RT31-020, RT31-100
Transkrypt
RT31-020, RT31-100
RT31-020, RT31-100 RT31-020, RT31-100 Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowa dzenia syntezy pierwszej nici cDNA na matrycy mRNA lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy cDNA nadaje się do stosowania w kolejnych etapach reakcji RT-PCR i/lub RT-qPCR. Zestaw TRANSCRIPTME RNA został opracowany w celu zapewnienia wysokiej wydajności syntezy cDNA oraz zwiększenia czułości reakcji RT-qPCR. Pozwala na syntezę cDNA w zakresie 10 pg – 5 µg matrycowego RNA. W skład zestawu wchodzi TRANSCRIPTME Enzyme Mix zawierający rekombinowaną termostabilną odwrotną transkryptazę M-MuLV (bez aktywności RNazy H) oraz inhibitor RNaz RIBOPROTECT; ponadto zoptymalizowany bufor reakcyjny zawierający mieszaninę starterów oligo(dT)18, random heksamerów X6, MgCl2 oraz mieszaninę dNTPs. Odwrotna transkryptaza TRANSCRIPTME charakteryzuje się podwyższoną termostabilnością, co umożliwia prowadzenie reakcji w wyższej temperaturze (optimum aktywności w temp. 50°C). Dzięki temu zwiększona zostaje wydajność i specyficzność transkrypcji regionów RNA z dużą zawartością par GC i/lub struktur drugorzędowych. Enzym nie posiada aktywności RNazy H i 3’5’ egzonukleazy, umożliwiając tworzenie produktów cDNA o długości powyżej 10 kb. Zastosowanie rekombinowanego inhibitora RNaz RIBOPROTECT zabezpiecza matrycowe RNA przed degradacją. Do zestawu dołączona jest również RNaza H, która służy do specyficznej degradacji RNA w hybrydach RNA:cDNA tworzonych po syntezie pierwszej nici cDNA. Ten opcjonalny etap może znacznie poprawić czułość reakcji RT-qPCR, poprzez zwiększenie dostępności miejsc wiązania się starterów do matrycy cDNA w reakcji PCR. Trawienie RNazą H jest zalecane w przypadku wysokich stężeń wyjściowego matrycowego RNA, a także układów PCR wrażliwych na obecność pozostałości RNA. DNA-Gdańsk | [email protected] | www.dnagdansk.com Właściwości i zalety pp Wysoka wydajność syntezy pełnej długości produktów cDNA (nawet >10 kb) pp Zwiększona czułość w reakcjach RT-qPCR i RT-PCR pp Zmniejszona do minimum ilość etapów pipetowania – obniżone ryzyko wprowadzenia kontaminacji pp Zestaw zawiera zarówno oligo(dT)18 jak i random heksamery X6, dzięki czemu możliwa jest jednoczesna synteza cDNA na matrycy mRNA oraz rRNA pp Materiał wyjściowy: 10 pg do 5 µg całkowitego RNA pp Optymalna temperatura reakcji: 50°C pp Odwrotna transkryptaza bez aktywności RNazy H oraz 3’5’ egzonukleazy o podwyższonej termostabilności, odpowiednia do amplifikacji trudnych matryc RNA pp Inhibitor RNaz zabezpiecza matrycowe RNA przed degradacją pp Dodatkowy etap trawienia RNazą H może znacznie poprawić czułość reakcji RT-qPCR w przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA po syntezie cDNA Zastosowania pp Synteza pierwszej nici cDNA w RT-PCR i RT-qPCR pp Konstrukcja bibliotek cDNA pp Analiza RNA RT31-020, RT31-100 Protokół syntezy pierwszej nici cDNA 1. Do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki typu Eppendorf umieszczonej w lodzie lub w statywie mrożeniowym należy dodać następujące składniki reakcji we wskazanej kolejności (dla większej ilości prób zaleca się przygo towanie Master Mix-u bez matrycowego RNA): Składnik Ilość 2x RT Master Mix 10 µl TRANSCRIPTME Enzyme Mix RNA woda wolna od nukleaz 2 µl ≤ 5 µg uzupełnić do 20 µl 2. Delikatnie wymieszać i inkubować w temp. 25°C przez 10 min. 3. Inkubować w temp. 50°C przez 30 min. 4. Inaktywować reakcję poprzez ogrzewanie w temp. 85°C przez 5 min., a następnie niezwłocznie schłodzić w lodzie. Opcjonalnie *: dodać 1 µl RNazy H i inkubować w temp. 37°C przez 20 min., a następnie inaktywować reakcję przez ogrzewanie w temp. 85°C przez 5 min. * Etap trawienia RNazą H może znacznie poprawić czułość reakcji RT-qPCR w przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA. 5. Produkt cDNA może być użyty bezpośrednio w reakcjach PCR lub qPCR (nierozcieńczony lub rozcieńczony w wodzie wolnej od nukleaz lub w TE), bądź przechowywany w temp. -20°C lub -70°C do czasu dalszych analiz. Praca z RNA Wysoka jakość nienaruszonego RNA, wolnego od pozostałości genomowego DNA i RNaz jest istotna do syntezy wysokiej jakości pełnej długości produktów cDNA oraz dokładnej analizy ilościowej RNA (qPCR). W związku z tym należy przestrzegać następujących zaleceń dotyczących pracy z RNA: pp Utrzymywać aseptyczne warunki pracy: używać jednorazowych rękawiczek i w miarę potrzeby często je zmieniać; używać probówek i tipsów wolnych od RNaz (RNase-free); wyznaczyć specjalny obszar i sprzęt do pracy tylko z RNA. pp DNaza I (brak w zestawie) może być zastosowana w celu wyeliminowania zanieczyszczeń genomowym DNA w wyjściowych preparatach RNA. pp Preparaty RNA powinny być przechowywane w temp. -70°C, najlepiej rozporcjowane. Należy unikać częstego rozmrażania/zamrażania próbek. Dodatkowe informacje pp Do izolacji całkowitego RNA z tkanek zwierzęcych lub linii komórkowych polecamy zestaw EXTRACTME TOTAL RNA (EM09) lub EXTRACTME TOTAL RNA PLUS (EM11). pp Wszystkie odczynniki zestawu TRANSCRIPTME RNA należy przechowywać w lodzie lub w statywie mrożeniowym podczas przygotowywania reakcji RT-PCR. pp Wszystkie odczynniki zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte w temp. -20°C lub -70°C. pp W przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA można poprawić czułość reakcji RT-PCR lub RT-qPCR poprzez przeprowadzenie trawienia RNazą H. pp Podczas przeprowadzania reakcji PCR lub qPCR na matrycy zsyntetyzowanego cDNA, należy użyć cDNA w ilości nie większej niż 1/10 końcowej objętości reakcji PCR, np. 2,5 µl cDNA w 25 µl reakcji PCR. pp Aktywność odwrotnej transkryptazy TRANSCRIPTME hamowana jest w obecności substancji chelatujących jony metali (np. EDTA), nieorganicznego fosforanu, pirofosforanu i poliamin. Kontrola jakości Preparat wolny od nukleaz oraz zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi. Produkt testowano w reakcjach odwrotnej transkrypcji, a następnie na otrzymanych matrycach cDNA przeprowadzono szereg reakcji PCR i qPCR. DNA-Gdańsk | [email protected] | www.dnagdansk.com Możliwe problemy i ich rozwiązywanie Problem Prawdopodowna przyczyna Rozwiązanie Brak lub niska wydajność syntezy cDNA RNA jest podegradowane Zalecane jest przechowywanie RNA w temp. -70°C. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek. Po rozmrożeniu próbka RNA powinna być niezwłocznie umieszczona w lodzie lub w statywie mrożeniowym. Należy sprawdzić jakość wyizolowanego RNA w żelu w warunkach denaturujących. Do reakcji użyto za mało RNA lub RNA o niskiej jakości Zwiększyć ilość RNA. Usunąć inhibitory reakcji (m.in. SDS, EDTA, fosforan sodu, spermidyna, sole guanidyny, formamid itd.) poprzez precypitację RNA, włączając etap płukania 70% etanolem. Próbka wyizolowanego RNA zawiera genomowe DNA Traktować zanieczyszczoną próbkę RNA DNazą I. Nieoczekiwane prążki podczas analizy elektroforetycznej amplifikowanych produktów RT31-020 20 reakcji RT31-100 100 reakcji RT31-S 3 reakcje TRANSCRIPTME Enzyme Mix (1) 40 µl 5 x 40 µl 7 µl 2x RT Master Mix 200 µl 5 x 200 µl 33 µl RNase H (E. coli) 20 µl 5 x 20 µl 4 µl Nuclease-free water 180 µl 5 x 180 µl 35 µl Zawartość (2) 1) Zawiera odwrotną transkryptazę TRANSCRIPTME oraz inhibitor RNaz RIBOPROTECT. 2) Zawiera bufor do RT-PCR, startery oligo(dT)18, random heksamery, MgCl2 oraz mieszaninę dNTPs. Przechowywanie i transport Warunki przechowywania Wszystkie elementy zestawu należy przechowywać w temp. -20°C. Trwałość może być przedłużona przy przechowywaniu zestawu w temp. -70°C. Warunki transportu Transport w warunkach chłodniczych. do badań naukowych Data zakupu DNA-Gdańsk [email protected] | www.dnagdansk.com Gwarancja 12 miesięcy od daty zakupu