPrep 3. Zautomatyzowana amplifikacja kwasu nukleinowego oraz zautomatyzowana detekcja w czasie rzeczywistym produktów reakcji PCR przy użyciu analizatora COBAS® TaqMan® 4. Zautomatyzowane zarządzanie danymi przy użyciu oprogramowania do pulowania i zarządzania danymi (PDM) 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 2 Zautomatyzowane pulowanie próbek i pipetowanie przy użyciu urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Urządzenie pipetujące Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD pozwala na automatyzację pipetowania próbek od pojedynczych dawców, pulowanie próbek uzyskanych od wielu dawców oraz pipetowanie odczynników kontrolnych testu. System cobas s 201 umożliwia rozstrzygnięcie reaktywnych pul osocza do uzyskania wyników dla poszczególnych próbek. System cobas s 201 służy do przetwarzania próbek w partiach. Partię definiuje się jako zbiór próbek i kontroli, które są pipetowane, ekstrahowane, amplifikowane i wykrywane łącznie. Po zakończeniu pipetowania partii w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD cały statyw na próbki jest przenoszony do urządzenia COBAS® AmpliPrep w celu przeprowadzenia następnego etapu. ® Zautomatyzowane przygotowywanie próbek przy użyciu urządzenia COBAS AmpliPrep Cząsteczki kwasów nukleinowych z próbek i dodanej kontroli wewnętrznej (internal control, IC) Armored HAV RNA oraz cząsteczki standardu QS DNA parwowirusa B19 w osłonce faga lambda (które służą jako kontrola procesów przygotowywania próbek i amplifikacji / detekcji / oznaczenia ilościowego) są przetwarzane jednocześnie. Test cobas® TaqScreen DPX zawiera odczynniki do pięciu kolejnych ® etapów przeprowadzanych w urządzeniu COBAS AmpliPrep. Roztwór proteinazy trawi białka, co ułatwia lizę, pozwala na inaktywację nukleaz i ułatwia uwalnianie RNA i DNA z cząsteczek wirusa. Dodanie odczynnika lizującego do próbki powoduje przez denaturację białek lizę wirusa i inaktywację nukleaz. RNA i DNA są uwalniane i jednocześnie chronione przed nukleazami. Uwolnione kwasy nukleinowe łączą się z silikonową powierzchnią dodanych szklanych cząstek magnetycznych. Jest to spowodowane głównie sumarycznym dodatnim ładunkiem na powierzchni szklanej cząstki i sumarycznym ujemnym ładunkiem kwasów nukleinowych wynikającym ze stężenia soli chaotropowej i siły jonowej odczynnika lizującego. Odczynnik płuczący pozwala na usunięcie niezwiązanych substancji i zanieczyszczeń, takich jak zdenaturowane białka, fragmenty komórek i potencjalne inhibitory reakcji PCR (takie jak hemoglobina itp.), oraz zmniejszenie stężenia soli. Oczyszczone kwasy nukleinowe są odłączane do szklanych cząstek magnetycznych w podwyższonej temperaturze za pomocą buforu do elucji. Zautomatyzowana amplifikacja i detekcja kwasu nukleinowego przy użyciu analizatora COBAS® TaqMan® Po wyizolowaniu oczyszczonych kwasów nukleinowych z ludzkiego osocza podczas zautomatyzowanego przygotowania próbek, do amplifikacji i detekcji RNA HAV i RNA IC oraz amplifikacji i oznaczenia ilościowego DNA B19 i DNA QS używa się odczynnika cobas® TaqScreen DPX Master Mix (MMX). Po zaktywowaniu przez dodanie octanu manganu odczynnik cobas® TaqScreen DPX Master Mix umożliwia odwrotną transkrypcję (dla docelowych RNA), a następnie amplifikację PCR wysoce konserwatywnych regionów RNA HAV, RNA IC, DNA parwowirusa B19 i DNA QS przy użyciu specyficznych starterów. Amplikony są wykrywane przez hybrydyzację ze swoistymi sondami oligonukleotydowymi. Amplifikacja, hybrydyzacja i detekcja zachodzą jednocześnie. Odwrotna transkrypcja oraz amplifikacja PCR Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji przeprowadza się przy użyciu termostabilnego rekombinowanego enzymu, polimerazy DNA Z05. W obecności jonów manganowych (Mn2+) polimeraza DNA Z05 uzyskuje aktywność odwrotnej transkryptazy i polimerazy DNA. Dzięki temu możliwy jest przebieg reakcji odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Podczas amplifikacji PCR wysoka temperatura w kolejnych etapach reakcji umożliwia denaturację amplikonu docelowego i IC/QS do jednoniciowego DNA. Polimeraza DNA Z05 powoduje wydłużenie przyłączonych starterów wzdłuż docelowych matryc celem wytworzenia dwuniciowego DNA (amplikonu). Ten proces powtarza się cyklicznie, a po każdym cyklu podwajana jest ilość amplikonu. Amplifikacja zachodzi jedynie w obszarze docelowego genomu między starterami; całość genomu nie ulega amplifikacji. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 3 Zapobieganie zanieczyszczeniu produktami poprzedniej reakcji Zanieczyszczeniu produktami poprzedniej reakcji zapobiega się, stosując enzym AmpErase (uracylo-Nglikozylaza) oraz trójfosforan dezoksyurydyny (dUTP). Dezoksyurydyna nie występuje w naturalnym DNA, ale jest zawsze obecna w amplikonie z uwagi na zastosowanie w odczynniku Master Mix mieszaniny trójfosforanu dezoksyurydyny / trójfosforanu tymidyny jako jednego z dNTP; dlatego wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje rozkład nici DNA 28 zawierającego dezoksyurydynę przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1, przez co DNA nie może ulegać amplifikacji. DNA zawierający dezoksytymidynę lub RNA zawierający rybourydynę29,30 nie jest rozpoznawany przez enzym. Podczas początkowej fazy odwrotnej transkrypcji enzym AmpErase katalizuje cięcie produktów poprzedniej reakcji w miejscu reszt dezoksyurydyny. Enzym AmpErase jest inaktywowany na długo po poddaniu działaniu temperatury powyżej 55°C, dlatego nie niszczy docelowego amplikonu utworzonego w wyniku przeprowadzanej aktualnie reakcji PCR. Wykrywanie produktów reakcji PCR31,32 Odczynnik cobas® TaqScreen DPX MMX zawiera sondy wykrywające swoiste dla kwasów nukleinowych HAV, IC, parwowirusa B19 i QS. Każda sonda wykrywająca jest wyznakowana: 1) jednym z czterech barwników fluorescencyjnych, który działa jako barwnik reporterowy, i 2) drugim barwnikiem, który spełnia rolę wygaszacza. Każdej sekwencji docelowej przypisany jest określony barwnik reporterowy, a fluorescencję, której jest źródłem, mierzy się przy określonej długości fali. We wszystkich sondach używa się barwnika wygaszacza tego samego typu. W tym systemie można wykrywać wszystkie amplifikowane kwasy nukleinowe przy różnych długościach fal. Zanim rozpocznie się amplifikacja PCR, sondy są nienaruszone, a fluorescencja reportera jest wytłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii Förstera. Podczas amplifikacji PCR sondy hybrydyzują z docelowymi jednoniciowymi sekwencjami DNA i są rozszczepiane przez 5'- i 3'-nukleazową aktywność polimerazy DNA Z05 w tym samym czasie, kiedy zachodzi amplifikacja. Kiedy barwnik reporterowy i wygaszacz zostaną rozdzielone przez to rozszczepienie, ujawnia się aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego. Z każdym cyklem PCR generowana jest zwiększająca się liczba rozszczepionych sond i jednocześnie wzrasta sumaryczny sygnał barwnika reporterowego. Detekcji produktów PCR w czasie rzeczywistym towarzyszy niezależny pomiar fluorescencji poszczególnych uwolnionych barwników reporterowych, reprezentujących docelowe wirusy, IC i QS. Zautomatyzowane zarządzanie danymi przy użyciu programu PDM Oprogramowanie Roche PDM pozwala użytkownikowi przeglądać i raportować wyniki. ® Oprogramowanie Roche PDM interpretuje wyniki testu cobas TaqScreen DPX jako niereaktywne, reaktywne lub nieważne dla docelowego HAV bądź < wartości odcięcia, ≥ wartości odcięcia lub nieważne dla docelowego wirusa B19. Oprogramowanie Roche PDM pozwala użytkownikowi nie tylko odbierać i analizować wyniki PCR, ale także drukować raporty, odszukiwać wyniki, akceptować wyniki dawców i (opcjonalnie) przesyłać dane do LIS. MATERIAŁY DOSTARCZONE PRZEZ ROCHE Do wykrywania RNA HAV oraz oznaczania ilościowego DNA parwowirusa B19 w próbkach osocza są wymagane i dostarczane trzy zestawy: 1) cobas® TaqScreen DPX Test, 2) zestaw kontrolny cobas® TaqScreen DPX Control Kit i 3) cobas® TaqScreen Wash Reagent. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheet, MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. cobas® TaqScreen DPX Test (P/N: 05509203 190) DPX 96 testów DPX CS1 (kaseta zawierająca szklane cząstki magnetyczne do oznaczeń DPX) DPX CS2 (kaseta z odczynnikiem lizującym do oznaczeń DPX) DPX CS3 (kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń DPX) DPX CS4 (kaseta z odczynnikami swoistymi dla testu do oznaczeń DPX) 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 4 cobas® TaqScreen DPX Control Kit ® Zestaw kontrolny cobas TaqScreen DPX (P/N: 05509181 190) DPX CTL 12 zestawów DPX D(+)C (kontrola podwójna: dodatnia HAV i nisko dodatnia parwowirus B19) DPX H(+)C (kontrola wysoko dodatnia parwowirus B19) DPX (–) C (kontrola ujemna cobas® TaqScreen DPX) cobas® TaqScreen Wash Reagent ® Odczynnik płuczący cobas TaqScreen (P/N: 04404220 190) TS WR 5,1 l TS WR (odczynnik płuczący cobas® TaqScreen) INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ SPRZEDAWANE OSOBNO (DO NABYCIA W FIRMIE ROCHE) Ten test jest przeznaczony do użytku z systemem cobas s 201. System cobas s 201 musi być zainstalowany i używany przy pełnej konfiguracji systemu. Pojedynczych elementów systemu cobas s 201 nie można używać jako samodzielnych urządzeń, nie można też zastępować innych elementów. System cobas s 201 wykorzystuje elementy wymienione poniżej. Przyrządy i oprogramowanie dla systemu cobas s 201 • Urządzenie pipetujące Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (opcjonalnie), stacja robocza i oprogramowanie Pooling Manager • Urządzenie COBAS® AmpliPrep • Analizator COBAS® TaqMan® • Stacja danych z oprogramowaniem AMPLILINK • Serwer Roche PDM Data Manager, stacja robocza i oprogramowanie Data Manager • Plik definicji testu DPX dla testu cobas® TaqScreen DPX • Plik definicji testu do parwowirusa B19 (B19) dla testu cobas® TaqScreen DPX Statywy i materiały jednorazowe • Statywy na próbki COBAS® AmpliPrep (SK24) (P/N: 28122172001) • Statywy na jednostki SPU COBAS® AmpliPrep (P/N: 05471664001) • Statywy na odczynniki COBAS® AmpliPrep (P/N: 28122199001) • Jednostki przetwarzania próbki (SPU): (P/N: 03755525001) • Probówki wejściowe na próbki (probówki S) z klipsami z kodem kreskowym (P/N: 03137040001) • Statywy z końcówkami K (P/N: 03287343001) • Opakowanie zawierające probówki K, 12 x 96 (P/N: 03137082001) • Nośnik K COBAS® TaqMan® (P/N: 28150397001) • Końcówki CO-RE o dużej pojemności (1000 µl) z filtrem (P/N: 04639642001) • Płytki głębokodołkowe, oznaczone etykietami z kodami kreskowymi (P/N: 04639634001) • Maty zamykające płytki głębokodołkowe (P/N: 04789288001) • Nośnik na próbki na 24 probówki testowe (P/N: 04639502001) • Nośnik na próbki na 32 probówki testowe (P/N: 04639529001) 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 5 • Nośnik do końcówek (P/N: 04639545001) • Nośnik do płytek głębokodołkowych (P/N: 04639553001) • Nośnik na statywy SK24 (P/N: 04639600001) • Zestaw aerozolu dezynfekującego Hamilton (P/N: 06254250001) • Zestaw detergentu Hamilton MICROLAB (P/N: 06254268001) • Rękawice jednorazowe bezpudrowe ODCZYNNIKI cobas® TaqScreen DPX Test (P/N: 05509203 190) DPX DPX CS1 MGP (szklane cząstki magnetyczne) Szklane cząstki magnetyczne 93% izopropanolu Xi 96 testów 2 x 48 testów 2 x 7,0 ml 93% (wag.) izopropanolu Produkt drażniący F 93% (wag.) izopropanolu Produkt wysoce łatwopalny DPX CS2 LYS (odczynnik lizujący) Cytrynian sodu dwuwodny 42,5% tiocyjanianu guanidyny < 14% polidokanolu 0,9% ditiotreitolu Xn 42,5% (wag.) tiocyjanianu guanidyny 2 x 48 testów 2 x 78 ml Produkt szkodliwy DPX CS3 Pase (roztwór proteinazy) Bufor TRIS < 0,05% EDTA Chlorek wapnia Octan wapnia ≤ 7,8% proteinazy Glicerol Xn ≤ 7,8% (wag.) proteinazy 2 x 48 testów 2 x 3,8 ml Produkt szkodliwy EB (bufor do elucji) Bufor TRIS 0,2% metylparabenu — środek konserwujący 2 x 7,0 ml 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 6 DPX CS4 DPX MMX-R1 (odczynnik 1 DPX Master Mix) Octan potasu Octan manganu Glicerol 14,4% dimetylosulfotlenku 0,08% azydku sodu Kwas octowy 2 x 48 testów 2 x 3,0 ml DPX MMX-R2 (odczynnik 2 DPX Master Mix) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu 4,1% dimetylosulfotlenku Glicerol Tween 20 < 0,09% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP < 0,01% preparatu starterów sensownych i antysensownych parwowirusa B19 i HAV < 0,01% roztworu znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond parwowirusa B19 i HAV < 0,01% roztworu znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond QS parwowirusa B19 i IC HAV < 0,01% aptameru oligonukleotydowego < 0,01% polimerazy DNA Z05 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase® [uracylo-N-glikozylaza] (bakteryjnego) 0,08% azydku sodu 2 x 2,5 ml DPX IC/QS (standard ilościowy i kontrola wewnętrzna DPX) Bufor TRIS ≤ 0,002% poli-rA RNA (syntetycznego) EDTA 0,05% azydku sodu < 0,001% niezakaźnego syntetycznego RNA IC opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga MS2 < 0,001% niezakaźnego syntetycznego DNA QS B19 opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga Lambda 2 x 13 ml cobas® TaqScreen DPX Control Kit Zestaw kontrolny cobas® TaqScreen DPX (P/N: 05509181 190) DPX CTL 12 zestawów DPX D(+)C 12 x 1,6 ml (podwójna kontrola dodatnia DPX) < 0,001% niezakaźnego syntetycznego RNA HAV opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga MS2 < 0,001% niezakaźnego syntetycznego DNA parwowirusa B19 opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga Lambda Osocze ludzkie ujemne, niereaktywne w testach licencjonowanych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) w zakresie przeciwciał IgG i IgM Ab przeciwko parwowirusowi B19, HBsAg, antygenowi rdzeniowemu HBV Ab, HCV Ab i HIV-1/2 Ab oraz RNA HIV-1. Niereaktywne dla RNA HAV metodami NAT i dla DNA parwowirusa B19 ≤ 5 IU/ml metodą PCR. 0,1% substancji konserwującej ProClin® 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazol-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazol-3-onu Produkt drażniący R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 7 DPX H(+)C 12 x 1,6 ml (kontrola silnie dodatnia DPX) < 0,001% niezakaźnego syntetycznego DNA parwowirusa B19 opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga Lambda Osocze ludzkie ujemne, niereaktywne w testach licencjonowanych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) w zakresie przeciwciał IgG i IgM Ab przeciwko parwowirusowi B19, HBsAg, antygenowi rdzeniowemu HBV Ab, HCV Ab i HIV-1/2 Ab oraz RNA HIV-1. Niereaktywne dla RNA HAV metodami NAT i dla DNA parwowirusa B19 ≤ 5 IU/ml metodą PCR. 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazol-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazol-3-onu Produkt drażniący R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą DPX (–) C (kontrola ujemna cobas® TaqScreen DPX) Bufor fosforanu sodu EDTA 0,002% poli-rA RNA (syntetycznego) Barwnik amarantowy 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 Xi 12 x 1,6 ml (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu Produkt drażniący R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą cobas® TaqScreen Wash Reagent Odczynnik płuczący cobas® TaqScreen (P/N: 04404220 190) TS WR 5,1 l TS WR (odczynnik płuczący cobas® TaqScreen) Cytrynian sodu dwuwodny 0,1% metylparabenu — środek konserwujący WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Przez temperaturę pokojową rozumie się temperaturę od 15°C do 30°C. B. Nie zamrażać odczynników ani kontroli. C. Odczynniki DPX CS1, DPX CS2, DPX CS3 i DPX CS4 należy przechowywać w temperaturze od 2°C do 8°C. Nieużywane odczynniki są stabilne aż do upływu podanej daty ważności. D. Po pierwszym użyciu odczynniki zachowują stabilność przez 30 dni w temperaturze od 2°C do 8°C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. E. Odczynników można używać w nie więcej niż 6 cyklach pracy urządzenia i w sumie przez maksymalnie 48 godzin pracy urządzenia COBAS® AmpliPrep. Między kolejnymi cyklami pracy odczynniki należy przechowywać w temperaturze od 2°C do 8°C. Oprogramowanie AMPLILINK monitoruje łączną liczbę godzin pracy kaset z odczynnikami w urządzeniu COBAS® AmpliPrep i uniemożliwia wykorzystanie kaset po osiągnięciu w sumie 48 godzin. F. Oprogramowanie AMPLILINK nie monitoruje liczby cykli pracy urządzenia ze stosowanymi kasetami. Za usunięcie kaset z odczynnikami po wykonaniu 6 cykli pracy urządzenia odpowiedzialny jest użytkownik. G. Odczynniki DPX D(+)C, DPX H(+)C i DPX (–) C należy przechowywać w temperaturze od 2°C do 8°C. Kontrole są stabilne aż do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania niewykorzystane do badania odczynniki należy wyrzucić. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 8 H. Odczynnik TS WR należy przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C. Nieotwarty odczynnik TS WR pozostaje stabilny aż do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność przez 30 dni w temperaturze od 15°C do 30°C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. A. Próbki mogą być zakaźne. Podczas wykonywania badania należy przestrzegać ogólnych środków ostrożności33,34. Procedurę tę powinien wykonywać tylko personel biegły w używaniu testu cobas® TaqScreen DPX i przeszkolony w postępowaniu z materiałem zakaźnym. Należy dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem podchlorynu sodu 0,5% w wodzie dejonizowanej lub destylowanej (rozcieńczony wybielacz). Następnie należy przetrzeć powierzchnię etanolem 70%. B. UWAGA: Odczynniki DPX D(+)C i DPX H(+)C zawierają ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Testy wykazały, że zastosowane osocze jest niereaktywne w zakresie przeciwciał IgG i IgM przeciwko parwowirusowi B19, HBsAg, antygenowi rdzeniowemu HBV Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab oraz niereaktywne względem RNA HIV-1 w badaniach metodami NAT. Osocze przebadano również z zastosowaniem testu cobas® TaqScreen DPX i wykazano, że jest niereaktywne w kierunku RNA HAV i zawiera ≤ 5 IU/ml DNA parwowirusa B19. Żadna ze znanych metod badania nie może zaoferować całkowitej pewności, że produkty otrzymane z ludzkiej krwi nie będą przenosić czynników zakaźnych. Wszystkie materiały pochodzące z krwi ludzkiej należy uważać za potencjalnie zakaźne i postępować z nimi z zastosowaniem ogólnych środków ostrożności. W przypadku wylania materiału należy natychmiast zdezynfekować świeżo przygotowanym roztworem podchlorynu sodu 0,5% (rozcieńczony wybielacz) lub postępować zgodnie z procedurami przyjętymi w danej instytucji. C. Należy stosować rutynowe laboratoryjne środki ostrożności. Nie należy pipetować za pomocą ust. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami zestawu należy stosować ochronne rękawice jednorazowe, fartuchy laboratoryjne oraz osłonę oczu. Po zakończeniu pracy z próbkami i odczynnikami testowymi należy dokładnie umyć ręce. D. Odczynniki DPX MMX-R1, DPX MMX-R2 i DPX IC/QS zawierają jako środek konserwujący azydek sodu. Jeśli roztwory zawierające azydki są usuwane do kanalizacji, należy je rozcieńczyć i spłukać dużą ilością bieżącej wody. Te środki ostrożności są zalecane w celu uniknięcia odkładania się złogów w metalowych rurach, co może spowodować zagrożenie wybuchem. E. Wykazano, że heparyna hamuje reakcję PCR. Do tej procedury nie należy stosować osocza heparynizowanego. F. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od nukleazy. Jeżeli w trakcie obsługi i przetwarzania próbek nie jest możliwa odpowiednia kontrola kontaminacji między próbkami, może dojść do wystąpienia wyników fałszywie dodatnich. G. Aby uzyskać optymalną skuteczność testu, należy stosować tylko dostarczone lub wymienione potrzebne materiały jednorazowego użytku. H. Aby uniknąć krzyżowego zanieczyszczenia próbek lub kontroli, z wszystkimi materiałami zawierającymi próbki lub kontrole należy postępować zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej. I. Przed użyciem należy ocenić wzrokowo każdą kasetę z odczynnikami, probówkę z kontrolą i odczynnik płuczący, aby się upewnić, że nie ma choćby najmniejszego wycieku. W razie wystąpienia wycieku nie wolno używać tego materiału do badania. J. Należy usuwać wszystkie materiały, które przypadkowo weszły w kontakt z próbkami i odczynnikami, zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. K. Nie należy używać zestawu testowego cobas® TaqScreen DPX, zestawu kontrolnego cobas® TaqScreen DPX ani odczynnika płuczącego cobas® TaqScreen po upływie daty ważności. Nie wolno zamieniać, mieszać ani łączyć odczynników z różnych zestawów ani z różnych serii. Nie należy umieszczać jednocześnie różnych serii odczynników w urządzeniu COBAS® AmpliPrep. L. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheet, MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 9 M. Należy unikać kontaktu odczynników ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, należy natychmiast spłukać dużą ilością wody; w przeciwnym razie mogą powstać oparzenia. Jeżeli dojdzie do rozlania wymienionych odczynników, przed wytarciem należy rozcieńczyć je wodą. N. Nie wolno dopuścić do kontaktu odczynnika LYS zawierającego tiocyjanian guanidyny z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Połączenie to może skutkować wytworzeniem silnie trującego gazu. O. Należy ściśle przestrzegać podanych procedur i wytycznych w celu zapewnienia prawidłowego wykonania testu. Wszelkie odchylenia od procedur i wytycznych mogą mieć wpływ na optymalną skuteczność testu. P. Należy unikać użycia nadmiernie zhemolizowanych próbek. Q. Zanieczyszczenie próbek osocza krwinkami czerwonymi (> 5%) może spowodować zahamowanie reakcji prowadzonych w teście cobas® TaqScreen DPX. R. W żadnej fazie testu nie należy używać składników z uszkodzonymi etykietami z kodem kreskowym. PRZYGOTOWANIE KONTROLI I ODCZYNNIKÓW A. Należy doprowadzić zestaw kontrolny cobas® TaqScreen DPX Control Kit do temperatury pokojowej przez 30 minut przed włożeniem do urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD lub przed użyciem. Należy ogrzewać odczynniki do testu cobas® TaqScreen DPX w urządzeniu ® COBAS AmpliPrep przez 30 minut przed użyciem. POBIERANIE, PRZECHOWYWANIE i MIESZANIE PRÓBEK Uwaga: Ze wszystkimi próbkami należy postępować jak z czynnikami zakaźnymi. Próbki ® A. Z testem cobas TaqScreen DPX można używać próbki osocza pobrane na EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, cytrynian sodu 4% i do probówek do przygotowywania próbek osocza BD Vacutainer (PTT). Należy przestrzegać instrukcji producenta probówek testowych. B. Krew pobrana na EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, cytrynian sodu 4% i do probówek PTT może być przechowywana do 72 godzin w temperaturze 2–30°C, a następnie do 48 godzin w temperaturze 2–8°C przed oddzieleniem osocza. W celu przechowywania dłuższego niż 5 dni należy oddzielić osocze od krwinek czerwonych i przechowywać w temperaturze 2–8°C przez co najwyżej 9 dni. Stabilność preparatu krwi pełnej 30 Temperatura (°C) Krew pełna (2°C–30°C) 20 10 Krew pełna (2°C–8°C) Osocze (2°C–8°C) 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Liczba dni C. Osocze z aferezy pobrane na EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A lub cytrynian sodu 4% można przechowywać do 10 dni od czasu pobrania w temperaturze 2–30°C, po okresie przechowywania do 46 dni w temperaturze 2–8°C. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 10 D. Przedstawione poniżej wskazówki dotyczące objętości osocza oparte są na pipetowaniu ze szklanych lub plastikowych probówek 13 x 100 mm od dawców w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Wymienione objętości dotyczą osocza powyżej upakowanych czerwonych krwinek i są używane podczas pracy z testem cobas® TaqScreen DPX. Typ puli Pula główna* Pula powtórzona Pula do rozdziału Minimalna objętość osocza 3 ml 1,5 ml 2 ml * Uwzględnia tworzenie płytki głębokodołkowej (płytka archiwizacyjna) E. Nie należy zamrażać krwi pełnej. F. Zakryte płytki głębokodołkowe można przechowywać w temperaturze ≤ –18°C do 50 dni. G. Osocze w EDTA, CPD, CPD-A, CP2D, ACD-A lub 4% cytrynianie sodu można przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze ≤ –18°C. Nie obserwowano ujemnego wpływu na skuteczność testu, gdy próbki osocza poddawano 3 cyklom zamrażania i rozmrażania. H. Przed użyciem należy ogrzać pulę próbek lub próbki od pojedynczych dawców do temperatury pokojowej. I. Inne warunki pobierania i przechowywania musi zweryfikować użytkownik. Jeśli próbki mają być przesyłane, należy je opakować i oznaczyć zgodnie z odpowiednimi przepisami federalnymi i międzynarodowymi dotyczącymi transportu próbek i czynników etiologicznych35. PULOWANIE I PIPETOWANIE PRÓBEK A. System cobas s 201 wykorzystuje wszystkie możliwości pipetowania i pulowania urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Za pomocą urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD przeprowadza się skanowanie kodów kreskowych i pulowanie próbek celem wytworzenia puli. B. Oprogramowanie PDM w wersji 3 lub nowszej umożliwia zainstalowanie pełnego systemu cobas s 201 bez urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD; w takim przypadku wymagane jest ręczne wprowadzanie kodów kreskowych z numerami identyfikacyjnymi próbki, statywu SK24 i pozycji oraz klipsa S. Dokładne instrukcje na temat wprowadzania kodów kreskowych można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. C. Jeśli w teście cobas® TaqScreen DPX pule wykażą reaktywność wobec HAV lub będą mieć wynik ≥ wartości odcięcia dla wirusa B19, urządzenie pipetujące Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD zostanie użyte do pipetowania pojedynczych próbek z płytki głębokodołkowej lub z oryginalnych probówek z próbkami w celu utworzenia mniejszych pul, podlegających dalszym testom. UWAGI PROCEDURALNE A. Wyposażenie 1. Należy przygotować system cobas s 201 do użytku zgodnie z instrukcjami w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. 2. Aby zapewnić prawidłowe działanie urządzenia, należy wykonywać zalecane czynności konserwacyjne. B. Odczynniki 1. Należy doprowadzić do temperatury pokojowej odczynniki z zestawu cobas® TaqScreen DPX Test w urządzeniu COBAS® AmpliPrep przez 30 minut przed użyciem. Zestaw cobas® TaqScreen DPX Control Kit i odczynnik płuczący cobas® TaqScreen Wash Reagent muszą przed użyciem uzyskać temperaturę pokojową. Informacje na temat warunków przechowywania można znaleźć w rozdziale Wymagania dotyczące przechowywania i użytkowania. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 11 2. Każdy zestaw cobas® TaqScreen DPX Test zawiera ilość materiału wystarczającą do wykonania łącznie 96 testów, które zaleca się przeprowadzać w partiach składających się z maksymalnie 24 testów na statyw SK24. Z każdą partią testową lub każdym statywem SK24 należy przetworzyć po jednym powtórzeniu kontroli ujemnej i dodatniej. W teście ® cobas TaqScreen DPX próbki i kontrole są poddawane tym samym procesom. 3. Wszystkie odczynniki kontrolne służą do jednorazowego użytku. 4. System pozwoli zapobiec użyciu odczynników z różnych serii, odczynników, w przypadku których została przekroczona dozwolona liczba godzin w urządzeniu, odczynników, których data ważności upłynęła, lub pomieszanych kaset z zestawu czterech kaset poprzednio używanych w systemie. Nie należy umieszczać jednocześnie różnych serii odczynników w urządzeniu COBAS® AmpliPrep. C. Przetwarzanie próbek 1. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami kontrolnymi należy unikać skażenia rękawiczek. 2. Należy uważać, aby nie doszło do skażenia próbek i kontroli ujemnych dodatnimi odczynnikami kontrolnymi. INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA W systemie cobas s 201 przeprowadza się cztery główne procesy: pipetowanie próbek i kontroli w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, przygotowywanie próbek w urządzeniu COBAS® AmpliPrep z użyciem zestawu cobas® TaqScreen DPX Test, amplifikację/ detekcję w analizatorze COBAS® TaqMan® i zarządzanie danymi. Każdy zestaw cobas® TaqScreen DPX Test zawiera osiem kaset: dwie kasety DPX CS1 ze szklanymi cząstkami magnetycznymi, dwie kasety DPX CS2 z odczynnikiem lizującym, dwie kasety DPX CS3 z proteazą i buforem do elucji oraz dwie kasety DPX CS4 z kontrolą wewnętrzną oraz odczynnikiem 1 i 2 MMX. Ten zestaw jest używany łącznie z zestawem cobas® TaqScreen DPX Control Kit i odczynnikiem płuczącym cobas® TaqScreen Wash Reagent. Uwaga: Nie należy otwierać kaset. Uwaga: Nie należy łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii. Uwaga: Nie należy umieszczać jednocześnie kaset z różnych serii w urządzeniu COBAS AmpliPrep. Uwaga: Nie należy oddzielać probówek kontrolnych od adapterów. ® Należy wykonywać wszystkie wymagane czynności zgodnie z opisem podanym w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. Dokładne instrukcje dotyczące użytkowania można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. A. Pipetowanie próbek i kontroli przy użyciu urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Uwaga: Podczas przygotowywania próbek i kontroli należy unikać skażenia rękawic. Uwaga: Należy wymieszać kontrole, delikatnie odwracając je trzykrotnie, unikając przy tym powstania pęcherzyków powietrza. 1. Należy wykonać procedury startowe w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, a następnie uruchomić zgodnie z instrukcjami na ekranie program Roche PDM Pooling Wizard. 2. Należy uważać, aby nie uszkodzić identyfikacyjnego kodu kreskowego na probówkach na próbki i adapterach probówek z kontrolami. W razie uszkodzenia system nie będzie mógł rozpoznać próbek ani kontroli. 3. Należy odkręcić probówki kontrolne i włożyć próbki, materiały eksploatacyjne i odczynniki kontrolne do urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Po włożeniu próbek, materiałów eksploatacyjnych i odczynników kontrolnych urządzenie przenosi odczynniki kontrolne i próbki do probówek S. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 12 4. Po zakończeniu pipetowania należy przejrzeć alarmy i wydrukować raport (raporty) pulowania. Należy sprawdzić pule i dołki płytki głębokodołkowej. Należy unieważnić pule i/lub dołki w razie zaobserwowania zabrudzenia czerwonymi krwinkami lub w przypadku różnych objętości. ® 5. Należy zamknąć probówki S i przenieść statyw (statywy) SK24 do urządzenia COBAS AmpliPrep celem wykonania ekstrakcji kwasów nukleinowych. Po przeniesieniu do probówek S wszystkie wirusy docelowe i kontrole zachowują stabilność do 6 godzin w probówce S. 6. Należy zamknąć i przechować płytki głębokodołkowe (jeśli płytki zostały utworzone podczas pipetowania). 7. Należy usunąć i przechować probówki od dawców. Warunki przechowywania zostały opisane w rozdziale „Pobieranie, przechowywanie i mieszanie próbek”. 8. Należy usunąć i wyrzucić probówki z odczynnikami kontrolnymi. (Probówki z kontrolami służą wyłącznie do jednorazowego użytku). 9. Wszystkie zlecenia testu są tworzone automatycznie i przekazywane do wszystkich stacji danych AMPLILINK w sieci. B. Przygotowywanie i wkładanie odczynników do testu cobas® TaqScreen DPX Uwaga: Należy uważać, aby nie uszkodzić etykiet kaset. Czytnik kodów kreskowych w urządzeniu COBAS® AmpliPrep służy do automatycznego odczytywania kodu kreskowego na etykiecie każdej z kaset, gdy statywy z odczynnikami są wkładane do urządzenia. 1. Należy ogrzewać odczynniki przez 30 minut w urządzeniu COBAS® AmpliPrep przed przetworzeniem pierwszej próbki. Nie jest wymagane żadne inne przygotowywanie odczynników. 2. Przed rozpoczęciem należy włożyć odpowiednią liczbę kaset, aby dostosować ich liczbę do ® całkowitej liczby próbek, które będą przetwarzane podczas ciągłej pracy urządzenia COBAS AmpliPrep. Każda kaseta zawiera ilość odczynników wystarczającą do przeprowadzenia 48 testów. Informacje na temat wkładania odczynników do pracy ciągłej można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. 3. Należy umieścić kasetę DPX CS1 w statywie na odczynniki; należy się upewnić, że kod kreskowy kasety znajduje się w jednej linii z kodem kreskowym statywu, umieszczonym po prawej stronie statywu. Kasety DPX CS1 należy włożyć razem w osobnym statywie na odczynniki, oddzielnie od innych kaset. 4. Należy umieścić statyw z odczynnikami zawierający kasety DPX CS1 w pozycji A, ® wsuwając go aż do kołka blokującego w urządzeniu COBAS AmpliPrep, następnie zaczekać, aż dioda statywu na odczynniki stanie się zielona, i dopiero wtedy wsunąć statyw we właściwe miejsce w tylnej części urządzenia. Nie należy umieszczać jednocześnie różnych serii odczynników w urządzeniu. 5. Należy umieścić po jednym zestawie kaset DPX CS2, DPX CS3 i DPX CS4 na każdą kasetę DPX CS1 w statywie (statywach) na odczynniki; należy się upewnić, że kody kreskowe kasety znajdują się w jednej linii z kodem kreskowym statywu umieszczonym po prawej stronie statywu. 6. Należy umieścić statyw (statywy) na odczynniki w pozycjach B, C, D lub E, wsuwając je aż do kołka w urządzeniu COBAS® AmpliPrep, następnie zaczekać, aż dioda statywu na odczynniki stanie się zielona, i dopiero wtedy wsunąć statyw we właściwe miejsce w tylnej części urządzenia. 7. Diody na pasku stanu urządzenia COBAS® AmpliPrep staną się zielone, gdy wszystkie wymagane składniki zestawu zostaną włożone i rozpoznane przez system. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 13 C. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z pipetowanych próbek i kontroli Uwaga: Przedstawione poniżej czynności należy wykonać na czystej powierzchni stołu. 1. Należy usunąć opakowanie z pakietu jednostek przetwarzania próbek (SPU), pozostawiając nietkniętą taśmę i plastikową pokrywę. 2. Mając uchwyt statywu na SPU skierowany do użytkownika, należy włożyć pakiet jednostek SPU z prawej strony statywu na SPU. 3. Należy usunąć taśmę i plastikową pokrywę z jednostek SPU znajdujących się w statywie. Należy się upewnić, że wszystkie jednostki SPU są wciśnięte, wyrównane i dokładnie umieszczone w statywie. Uniesione jednostki SPU mogą spowodować uszkodzenie urządzenia. Nie należy naciskać na końcówkę S w SPU. 4. Należy umieścić statywy z SPU w urządzeniu COBAS® AmpliPrep statywy na SPU w pozycjach J, K lub L w taki sposób, aby były do końca wsunięte i rozpoznane. Jednocześnie w urządzeniu może znajdować się do 72 jednostek SPU. Należy włożyć wymaganą do testu liczbę jednostek SPU lub w razie potrzeby większą. 5. Należy usunąć opakowanie celofanowe z zapakowanych przez producenta statywów z probówkami K i końcówkami K, uważając przy tym, aby nie przewrócić statywów. Należy się upewnić, że wszystkie są prawidłowo osadzone. 6. Należy umieścić jak najmniejszą wymaganą liczbę statywów z probówkami K i końcówkami K ® w pozycjach M, N, O lub P urządzenia COBAS AmpliPrep. 7. Statywy SK24 zawierające próbki i kontrole napipetowane w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD należy umieścić w urządzeniu COBAS® AmpliPrep w pozycjach F, G lub H. Należy wsunąć statyw aż do zablokowania. Należy sprawdzić status zakładki Sample, aby się upewnić, że wszystkie próbki w każdym statywie zostały rozpoznane. 8. Należy sprawdzić w oprogramowaniu AMPLILINK, czy do wymaganego przygotowania próbek włożone są odpowiednie ilości odczynników i materiałów eksploatacyjnych. 9. Należy nacisnąć przycisk Start w oprogramowaniu AMPLILINK, aby rozpocząć procedurę przygotowania próbek przez urządzenie COBAS® AmpliPrep. 10. Wszystkie nieużywane końcówki K i probówki K pozostaną zablokowane w urządzeniu COBAS® AmpliPrep i będą używane w następnym przebiegu. D. Amplifikacja i detekcja 1. Należy przenieść statyw SK24 zawierający przetworzone próbki do analizatora COBAS® TaqMan®. Całkowicie wypełniony statyw SK24 należy przenieść do analizatora w ciągu 1 godziny od przygotowania w nim próbek. Analizator COBAS® TaqMan® automatycznie rozpocznie amplifikację i detekcję. Wyniki partii całkowicie wypełnionych statywów nieprzeniesionych w ciągu 1 godziny będą nieważne. Wyniki partii statywów SK24 niecałkowicie wypełnionych nieprzeniesionych w ciągu 1 godziny mogą być ważne. Oprogramowanie AMPLILINK mierzy dozwolony czas między dodaniem odczynnika Master Mix i rozpoczęciem amplifikacji/detekcji dla każdej z próbek. Jeśli pierwsza z przetwarzanych próbek przekroczy limit czasowy, cały statyw jest określany jako nieważny. 2. Po zakończeniu amplifikacji i detekcji w analizatorze COBAS® TaqMan® analizowane próbki są automatycznie usuwane do pojemnika na odpady. 3. Wyniki są automatycznie akceptowane i przesyłane do oprogramowania PDM. E. Przeglądanie i drukowanie wyników 1. Należy uruchomić stację roboczą Roche PDM. 2. Należy odszukać nieprzeglądane partie w zakładce „Review Batches” w stacji roboczej Data Manager. 3. Należy przejrzeć alarmy, podświetlając partię, a następnie klikając przycisk „Next”. 4. Należy przejrzeć wyniki dla kontroli w zakładce „Controls Review”. Kryteria ważności kontroli można znaleźć w rozdziale „Kontrola jakości”. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 14 5. Należy przejrzeć wyniki puli w zakładce „Pools Review” dla wybranej partii. W razie konieczności użytkownik może ręcznie unieważnić pule niereaktywne dla HAV i z wynikiem < wartości odcięcia dla wirusa B19. Próbki od dawców z nieważnych pul należy przebadać ponownie. 6. Należy przejrzeć i zwolnić wyniki dawców w zakładce „Donor Review” dla wybranej partii. 7. Należy wydrukować raporty i w razie potrzeby przesłać je do laboratoryjnego systemu informatycznego (LIS). KONTROLA JAKOŚCI 1. W każdej partii należy uwzględnić jedną kontrolę ujemną (DPX (–) C) i po jednej z dwóch kontroli dodatnich (DPX D(+)C i DPX H(+)C). 2. Status partii. Status partii jest opisany jako „Complete, Valid”, gdy kontrole partii są ważne. Jeśli którakolwiek z kontroli w partii jest nieważna, cała partia jest nieważna. Unieważnienie wyników na podstawie błędów kontroli jest przeprowadzane automatycznie przez oprogramowanie PDM. a. Kontrola ujemna Ważność kontroli ujemnej jest weryfikowana zgodnie z przeprowadzanym testem. Test DPX (HAV i B19). Aby kontrola ujemna (DPX (–) C) była ważna, interpretowany wynik musi być niereaktywny zarówno dla HAV, jak i dla parwowirusa B19, a kontrola IC i standard QS muszą być ważne. Jeśli interpretowany wynik dla kontroli ujemnej jest nieważny, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. Test tylko na wirusa B19. Aby kontrola ujemna (DPX (–) C) była ważna, interpretowany wynik musi być niereaktywny dla parwowirusa B19, a odpowiedni standard QS musi być ważny. Jeśli interpretowany wynik dla kontroli ujemnej jest nieważny, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. b. Podwójna kontrola dodatnia DPX Ważność podwójnej kontroli dodatniej DPX jest weryfikowana zgodnie z przeprowadzanym testem. Test DPX (HAV i B19). Aby podwójna kontrola dodatnia (DPX D(+)C) była ważna, interpretowany wynik musi być reaktywny dla HAV, stężenie parwowirusa B19 musi wynosić od 1,21 x 102 do 1,21 x 103 IU/ml, a odpowiednia kontrola IC i standard QS muszą być ważne. Jeśli interpretowany wynik dla HAV jest nieważny lub stężenie parwowirusa B19 jest poza akceptowalnym zakresem, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. Test tylko na wirusa B19. Aby podwójna kontrola dodatnia (DPX D(+)C) była ważna, interpretowany wynik musi wskazywać stężenie parwowirusa B19 od 1,21 x 102 do 1,21 x 103 IU/ml, a odpowiedni standard QS musi być ważny. Jeśli interpretowany wynik wskazuje na stężenie parwowirusa B19 poza akceptowalnym zakresem, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. c. Kontrola wysoko dodatnia DPX Aby kontrola wysoko dodatnia DPX (DPX H(+)C) była ważna, stężenie parwowirusa B19 musi wynosić od 2,43 x 105 do 2,42 x 106 IU/ml, a odpowiadający jej standard QS musi być ważny. Jeśli stężenie parwowirusa B19 jest poza akceptowalnym zakresem, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. 3. IC dla próbek od dawców a. Aby próbka od dawcy miała ważny niereaktywny (–) wynik testu dla HAV, odpowiednia kontrola IC musi być ważna; w przeciwnym razie wynik niereaktywny jest nieważny i należy ponownie zbadać próbkę dawcy. b. Ważny wynik dla próbki od dawcy reaktywnej wobec HAV może mieć ważny lub nieważny wynik przeprowadzonej kontroli IC. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 15 4. QS dla próbek od dawców a. Aby próbka od dawcy miała ważny wynik testu dla parwowirusa B19, odpowiedni standard QS musi być ważny; w przeciwnym razie wynik jest nieważny i należy ponownie zbadać próbkę dawcy. WYNIKI 1. Wyniki próbek są ważne tylko wówczas, gdy zawierająca je partia jest ważna. Kryteria kontroli jakości można znaleźć w rozdziale Kontrola jakości. Dla każdej próbki mierzone są cztery parametry: po jednym dla docelowych wirusów HAV i B19 oraz po jednym dla IC i QS. Test tylko na wirusa B19. Dla każdej próbki mierzone są dwa parametry: docelowy wirus B19 i QS. 2. Ostateczne wyniki testu mogą być niereaktywne, reaktywne lub nieważne dla docelowego HAV bądź < wartości odcięcia, ≥ wartości odcięcia lub nieważne dla docelowego wirusa B19. 3. Ostateczny status próbki od dawcy w teście cobas® TaqScreen DPX jest przedstawiany przez oprogramowanie PDM następująco: Końcowy status próbki od dawcy Completed Accepted Completed Unresolved Accepted Unresolved Opis Uzyskano ostateczne wyniki dla każdego docelowego wirusa. Zaakceptowano ukończony test dla próbki od dawcy. Termin ważności upłynął, zanim test został zaakceptowany. Zaakceptowano nierozstrzygnięty ukończony test próbki od dawcy. Powtarzanie testu dla danej próbki Probówki z próbkami od dawców z ostatecznym wynikiem nieważnym dla jednego z docelowych wirusów wymagają powtórnego badania, niezależnie od końcowego wyniku dla drugiego z docelowych wirusów. Użytkownik może jednak wybrać opcję „Force Unresolve”, aby zakończyć pracę z próbką danego dawcy. Zastosowanie funkcji „Force Unresolve” powoduje przypisanie stanu „Accepted Unresolved” próbce od dawcy, dla której nie uzyskano ostatecznego wyniku reaktywności wobec HAV lub ≥ wartości odcięcia dla wirusa B19, bądź przypisanie stanu „Accepted”, jeśli uzyskano wynik reaktywności wobec HAV lub ≥ wartości odcięcia dla wirusa B19. Badanie puli wtórnej Probówki z próbkami od dawców w zawierającej wiele próbek puli z ostatecznym wynikiem nieważnym dla jednego z wirusów docelowych wymagają powtórnego badania, jeśli ostateczny wynik drugiego z docelowych wirusów jest niereaktywny dla HAV lub < wartości odcięcia dla wirusa B19. W przypadku gdy zebrany materiał obejmujący wiele próbek zostanie oznaczony jako reaktywny wobec HAV lub ≥ wartości odcięcia dla wirusa B19, nastąpi przydzielenie przez system cobas s 201 wszystkim próbkom od dawców, których materiał znalazł się w puli, żądania pulowania do badania puli wtórnej. Próbki od tych dawców są pipetowane za pomocą urządzenia Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (zarówno z płytek głębokodołkowych, jak i z pierwotnych probówek zawierających materiał od dawców) do uzyskania mniejszych pul, zawierających próbki mniejszej liczby dawców lub pojedynczego dawcy, a następnie badane ponownie za pomocą testu cobas® TaqScreen DPX jako element procesu rozstrzygania, który ma na celu zidentyfikowanie próbek od poszczególnych dawców, reaktywnych wobec HAV lub z wynikiem ≥ wartości odcięcia dla wirusa B19. Dokładne instrukcje na temat przeprowadzania testów rozstrzygających można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. Jeżeli subpula zawierająca wiele próbek jest raportowana jako niereaktywna dla HAV i z wynikiem < wartości odcięcia dla wirusa B19, poszczególne próbki są oznaczane jako „Completed” z ostatecznym wynikiem niereaktywnym dla HAV i < wartości odcięcia dla wirusa B19. Uwaga: Użytkownik może przeprowadzić dodatkowe badanie, jako element ogólnego programu kontroli jakości, aby stwierdzić przyczynę początkowego dodatniego wyniku dla puli. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 16 OGRANICZENIA METODY ® 1. Test ten zaprojektowano wyłącznie do użytku z zestawem cobas TaqScreen DPX Test, zestawem kontrolnym cobas® TaqScreen DPX Control Kit oraz z odczynnikiem płuczącym cobas® TaqScreen Wash Reagent i systemem cobas s 201. 2. Wykazano, że heparyna hamuje reakcję PCR. Do tej procedury nie należy stosować osocza heparynizowanego. 3. Wiarygodne wyniki są zależne od zachowania odpowiednich procedur pobierania próbek oraz transportu. 4. Do zautomatyzowanego przygotowywania pul osocza do testu cobas® TaqScreen DPX wolno używać wyłącznie urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Należy przestrzegać instrukcji sprzętowych i środków ostrożności opisanych w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201 i w Podręczniku użytkownika urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. 5. Detekcja RNA HAV i oznaczanie ilościowe DNA parwowirusa B19 zależy od liczby cząsteczek wirusa obecnych w próbce, na którą wpływać mogą metody pobierania próbek, czynniki związane z pacjentem (tj. wiek, obecność objawów) i/lub faza zakażenia oraz wielkość puli. 6. Mutacje w obrębie wysoce konserwatywnych regionów genomu wirusowego, z którym wiążą się startery i/lub sondy używane w teście cobas® TaqScreen DPX, chociaż rzadkie, mogą spowodować niewykrycie HAV lub nieprawidłowe oznaczanie ilościowe DNA parwowirusa B19. 7. Z uwagi na różnice między technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia występujących między nimi różnic jakościowych. Użytkownicy powinni postępować zgodnie z własnymi określonymi zasadami/procedurami. CHARAKTERYSTYKA SKUTECZNOŚCI Powtarzalność ® Powtarzalność testu cobas TaqScreen DPX przy wykrywaniu HAV określono, badając panele osocza składające się z 8 próbek, w tym jednej ujemnej dla HAV i 7 o znanych stężeniach HAV wynoszących 0,35, 0,5, 0,71, 1, 1,41, 2,5 i 3,75 IU/ml. Badanie zostało przeprowadzone przez 9 operatorów przy użyciu 3 serii zestawu cobas® TaqScreen DPX Test w ciągu dwóch dni, z zastosowaniem 6 zestawów urządzeń. Wszystkie ważne wyniki określono, obliczając procent dodatnich wyników testu dla każdego elementu panelu. Dane były analizowane według daty przeprowadzenia i serii zestawu. Badanie to wykazało powtarzalność testu cobas® TaqScreen DPX niezależnie od serii zestawu (tabela 1) i daty badania (tabela 2). Tabela 1 Powtarzalność między seriami Stężenie HAV (IU/ml) Wyniki dodatnie według serii odczynnika Seria nr 1 Seria nr 2 Seria nr 3 3,75 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 2,50 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 100,0% (62/62) 1,41 100,0% (62/62) 100,0% (63/63) 96,8% (61/63) 1,00 93,7% (59/63) 90,5% (57/63) 95,2% (60/63) 0,71 85,7% (54/63) 90,5% (57/63) 81,0% (51/63) 0,50 74,6% (47/63) 74,6% (47/63) 76,2% (48/63) 0,35 63,5% (40/63) 69,8% (44/63) 69,8% (44/63) 0,00 0,0% (0/63) 0,0% (0/63) 0,0% (0/63) 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 17 Tabela 2 Powtarzalność między dniami Stężenie HAV (IU/ml) 3,75 2,50 1,41 1,00 0,71 0,50 0,35 0,00 Wyniki dodatnie według daty Dzień 1 Dzień 2 100,0% 100,0% (63/63) (126/126) 100,0% 100,0% (63/63) (125/125) 100,0% (62/62) 98,4% (124/126) 93,7% (59/63) 92,9% (117/126) 85,7% (54/63) 85,7% (108/126) 74,6% (47/63) 75,4% (95/126) 63,5% (40/63) 69,8% (88/126) 0,0% (0/63) 0,0% (0/126) Dokładność oznaczenia ilościowego parwowirusa B19 Dokładność oznaczenia ilościowego parwowirusa B19 w przy użyciu testu cobas® TaqScreen DPX określono, badając panele osocza składające się z 4 próbek o znanych stężeniach wirusa B19 wynoszących 103, 104, 105 i 106 IU/ml. Wszystkie ważne wyniki określono, obliczając odchylenie standardowe miana parwowirusa B19 (log10 IU/ml) dla każdego elementu panelu. Dane z 2 serii zestawu były analizowane osobno i łącznie. ® Badanie to wykazało powtarzalność testu cobas (tabela 3). TaqScreen DPX niezależnie od serii zestawu Tabela 3 Odchylenie standardowe miana parwowirusa B19 log10 IU/ml (n = 20) dla różnych serii zestawu Elementy panelu wirusa B19 (IU/ml) 106 105 104 103 Seria zestawu nr 1 0,073 0,051 0,071 0,218 Seria zestawu nr 2 0,103 0,083 0,071 0,112 Serie 1 i 2 łącznie Ogółem (103–106) 0,123 0,094 0,110 0,088 0,070 0,070 0,176 Czułość analityczna — międzynarodowy standard WHO ® Granice wykrywalności (Limit of Detection, LOD) 95% dla testu cobas TaqScreen DPX zostały określone dla RNA HAV i DNA parwowirusa B19 z zastosowaniem międzynarodowego standardu WHO 36 odpowiednio dla HAV (kod NIBSC 00/560) i dla parwowirusa B19 (kod NIBSC 99/800)27. Trzy niezależne serie rozcieńczeń każdego standardu wirusowego zostały przygotowane w prawidłowym, ujemnym pod względem obecności wirusów, ludzkim osoczu. Wszystkie serie rozcieńczeń badano przy użyciu trzech różnych serii zestawu testowego cobas® TaqScreen DPX z 21 kopiami na serię, co daje w sumie 189 kopii na dane stężenie. W tabelach 4 i 5 przedstawiono analizę częstości wyników reaktywnych odpowiednio dla HAV i B19. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 18 Tabela 4 Międzynarodowy standard WHO dla HAV (00/560) Podsumowanie częstości wyników reaktywnych Stężenie RNA HAV (IU/ml) 3,75 Liczba wyników dodatnich 189 2,50 188 1,41 Liczba badań % wyników dodatnich 189 100,0% Dolny zakres przedziału ufności 95% (jednostronny) 98,1% 188 100,0% 98,1% 186 188 98,9% 96,2% 1,00 176 189 93,1% 88,5% 0,71 162 189 85,7% 79,9% 0,50 142 189 75,1% 68,3% 0,35 128 189 67,7% 60,6% 0,00 0 189 0,0% 0,0% Tabela 5 Międzynarodowy standard WHO dla parwowirusa B19 (99/800) Podsumowanie częstości wyników reaktywnych Stężenie DNA parwowirusa B19 (IU/ml) Liczba wyników dodatnich Liczba badań % wyników dodatnich Dolny zakres przedziału ufności 95% (jednostronny) 75,00 189 189 100,0% 98,1% 50,00 188 188 100,0% 98,1% 28,28 189 189 100,0% 98,1% 20,00 187 189 98,9% 96,2% 14,14 189 189 100,0% 98,1% 10,00 170 189 89,9% 84,7% 7,07 142 189 75,1% 68,3% 0,00 0 189 0,0% 0,0% Do oszacowania granicy wykrywalności (Limit of Detection, LOD) 95% i dwustronnego znacznikowego przedziału ufności 95% (tabela 6) została użyta analiza PROBIT łącznych danych ze wszystkich kopii badanych dla każdego wirusa. Tabela 6 LOD 95% na podstawie analizy PROBIT Wirus LOD (IU/ml) HAV Parwowirus B19 1,06 11,48 Dolna wartość C.L.* 95% 0,94 10,56 Górna wartość C.L. 95% 1,24 12,91 * C.L.: granica ufności (Confidence Limit) Liniowość oznaczenia ilościowego parwowirusa B19 Liniowość oznaczenia ilościowego parwowirusa B19 w teście cobas® TaqScreen DPX określono, badając seryjne rozcieńczenia genotypu 1 parwowirusa B19 kalibrowane według międzynarodowego standardu WHO (kod NIBSC 99/800). Badanie przeprowadzono z użyciem 2 serii odczynników. Określono, że test jest liniowy w zakresie od 75 do 3,0 x 108 IU/ml zgodnie z wytycznymi CLSI EP6-A (rysunek 1). 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 19 Rysunek 1 Liniowość testu cobas® TaqScreen DPX w oznaczaniu parwowirusa B19 Wynik testu (log10 IU/ml) 8 7 6 5 y = 1,060x–0,442 R2 = 0,996 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 Nominalne stężenie parwowirusa B19 (log10 IU/ml) Liniowość oznaczenia ilościowego parwowirusa B19 według genotypu Liniowość testu cobas® TaqScreen DPX określono dla poszczególnych genotypów parwowirusa B19, badając 5–6 rozcieńczeń próbek klinicznych każdego genotypu parwowirusa B19. Z zastosowaniem jednej serii odczynników przeprowadzono 4–6 powtórzeń dla każdej próbki i każdego rozcieńczenia (tabela 7). Tabela 7 Oznaczenie ilościowe genotypów parwowirusa B19 Genotyp 1 2 3a IU/ml 5 x 102 log10 IU/ml 2,70 Średnie obserwowane stężenie wirusa B19 log10 IU/ml 2,49 1 x 104 4,00 3,94 –0,08 5 1 x 10 5,00 4,77 –0,23 1 x 106 6,00 5,73 –0,27 1 x 107 7,00 6,84 –0,16 5 x 102 2,70 3,00 0,30 4 1 x 10 4,00 4,14 0,14 1 x 105 5,00 4,96 –0,04 3 x 10 5 5,48 5,32 –0,16 1 x 106 6,00 5,72 –0,28 1 x 10 7 7,00 6,44 –0,56 5 x 102 2,70 3,04 0,34 1 x 104 4,00 4,24 0,24 5 1 x 10 5,00 5,03 0,03 3 x 105 5,48 5,44 –0,04 1 x 106 6,00 5,83 –0,17 1 x 107 7,00 6,53 –0,47 Stężenie wejściowe wirusa B19 06362265049-02PL Średnia różnica: log10 z obserwowanego stężenia wirusa B19 – log10 z wejściowego stężenia wirusa B19 –0,21 Doc Rev. 2.0 20 Reprezentatywność genotypu ® Określono skuteczność testu cobas TaqScreen DPX w oznaczaniu różnych genotypów HAV i parwowirusa B19. HAV Badano próbki kliniczne i transkrypty RNA różnych genotypów HAV rozcieńczone do ok. 0,3-, 1- i 3-krotności wartości granicy oznaczalności (Limit of Detection, LOD) testu cobas® TaqScreen DPX. Analiza PROBIT wykazała, że wartość LOD dla próbek poszczególnych genotypów była równoważna z LOD dla międzynarodowego standardu WHO (00/560) (tabela 8). Tabela 8 Reprezentatywność genotypów HAV Genotyp Częstość wyników reaktywnych przy 0,3 x LOD Częstość wyników reaktywnych przy 1 x LOD Częstość wyników reaktywnych przy 3 x LOD LOD (C.I. 95%) IU/ml IA IB IIA IIB IIIA IIIB 65,8% (158/240) 41,7% (30/72) 79,2% (19/24) 79,2% (19/24) 73,6% (53/72) 43,8% (21/48) 96,3% (231/240) 86,1% (62/72) 91,7% (22/24) 100,0% (24/24) 97,2% (70/72) 91,7% (44/48) 100,0% (240/240) 100,0% (72/72) 100,0% (24/24) 100,0% (24/24) 100,0% (72/72) 100,0% (48/48) 0,92 (0,77–1,18) 1,58 (1,18–2,51) 1,18 (0,61–257) 0,37 (brak danych*) 0,80 (0,59–1,56) 1,25 (0,91–2,27) Zastosowano jedenaście próbek klinicznych (10 próbek genotypu IA i 1 genotypu IB) oraz 9 transkryptów (2 genotypu IB, 1 genotypu IIA, 1 genotypu IIB, 3 genotypu IIIA i 2 genotypu IIIB). * Nie udało się uzyskać przedziałów ufności za pomocą analizy PROBIT. Parwowirus B19 Badano próbki kliniczne i plazmidy z różnymi genotypami parwowirusa B19 rozcieńczonymi do ok. 0,3-, 1- i 3-krotności wartości granicy oznaczalności (Limit of Detection, LOD) testu cobas® TaqScreen DPX. Analiza PROBIT wykazała, że wartość LOD dla próbek poszczególnych genotypów była równoważna z LOD dla międzynarodowego standardu WHO (99/800) lub korzystniejsza (tabela 9). Tabela 9 Reprezentatywność genotypów parwowirusa B19 Genotyp 1 2 3A 3B Częstość wyników reaktywnych przy 0,3 x LOD 15,6% (15/96) 88,5% (85/96) 83,3% (40/48) 91,7% (44/48) Częstość wyników reaktywnych przy 1 x LOD 90,6% (87/96) 100,0% (96/96) 100,0% (48/48) 97,9% (47/48) Częstość wyników reaktywnych przy 3 x LOD 100,0% (97/97) 99,0% (95/96) 100,0% (48/48) 100,0% (48/48) LOD (C.I. 95%) IU/ml 13,57 (11,39–17,27) 6,07 (brak danych*) 3,94 (brak danych*) 5,31 (brak danych*) Zastosowano trzy próbki kliniczne (genotypy 1A, 3A i 3B) i 2 plazmidy (genotyp 2). * Nie udało się uzyskać przedziałów ufności za pomocą analizy PROBIT. Drobnoustroje mogące wywoływać reaktywność krzyżową i zakłócenia testu Oceniano możliwą reaktywność krzyżową i zakłócenia testu cobas® TaqScreen DPX wywoływane przez inne mikroorganizmy, badając panel 19 mikroorganizmów, w tym 13 izolatów wirusowych, 5 szczepów bakteryjnych i 1 izolatu drożdżaków (tabela 10). Mikroorganizmy dodano do prawidłowego osocza ludzkiego i przebadano testem cobas® TaqScreen DPX przy nieobecności HAV i w stężeniu równym 3-krotności wartości jego granicy oznaczalności, jak również 5-krotności wartości dolnej granicy oceny ilościowej parwowirusa B19. Uzyskano w teście cobas® TaqScreen DPX wyniki niereaktywne dla wszystkich próbek zawierających mikroorganizmy, lecz niezawierających HAV ani parwowirusa B19. Badane mikroorganizmy nie dają reakcji krzyżowej w teście cobas® TaqScreen DPX. Uzyskano wyniki reaktywne dla wszystkich próbek zawierających mikroorganizmy i wirus HAV oraz parwowirus B19. Badane mikroorganizmy nie zakłócają działania testu cobas® TaqScreen DPX. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 21 Tabela 10 Badane mikroorganizmy Swoistość analityczna — badane mikroorganizmy Adenowirus 5 WNV Cytomegalowirus (CMV) HIV-1 (grupa M) Wirus Epsteina–Barr (EBV) Wirus ospy wietrznej– półpaśca (VZV) Ludzki wirus T-limfotropowy typu I (HTLV I) Wirus grypy typu A HCV Staphylococcus aureus (BMTU 2947) Koagulazoujemny Staphylococcus epidermidis HIV-2 Propionibacterium acnes HBV Streptococcus viridans Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) Wirus opryszczki pospolitej typu 2 (HSV-2) Escherichia coli Candida albicans (BMTU 2949) Substancje potencjalnie wpływające na wynik testu Endogenne substancje wpływające na wynik testu Próbki osocza z nieprawidłowo wysokim poziomem trójglicerydów (33 g/l), hemoglobiny (2 g/l), niezwiązanej bilirubiny (200 mg/dl), albuminy (60 g/l), ludzkiego DNA (4 mg/l) lub krwinek czerwonych (5% obj.) zostały przebadane testem cobas® TaqScreen DPX przy nieobecności HAV i w stężeniu równym 3-krotności wartości jego granicy oznaczalności, jak również 5-krotności wartości dolnej granicy oceny ilościowej parwowirusa B19. Wymienione powyżej substancje endogenne i krwinki czerwone (5% obj.) nie wpłynęły na czułość ani swoistość testu cobas® TaqScreen DPX. Substancje egzogenne wpływające na wynik testu Prawidłowe próbki ludzkiego osocza zawierające podwyższone stężenie acetaminofenu (1324 µmol/l), kwasu acetylosalicylowego (3,62 mmol/l), kwasu askorbinowego (342 µmol/l), atorwastatyny (600 eq/l), fluoksetyny (11,2 µmol/l), ibuprofenu (2425 µmol/l), loratadyny (0,78 µmol/l), nadololu (3,88 µmol/l), naproksenu (2170 µmol/l), paroksetyny (3,04 µmol/l), chlorowodorku fenylefryny (491 µmol/l) i sertraliny (1,96 µmol/l) zostały przebadane testem cobas® TaqScreen DPX przy nieobecności HAV i w stężeniu równym 3-krotności wartości jego granicy oznaczalności, jak również 5-krotności wartości dolnej granicy oceny ilościowej parwowirusa B19. Wymienione powyżej substancje egzogenne nie wpłynęły na czułość ani swoistość testu cobas® TaqScreen DPX. Swoistość Przebadano pięćset trzydzieści osiem pochodzących od różnych dawców próbek osocza ujemnego dla parwowirusa B19 z zastosowaniem jednej z dwóch serii zestawu testowego cobas® TaqScreen DPX. Odnotowano swoistość na poziomie odpowiednio 96,3% i 99,8% dla parwowirusa B19 i HAV. Można oczekiwać niższej swoistości dla parwowirusa B19, wynikającej z endemicznego występowania parwowirusa B19 w populacji ogólnej2, 3 i czułości zestawu testowego cobas® TaqScreen DPX. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 22 PIŚMIENNICTWO 1. Servant A, Laperche S, Lallemand F, Marinho V, De Saint Maur G, Meritet JF, Garbarg-Chenon A. Genetic diversity within human Erythroviruses: identification of three genotypes. J Virol 2002; 76:9124–34. 2. Anderson MJ, Tsou C, Parker RA, Chorba TL, Wolfe H, Tattersal P, Mortimer PP. Detection of antibodies and antigen of human parvovirus B18 by enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Clinical Microbiology 1986;24:522 526. 3. Cohen BJ, Buckley MM. The prevalence of antibody to human parvovirus B19 in England and Wales. Journal of Medical Microbiology 1988;25:151-153. 4. Young NS, Brown KE. Mechanisms of disease: parvovirus B19. New England Journal of medicine 2004;350:586-597. 5. Yoto Y, Kudoh T, Haseyama K, Suzuki N, Oda T, Katoh T, Takahashi T, Sekiguchi S, Chiba S. Incidence of human parvovirus B19 DNA detection in blood donors. British Journal of Haematology 1995;91:1017-1018. 6. McOmish F, Yap PL, Jordan A, Hart H, Cohen BJ, Simmonds P. Detection of parvovirus B19 in donated blood: a model system for screening by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 1993;31:323-328. 7. Wu CG, Mason B, Jong J, Erdman D, McKernan L, Oakley M, Soucie M, Evatt B, Yu MY. Parvovirus B19 transmission by a high-purity factor VIII concentrate. Transfusion 2005;45:1003-1010. 8. Saldanha J, Minor P. Detection of human parvovirus B19 in plasma pools and blood products derived from these pools: implications for efficiency and consistency of removal of B19 DNA during manufacture> British Journal of Haematology 1996;93:714-719. 9. Eis-Hubinger AM, Sasowski U, Brackmann HH. Parvovirus B19 DANN contamination in coagulation factor VIII products. Thrombosis and Haemostasis 1999;81:476-477. 10. Schmidt I, Blumel J, Seitz H, Wilkommen H, Lower J. Parvovirus B19 DNA in plasma pools and plasma derivatives. Vox Sanguinis 2001;81:228-235. 11. Azzi A, Moefini M, Mannucci PM. The transfusion-associated transmission of parvovirus B19. Transfusion Medicine Reviews 1999;13:194-204. 12. Yee TT, Cohen BJ, Pasi KL, Lee CA. Transmission of symptomatic parvovirus B19 infection by clotting factor concentrate. British Journal of Haematology 1996;93:457-459. 13. Blümel J., Schmid, I., Effenberger W., Seitz H., Willkommen H., Brackmann H. H., Löwer J. EisHübinger AM. Parvovirus B19 transmission by heat treated clotting factor concentrates. Transfusion 2002;42:1473-1481. 14. Francki RIB, Fauquet CM, Knudson DL, Brown F. Classification and nomenclature of viruses. Archives of Virology 1991;Suppl. 2:320-326. 15. Gust ID. Epidemiology patterns of hepatitis A in different parts of the world. Vaccine 1992;10:856-862. 16. Shapiro CN, Margolis HS. Worldwide epidemiology of hepatitis A virus infection. Journal of Hepatology 1993;18:11-14. 17. Hadler SC. Global impact of hepatitis A virus infection changing patterns. In: Hollinger FB, Lemon SM, and Margolis HS, eds. Viral Hepatitis and Liver Disease. Baltimore, Williams & Wilkins, 1991: 14-20. 18. Robertson BH, Jansen RE, Khanna B, Totsuka A, Nainan OV, Siegl G, Widell A, Margolis H, Isomura S, Ito K, Ishizu T, Moritsugu Y, Lemon, SM. Genetic relatedness of hepatitis A virus strains recovered from different geographical regions. Journal of General Virology 1992;73:1365-1377. 19. Costa-Mattioli M, Cristina J, Romero H, Perez-Bercof R, Casane D, Colina R, Garcia L, Vega I, Glikman G, Romanowsky V, Castello A, Nicand E, Gassin M, Billaudel S, Ferre V. Molecular evolution of hepatitis A virus: a new classification based on the complete VP1 protein. Journal of Virology 2002;76:9516-9525. 20. Bower WA, Nainan OV, Han X, Margolis HS. Duration of viremia in hepatitis A virus infection. Journal of Infectious Diseases 2000;182:12-17. 21. Gowland P, Fontana S, Niederhauser C, Manouri Taleghani B. Molecular and serologic tracing of a transfusion-transmitted hepatitis A virus. Transfusion 2004;44:1555-1561. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 23 22. Soucie JM, Robertson BH, Bell BP, McCaustland KA, Evatt BL. Hepatitis A virus infections associated with clotting factor concentrate in the United States. Transfusion 1998;38:573-579. 23. Chudy M, Budek I, Keller-Stanislawski B, McCaustland KA, Neidhold S, Robertson BH, Nübling CM, Seitz R, Löwer J. A new cluster of hepatitis A infection in haemophiliacs traced to a contaminated plasma pool. Journal of Medical Virology 1999;57:91-99. 24. US Food and Drug Administration. Nucleic acid testing (NAT) to reduce the possible risk of parvovirus B19 transmission by plasma-derived products, Rockville, MD:FDA Center for Biologics Evaluation and Research 2008. FDA draft guidance for industry. 25. “OMCL Guideline for Validation for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT) for Quantitation of B19 Virus DNA in Plasma Pools” Strasbourg, France: European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare 2008. 26. Human plasma (pooled and treated for virus inactivation). Strasbourg, France: European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare 2009. Ph Eur monograph 1646. 27. Saldanha J, Lelie N, Yu M-Y, Heath A and the B19 Collaborative Study group. Establishment of the first World Health Organisation international standard for human parvovirus B19 DNA nucleic acid amplification techniques. Vox Sanguinis 2002;82:24-31. 28. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 1990; 93:125-128. 29. Savva R, McAuley-Hecht K, Brown T, Pearl L. The structural basis of specific base-excision repair by uracil-DNA glycosylase. Nature. 1995; 373:487-493. 30. Mol CD, Arvai AS, Slupphaug G, Kavli B, Krokan HE, Mosbaugh DW, Tainer JA. Crystal structure and mutational analysis of human uracil-DNA glycosylase: structural basis for specificity and catalysis. Cell. 1995; 80:869-878. 31. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (NY). 1992; 10:413-417. 32. Heid CA, Stevens J, Livak JK, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996; 6:986994. 33. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. (eds.). 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 34. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 35. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations. 41st ed. Quebec, Canada. 2000. 36. Saldanha J, Heath A, Lelie N, Pisani G, Yu M-Y, and the Collaborative Study Group. A World Health organisation international standard for hepatitis A virus RNA nucleic acid amplification technology assays. Vox Sanguinis 2005;89:52-58. 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 24 Informacje dotyczące wersji dokumentu Doc Rev. 2.0 07/2011 Uaktualniono rozdział INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA przez dołączenie informacji, że statywy SPU należy ładować do urządzenia COBAS® AmpliPrep w pozycjach: J, K lub L. Uaktualniono numery części dotyczące produktów dezynfekujących Hamilton. W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche. Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Członek Grupy Roche Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 68305 Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Distributed by Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273-3433) Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil ROCHE, COBAS, COBAS S, TAQMAN, TAQSCREEN, AMPLILINK, AMPERASE oraz AMPLIPREP są znakami towarowymi firmy Roche. ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche. Pozostałe nazwy produktów i znaki towarowe stanowią własność odnośnych właścicieli. Armored RNA jest nazwą opatentowanej technologii, opracowanej wspólnie przez firmę Ambion, Inc. oraz firmę Cenetron Diagnostics LLC. Produkt chroniony patentami zarejestrowanymi w USA pod numerami: 5,677,124, 5,919,625 oraz 5,939,262, a także patentami zgłoszonymi do rejestracji. ARMORED RNA jest znakiem towarowym należącym do firmy Ambion oraz firmy Cenetron. Barwniki cyjaninowe zawarte w produkcie są objęte prawami patentowymi firmy GE Healthcare Bio-Sciences Corp. oraz Carnegie Mellon University i udostępniane są firmie Roche na zasadzie licencji w celu ich włączenia do składników zestawów badawczych oraz zestawów do diagnostyki in vitro. Wszelkie wykorzystanie takich zestawów do celów innych niż badawcze lub związane z diagnostyką in vitro wymaga uzyskania podlicencji od firmy GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA, oraz Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pensylwania, USA. © 2011 Roche Molecular Systems, Inc. Wszelkie prawa zastrzeżone. 07/2011 Doc Rev. 2.0 (05509220001-02ENGL) 06362265049-02 06362265049-02PL Doc Rev. 2.0 25