ćwiczenie 1 - ATRINBIOTECH

„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
ĆWICZENIE 1
IZOLACJA BAKTERII Z GLEBY, RYZOSFERY I RYZOPLANU METALOFITÓW
ORAZ IZOLACJA BAKTERYJNEGO DNA
IZOLACJA BAKTERII ENDOFITYCZNYCH Z METALOFITÓW
CZĘŚĆ TEORETYCZNA
Metody badań i obserwacji mikroorganizmów
Metody izolacji bakterii z różnych środowisk naturalnych
Określanie liczby bakterii w badanym środowisku
Metody izolacji DNA z gleby
Endofity i ich rola w przyrodzie
Interakcje rośliny-endofity
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
1. Analiza mikrobiologiczna gleby pozakorzeniowej, ryzosferowej, ryzoplanu metalofitów.
Gleba pozakorzeniowa- oddalona od rośliny i nie pozostająca pod wpływem korzeni.
Gleba ryzosferowa- uzyskana przez oddzielenie gleby bezpośrednio przylegającej do
korzeni. Utrzymuje się w strefie korzeniowej po wyciągnięciu rośliny z gleby.
Ryzoplan- jest to powierzchnia korzeni na której występują bakterie.
a) Przygotować próbki gleb i ryzoplanu oraz roztwory glebowe.
W tym celu odważyć po 10 g gleby pozakorzeniowej, ryzosferowej i wsypać do dwóch
osobnych kolb zawierających 90 ml soli fizjologicznej z dodatkiem 0,1% Tween 80.
Całość wytrząsać kilka minut w celu wymycia mikroorganizmów z cząstek gleby.
Poczekać, aż cząstki stałe opadną na dno. Tak przygotowane roztwory glebowe to
rozcieńczenie 10-1.
Oznaczenie liczebności mikroorganizmów w rizoplanie metalofitów. Oddzielone
korzenie roślin przemyć jałową wodą destylowaną aby usunąć pozostałą glebę.
Oczyszczone korzenie pociąć sterylnym skalpelem na odcinki 1-2 cm długości, odważyć
2 g i przełożyć do kolby z 98 ml soli fizjologicznej z kulkami szklanymi. Całość
wytrząsać kilka minut. Jest to rozcieńczenie 10-1.
b) Przygotować kolejne rozcieńczenia roztworów glebowych (10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8,
10-9) i ryzoplanu (10-4, 10-5, 10-6). Wysiać z każdego rozcieńczenia po 0,1 ml zawiesiny
na płytki Petriego z agarem odżywczym, 1/10 agarem odżywczym, agarem odżywczym z
1 mM CdCl2 i rozprowadzić głaszczką po powierzchni tych podłoży.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
Schemat przygotowania rozcieńczeń
c) Zmierzyć suchą masę gleby pozaryzosferowej i ryzosferowej.
d) Inkubację wszystkich płytek przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
2. Izolacja bakterii endofitycznych z metalofitów.
a) Oddzielić od rośliny liście, łodygę i korzenie. Oczyścić części roślin i pociąć na
odcinki 1-2 cm długości. Każdy z organów włożyć do osobnej kolbki z 1% roztworem
Tween 80. Wytrząsać 20 min. Kolejne etapy przeprowadzić pod wcześniej
wysterylizowaną komorą laminarną. Z kolbki z Tweenem 80 wyciągnąć części roślin i
kolejno przeprowadzić powierzchniową sterylizację organów roślinnych zanurzając je w:
10% H2O2, 70% alkoholu, 5% ACE. Następnie w celu usunięcia środków
dezynfekcyjnych płukać trzykrotnie w sterylnej wodzie destylowanej. W moździerzu z 9
ml soli fizjologicznej zmacerować tkanki organów roślinnych.
b) Przygotować rozcieńczenia z maceratu roślinnego 10-2-10-4. Wykonać posiew 0,1 ml
otrzymanego rozcieńczenia na płytki Petriego z agarem odżywczym, 1/10 agarem
odżywczym, agarem odżywczym z 1 mM CdCl2 i rozprowadzić głaszczką po
powierzchni tych podłoży.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
c) Przeprowadzić kontrolę sterylizacji- wykonać posiew 0,1 ml wody z ostatniego
płukania każdego organu roślinnego na płytki Petriego z agarem odżywczym.
d) Inkubację wszystkich płytek przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
Schemat przeprowadzania powierzchniowej sterylizacji organów roślinnych
3. Izolacja bakteryjnego DNA z gleby pozakorzeniowej i ryzosferowej.
a) Izolację DNA przeprowadzić według instrukcji dołączonej do kitu.
b) Przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym w celu sprawdzenia ilości i jakości
wyizolowanego bakteryjnego DNA z gleby.
UWAGA!!! WSZYSTKIE PONIŻSZE CZYNNOŚCI PRZEPROWADZIĆ W
RĘKAWICZKACH!!! PRACA Z MUTAGENNYM ZWIĄZKIEM- BROMKIEM
ETYDYNY!!!
Przygotować 0,8% żel agarozowy. Odważyć 0,28 g agarozy i dodać do 35 ml buforu 1x
TAE. Agarozę rozpuścić w mikrofalówce. Do ochłodzonego roztworu agarozy dodać 0,2
µl bromeku etydyny. Wymieszać i ostrożnie wylać na złożone wcześniej małe sanki.
Zostawić do zestalenia. Zestalony żel przełożyć do aparatu do elektroforezy tak aby
wszystkie kieszonki zostały zalane buforem. Przygotować próbki do nałożenia poprzez
zmieszanie ich z barwnikiem obciążającym 6x Loading dye (obliczyć objętość barwnika
jaką należy dodać aby jego stężenie wynosiło 1x). Do kieszonek nanieść kolejno: marker
1 kb DNA Ladder, wyizolowane DNA, marker λDNA/Hind III. Warunki elektroforezy:
80V, 35 min. Po tym czasie wykonać zdjęcie żelu. Przeprowadzić analizę otrzymanych
wyników.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego