Część III

Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
Biofizyka II
przedmiot obieralny
Materiały pomocnicze do wykładów
prof. dr hab. inż. Jan Mazerski
CZĘŚĆ III: OPIS ODDZIAŁYWAŃ MIĘDZYCZĄSTECZKOWYCH
Układy biologiczne zbudowane są na poziomie molekularnym z trwałych cząsteczek o
zdefiniowanej
strukturze
i
jednoznacznie
określonych
właściwościach
chemicznych
i
fizykochemicznych (białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy itp.). Za ich stabilność odpowiedzialne
są przede wszystkim wiązania kowalencyjne. Jednakże na poziomie funkcjonalnym cząsteczki te
musza mieć zdolność do dynamicznego, odwracalnego łączenia się i rozdzielania. Za dynamikę
układów biologicznych odpowiedzialne są więc dużo słabsze i odwracalne w warunkach
fizjologicznych oddziaływania niekowalencyjne (fizykochemiczne). Zapewniają one plastyczność
układu, czyli umożliwiają dopasowanie się układu do zmiennych warunków zewnętrznych bez zmiany
natury układu.
Kompleksy międzycząsteczkowe powstają samorzutnie, a więc towarzyszyć im musi spadek entalpii
swobodnej (funkcji Gibbsa) układu:
G = H -TS
Spadek ten wynikać może z obniżenia się entalpii, H, i mówimy wtedy, że za powstawanie kompleksu
odpowiedzialny jest czynnik energetyczny. Jednakże może wynikać także ze wzrostu entropii, S,
układu, czyli być wynikiem działania czynnika entropowego. Znane są również kompleksy
międzycząsteczkowe, których powstaniu towarzyszy zarówno zmiana entalpii jak i entropii układu. W
takim przypadku wymagane jest jedynie, aby łączny efekt tych zmian prowadził do obniżenia entalpii
swobodnej.
Z wpływem czynnika energetycznego mamy do czynienia, gdy powstawaniu kompleksu
towarzyszy wystąpienie oddziaływań fizykochemicznych nie występujących w przypadku
izolowanych składników. W zależności od budowy chemicznej składników oddziaływaniami tymi
mogą być:
•
wiązania wodorowe,
•
oddziaływania dyspersyjne (Van der Waalsa), lub
•
oddziaływania elektrostatyczne.
Zwykle mamy do czynienia z wszystkimi tymi oddziaływaniami jednocześnie.
Jest charakterystyczne, że na powyższej liście oddziaływań nie ma oddziaływań hydrofobowych.
Wynika to z ich odmiennej natury – oddziaływania hydrofobowe są wynikiem działania czynnika
entropowego a nie energetycznego.
1
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
3.1 Pojęcie mikrostanu układu
Proces powstawania kompleksu molekularnego rozpatrywać można z wielu różnych stron, np.
w aspekcie prawa działania mas. Rozważmy przykładowo proste zjawisko dimeryzacji związku A:
A + A = 2A ⇔ D
Z prawa działania mas wynika, że istnieje określona relacja pomiędzy stężeniem związku A i
stężeniem jego dimeru D:
K=
[D]
[A]2
W danej temperaturze wielkość K jest stała i nosi nazwę stałej równowagi procesu, w tym przypadku
stałej procesu dimeryzacji, lub krócej stałej dimeryzacji. Na uwagę zasługuje przy tym fakt, że istotne
jest jednoznaczne określenie kierunku przebiegu procesu.
Rozpad kompleksu
Tworzenie kompleksu
A+A⇒D
D⇒A+A
[D]
[A]2
[A]
1
=
Stała dysocjacji: K D =
[D]
KA
Stała równowagi procesu powiązana jest ze zmianą entalpii swobodnej procesu zależnością:
Stała asocjacji: K A =
2
∆G 0 = −RT ln K
gdzie: ∆G 0 jest zmianą standardowej entalpii swobodnej.
Co kryje się pod tą nazwą? Zmiana standardowej entalpii swobodnej procesu dotyczy sytuacji gdy
stężenia wszystkich indywiduów biorących udział w procesie są sobie równe i wynoszą 1 mol/l. Jeżeli
proces, np. dimeryzacji, przebiega przy innych stężeniach to obowiązuje bardziej rozbudowany wzór:
∆G = −RT ln K + RT ln
[D]
[A]2
Z powyższego wzoru wynika, że zmiana entalpii swobodnej procesu zależy od 2 czynników:
1. zmiany standardowej entalpii swobodnej która jest charakterystyczna dla danego procesu
2. rzeczywistych warunków przebiegu procesu, a w szczególności od stężeń indywiduów
chemicznych biorących udział w procesie.
Należy w tym miejscu wyraźnie podkreślić, że o kierunku przebiegu procesu decyduje zmiana
aktualnej, a nie standardowej entalpii swobodnej.
))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))
Przykład 1:
Chcemy opisać zjawisko dysocjacji kwasu octowego
AcH ⇐⇒ Ac- + H+
z wykorzystaniem pojęcia zmiany entalpii swobodnej.
Standardowa zmiana entalpii swobodnej dysocjacji kwasu octowego wynosi ∆G0 = +28,14 kJ/mol. Interesuje
nas zachowanie się cząsteczek kwasu octowego w stężeniu 0,001 mol/L. Stopień dysocjacji kwasu octowego
2
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
wynosi przy takim stężeniu α = 0,15. Oznacza to, że stężenie formy zdysocjowanej [Ac-] i formy
niezdysocjowanej [AcH] wynosi odpowiednio: 1,5*10-4 i 8,5*10-4 mola/L.
Spróbujmy określić kierunek przebiegu dysocjacji przy dwóch wartościach pH:
a) pH = 3
b) pH = 7
Ad a) [H+] = 1*10-3 mola/L
Ac− H +
1,5 ⋅10 −4 ⋅1 ⋅10 −3
∆G = ∆G 0 + RT ln
= 28,14 + 2,569 ln
= +5,94
[AcH]
8,5 ⋅10 −4
Dodatnia wartość ∆G wskazuje, że reakcja przebiegać będzie od strony prawej do lewej, czyli wzrośnie stężenie
formy niezdysocjowanej.
Ad b) [H+] = 1*10-7 mola/L
Ac− H +
1,5 ⋅10 −4 ⋅1 ⋅10 −7
∆G = ∆G 0 + RT ln
= 28,14 + 2,569 ln
= −17,72
[AcH]
8,5 ⋅10 −4
Zdecydowanie ujemna wartość ∆G wskazuje, że w środowisku obojetnym reakcja przebiegać będzie od strony
lewej prawej do prawej, czyli wzrośnie stężenie formy zdysocjowanej.
((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((
[ ][ ]
[ ][ ]
Omawiana powyżej stała równowagi procesu dotyczy tzw. makroskopowego opisu układu. W
zagadnieniach biofizycznych posługujemy się często innym, tzw. mikroskopowym opisem układu.
Rozróżniamy też odpowiednio makro- i mikro- stany układu. Czym się różnią te dwa opisy?
W opisie makroskopowym posługujemy się wyłącznie wielkościami które można wyznaczyć
doświadczalnie dysponując mierzalnymi właściwościami układu. W opisie mikroskopowym
rozważamy pewne teoretyczne stany układu zdając sobie doskonale sprawę, że nigdy nie będziemy ich
w stanie zaobserwować. Opis mikroskopowy jest więc z założenia modelem teoretycznym. Jego
poprawność możemy ocenić dopiero po zamianie parametrów mikroskopowych na makroskopowe.
Zdaję sobie sprawę, że powyższe wyjaśnienia właściwie niczego nie wyjaśniają. Dlatego też
rozważmy pewien prosty przykład.
))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))
Przykład 2:
Chcemy opisać zjawisko dysocjacji kwasu dwukarboksylowego na poziomie makro- i mikroskopowym.
Opis makroskopowy
Proces dysocjacji takiego kwasu obejmuje dwa etapy:
H2A ⇔ H+ + (HA)(HA)- ⇔ H+ + A-2
i odpowiadają im dwie stałe dysocjacji:
[(HA) ][H ]
=
−
K1
+
K2 =
[H 2 A]
[A ][H ]
[(HA) ]
2−
+
−
Opis mikroskopowy
Załóżmy, że potrafimy odróżnić obie grupy karboksylowe i że dysocjują one niezależnie od siebie. Przy
czym każdy akt dysocjacji ma taką samą mikroskopową stałą dysocjacji. Zgodnie z takim opisem proces
dysocjacji kwasu dwukarboksylowego można przedstawić następującym układem równań:
HAH ⇔ H+ + -AH
HAH ⇔ HA- + H+
AH ⇔ A2- + H+
HA- ⇔ H+ + A2Odpowiadają im odpowiednie stałe dysocjacji:
[ AH][H ]
=>
[HA ][H ]
k=
=>
k=
−
+
[HAH]
−
+
[HAH]
[
−
]
AH = k
[HAH]
[H ]
+
]
[HA ] = k [HAH
[H ]
−
+
=>
[-AH] = [HA-]
3
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
[(HA)-] = [-AH] + [HA-]
[A ][H ]
[ AH]
[A ][H ]
k=
[HA ]
k=
2−
+
=>
−
2−
+
=>
−
=>
[(HA) ] = 2k [H[H A]]
−
2
+
[A ] = k [[HAH]]
] = 1 k [(HA) ]
[A ] = k [HA
[H ] 2 [H ]
2−
−
+
−
−
2−
+
+
Podstawiając wyprowadzone zależności do wzorów na makroskopowe stałe dysocjacji otrzymujemy:
2k
K1 =
K2 =
[H 2 A] [H + ]
[H ]
+
= 2k
[H 2 A]
1 [(HA )− ] +
[H ]
k
2
[H ]
+
[(HA) ]
−
=
1
k
2
Okazuje się ponadto, że przy poczynionych założeniach stosunek obu stałych dysocjacji powinien być
stały:
K1
=4
K2
W praktycznych obliczeniach często zamiast stałymi dysocjacji posługujemy się ich formą
zlogarytmowaną:
pKa1 – pKa2 = log4 ≈ 0,6
((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((
Oczywiście, w przypadku rzeczywistych kwasów dwukarboksylowych różnice pomiędzy wartościami
pKa dla obydwu stopni dysocjacji mogą być bardzo różne. W seriach homologicznych obserwuje się
jednak charakterystyczne tendencje. I tak dla alifatycznych kwasów z grupami karboksylowymi na
krańcach prostego łańcucha otrzymujemy szereg:
Kwas
szczawiowy
malonowy
bursztynowy
glutarowy
adypinowy
pimelinowy
korkowy
kamforowy
n
0
1
2
3
4
5
6
X
pKa1
1,27
2,86
4,21
4,34
4,42
4,51
4,52
4,57
∆pKa
3,00
2,83
1,43
0,93
0,86
0,80
0,83
0,53
pKa2
4,27
5,69
5,64
5,27
5,28
5,31
5,35
5,10
6.00
Występujące
tendencje
widać
szczególnie
wyraźnie
na
pKa1
5.00
zamieszczonym obok wykresie. Gdy odległość pomiędzy grupami
karboksylowymi jest nieduża dysocjacja jednej z nich wpływa
niekorzystnie na możliwość dysocjacji drugiej - ∆pK ok. 3 !
Jednakże gdy grupy są oddzielone dwiema, a zwłaszcza 3 lub
więcej grupami metylenowymi różnica pKa zdecydowanie maleje i
stabilizuje się na wartości ok. 0,8 jednostki. Jest to jednak wartość
a2
4.00
3.00
2.00
∆
1.00
0.00
0
1
2
3
4
Liczba grup metylenowych
5
6
4
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
zdecydowanie większa niż przewidywana dla w pełni niezależnych grup karboksylowych.
Wysunięto hipotezę, że wynika to z labilności konformacyjnej łańcucha alifatycznego: łańcuch
zawierający 3 lub więcej grup metylenowych może występować w konformacji zwiniętej pozwalającej
na wpływ jednej grupy karboksylowej na drugą. Aby potwierdzić tą hipotezę należało znaleźć kwas
dwukarboksylowy w którym oddziaływanie grup na siebie byłoby praktycznie niemożliwe. Sytuacja
taka występuje np. w terpenach posiadających sztywny, mostkowany i niearomatyczny układ
pierścieni. I tak dla kwasu kamforowego, ostatni wiersz powyższej tabeli, różnica pKa wynosi 0,53, co
mieści się już w granicach błędu.
3.2 Agregacja
Dla
niektórych
związków
liczne
wielkości
A
fizykochemiczne zależą w charakterystyczny sposób od
stężenia roztworu. Istnieją dwie formy zależności
wskazujące, że w roztworze dochodzi do agregacji.
W pierwszym przypadku mierzalna właściwość roztworu
(lepkość,
napięcie
powierzchniowe,
współczynnik
załamania światła, absorbancja, itp.) zmienia się liniowo
wraz ze wzrostem stężenia, aż do pewnego stężenia
krytycznego, a następnie praktycznie przestaje zależeć od
c
A
stężenia. Taka forma zależności wskazuje, że mierzalna
wielkość, A, zależy od stężenia formy monomerycznej
związku, a dla formy lub form zagregowanych ma
wartość dużo mniejszą niż dla formy monomerycznej.
W drugim przypadku, dla niskich stężeń związku
c
wielkość A jest prawie niemierzalna i pojawia się dopiero
po przekroczeniu pewnego stężenia, a następnie wzrasta liniowo ze wzrostem stężenia. Wskazuje to,
że mierzona wielkość związana jest z formą zagregowaną i nie występuje w przypadku formy
monomerycznej.
W niniejszym rozdziale przedstawimy typowe modele stosowane do opisu zjawiska agregacji
oraz pokażemy jak modele takie powstają.
3.2.1 Jak opisać agregację
Zanim omówimy wybrane modele agregacji warto przedstawić podstawowe wielkości
związane z tym procesem. Najczęściej przyjmujemy, że badany związek występuje co najmniej w
dwóch formach: jako monomer, M, i jedna lub kilka form zagregowanych. Symbolem Ai oznaczać
będziemy formę zagregowana składającą się z i cząsteczek monomeru. Ogólne stężenie związku w
badanym roztworze równe jest c moli/litr. Dla uproszczenia w zapisie stężeń poszczególnych form
5
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
pominiemy nawiasy kwadratowe. Tak więc symbol Ai raz oznaczać będzie i-tą formę zagregowaną (w
równaniach reakcji), a innym razem jej stężenie. Nie powinno to jednak nastręczać kłopotów, gdyż
rodzaj równania jednoznacznie określa czy mówimy o formie czy o jej stężeniu.
Opisując skład roztworu można poddać bilansowaniu dwie rzeczy:
•
liczbę moli badanego związku niezależnie w jakiej formie występuje, czyli rozpatrywać tzw.
bilans cząsteczkowy
n
c = M + 2A2 + 3A3 + ... + nAn = M +
∑ iA
i =2
•
i
liczbę moli poszczególnych form w jakich dany związek występuje, czyli rozpatrywać tzw.
bilans molowy
n
z = M + A2 + A3 + ... + An = M +
∑A
i =2
i
Wielkość z nazywamy funkcją podziału. Pomiędzy stężeniem, c, a funkcją podziału, z, istnieje bardzo
użyteczna zależność:
∂z
c=M
∂M
Stosunek stężenia, c, do funkcji podziału, z, nosi nazwę średniego stopnia agregacji, ν:
n
ν=
c
=
z
M + ∑ iA i
i=2
n
M + ∑ iA i
i=2
W typowych doświadczalnych badaniach zjawiska agregacji znamy ogólne stężenie związku
oraz zwykle stężenie formy monomerycznej, M. Kolejnym krokiem jest stworzenie teoretycznego
modelu procesu, co pozwala wyrazić stężenie poszczególnych form zagregowanych jako funkcję
stężenia formy monomerycznej oraz stałych równowagi opisujących poszczególne etapy procesu.
Porównanie danych eksperymentalnych z wnioskami wynikającymi z modelu pozwala na jego
weryfikację.
3.2.2 Dimeryzacja
Najprostszym przypadkiem agregacji jest dimeryzacja. Równanie procesu wygląda
następująco:
2M ⇔ D
Stan równowagi tego procesu opisuje stała dimeryzacji, KD:
KD =
D
.
M2
Stężenie dimeru daje się opisać zależnością:
D = K DM2 .
Możemy teraz wykonać bilans molowy:
6
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
z = M + D = M + K D M 2 = M (1 + K D M )
i cząsteczkowy:
c = M + 2D = M + 2K D M 2 = M (1 + 2K D M ) ,
aby ostatecznie wyznaczyć średni stopień agregacji:
ν=
K DM
c M (1 + 2K D M ) 1 + 2K D M 1 + K D M + K D M
=
=
=
= 1+
z M(1 + K D M ) 1 + K D M
1+ K DM
1+ K DM
Dla niskich stężeń, gdy iloczyn KDM << 1, wartość ν jest tylko
2
niewiele większa od 1. Z kolei dla dostatecznie dużych stężeń, gdy
1.8
iloczyn KDM >> 1, średni stopień agregacji będzie asymptotycznie
ν
dążył do 2. Wyniki przedstawia się zwykle na wykresie na którym ν
1.6
1.4
jest funkcją logarytmu ogólnego stężenia lub logarytmu stężenia formy
1.2
monomerycznej. Wykres taki pozwala oszacować, czy w procesie
1
agregacji mamy do czynienia tylko z tworzeniem dimerów, czy też
-8
-6
-4
logC
pojawiają się znaczące ilości agregatów wyższych rzędów.
Do oceny stopnia agregacji w funkcji stężenia można również wykorzystać odpowiednio
przekształcony bilans cząsteczkowy:
c = M + 2K D M 2 ,
zakładając, że znamy ogólne stężenie c i potrafimy wyznaczyć stężenie formy monomerycznej M.
Teraz przenosimy stężenie M na stronę lewą:
1.2E-5
c − M = 2K D M 2 .
Jeżeli na wykresie (c-M) w funkcji M2 otrzymamy linię
C-M
prostą przechodzącą przez początek układu, to wykażemy
8E-6
tym samym, że agregacja ogranicza się do dimeryzacji ze
4E-6
stałą KD równą połowie tangensa kąta nachyleniu tej prostej.
Wykres tego typu jest jednak bardzo wrażliwy na
0
błędy pomiarowe kilku ostatnich punktów, które decydują o
0
Wróćmy
ponownie
do
równania
4E-13
6E-13
M^2
nachyleniu prostej. Dlatego zaproponowano również inny typ
wykresu.
2E-13
-4
bilansu
cząsteczkowego, ale w postaci iloczynowej:
i zlogarytmujmy to równanie:
log c = log M + log(1 + 2K D M )
-6
logC
c = M(1 + 2K D M )
-8
Wykonajmy teraz wykres logc w funkcji logM (linia
czerwona).
-8
-6
logM
-4
7
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
Dla 2KDM << 1 możemy przyjąć, że log(1 + 2K D M ) jest w przybliżeniu równy log(1) czyli 0. Tak
więc dla małych stężeń powinniśmy otrzymać linię prostą log c = log M o nachyleniu równym 1
(zielona prosta).
Dla 2KDM >> 1 możemy z kolei przyjąć, że log(1 + 2K D M ) jest w przybliżeniu równy log(2KDM),
czyli:
log c = log M + log(1 + 2K D M ) ≈ log M + log(2K D ) + log M = 2 log M + log(2K D ) .
W efekcie otrzymujemy równanie linii prostej o nachyleniu równym 2 i wyrazie wolnym log(2KD),
linia niebieska.
3.2.3 Trimeryzacja
wersja jednoetapowa
3.00
Naszą analizę rozpoczniemy od bardzo prostego,
chociaż
niezbyt
realistycznego
modelu
trimeryzacji.
procesem
jednoetapowym:
trzy
cząsteczki
monomeru
ν
Przyjmiemy mianowicie, że tworzenie się trimeru jest
2.00
spotykają się i łącza w nową formę - trimer. Można to wyrazić
równaniem:
3M = T
1.00
Proces przebiega ze stałą równowagi KT równą:
KT =
-8.00
-4.00
log M
T
M3
Możemy wyznaczyć stężenie trimeru jako:
T = K TM3 ,
co pozwala napisać bilans cząsteczkowy:
(
c = M + 3T = M + 3K T M 3 = M 1 + 3K T M 2
)
i molowy:
(
z = M + T = M + K TM3 = M 1+ K TM 2
)
oraz wyznaczyć średni stopień agregacji:
ν=
(
(
)
)
2K T M 2
c M 1 + 3K T M 2 1 + 3K T M 2 1 + K T M 2 + 2K T M 2
=
=
=
=
1
+
z M 1+ KTM2
1+ KTM2
1+ KTM2
1+ KTM2
Korzystając z bilansu cząsteczkowego:
(
c = M 1 + 3K T M 2
)
można otrzymać zależność:
(
)
log c = log M + log 1 + 3K T M 2 .
Analogicznie jak dla dimeryzacji rozpatrzmy 2 przypadki graniczne:
8
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
(
Dla KTM << 1 możemy przyjąć, że log 1 + 3K T M 2
)
jest w
logC = 3*logM + 14.48
przybliżeniu równy log(1) czyli 0. Tak więc dla małych stężeń
-4.00
log C
powinniśmy otrzymać linię prostą log c = log M o nachyleniu
równym 1 (zielona prosta).
(
)
logC = logM
-8.00
Dla KTM >> 1 możemy z kolei przyjąć, że log 1 + 3K T M 2 jest
w przybliżeniu równy log(3KTM2), czyli:
-10.00
-8.00
-6.00
-4.00
log M
(
)
log c = log M + log 1 + 3K T M 2 ≈ log M + log(3K T ) + 2 log M = 3 log M + log(3K T ) .
W efekcie otrzymujemy równanie linii prostej o nachyleniu równym 3 i wyrazie wolnym log(3KT),
linia niebieska.
wersja dwuetapowa
Jednoczesne spotkanie się 3 cząsteczek, czyli tzw. zderzenie trójcentrowe, jest z punktu
widzenia termodynamiki statystycznej zdarzeniem bardzo mało prawdopodobnym. Dużo bardziej
prawdopodobny jest ciąg zdarzeń polegający na utworzeniu najpierw dimeru, a w kolejnym etapie
utworzenia trimeru na skutek przyłączenia kolejnej cząsteczki monomeru:
⎧ 2M = D
⎨
⎩M + D = T
W przypadku ogólnym w procesie tym występują dwie stałe równowagi: stała dimeryzacji KD
(pierwsze równanie) i stała przyłączenia monomeru KM (drugie równanie). Zwykle jednak zakłada się,
że stałe te są sobie równe i traktuje się je jako stałe agregacji KA. Stężenie dimeru można wtedy
wyrazić jako:
3.00
D = KAM2 ,
M+T
a stężenie trimeru jako:
ν
T = K A MD = K 2A M 3
2.00
Można teraz wyznaczyć ogólne stężenie związku:
c = M + 2 D + 3T = M + 2 K A M
2
oraz funkcję podziału:
z = M + D + T = M + KAM
M+D+T
+ 3K 2A M 3
1.00
2
+ K 2A M 3 ,
-9.00
-8.00
-7.00
-6.00
log M
co pozwala obliczyć średni stopień agregacji:
ν=
M + 2 K A M 2 + 3K 2A M 3
M + K A M 2 + K 2A M 3
=
1 + 2 K A M + 3K 2A M 2
1 + K A M + K 2A M 2
9
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
Na wykresie powyżej przedstawiono przebieg zmian średniego stopnia agregacji dla obu modeli
trimeryzacji. Widać, że w przypadku modelu dwuetapowego (linia czerwona) średni stopień agregacji
rośnie wolniej niż w przypadku modelu jednoetapowego (linia purpurowa).
Rozważmy teraz czego można oczekiwać na wykresie logc = f(logM):
log c = log M + log(1 + 2 K A M + 3K 2A M 2 )
(
)
Dla KAM << 1 możemy przyjąć, że log 1 + 2 K A M + 3K A M 2 jest w przybliżeniu równy log(1) czyli
0. Tak więc dla małych stężeń powinniśmy otrzymać linię prostą log c = log M o nachyleniu
równym 1.
(
Dla KAM >> 1 możemy z kolei przyjąć, że log 1 + 2 K A M + 3K A M 2
log(3KAM2), czyli:
(
) jest w przybliżeniu równy
)
log c = log M + log 1 + 3K A M 2 ≈
-4.00
Tak więc otrzymujemy równanie linii prostej o nachyleniu równym 3 i
wyrazie wolnym log(3KA). Na wykresie obok przedstawiono przebieg
log C
≈ log M + log(3K A ) + 2 log M = 3 log M + log(3K A )
-6.00
zależności dla obydwu modeli trimeryzacji. Widać wyraźnie, że dla
dużych stężeń obie linie biegną równolegle, czyli mają jednakowe
-8.00
nachylenie.
3.2.4 Agregacja nieograniczona
-8.00
-6.00
log M
W wielu przypadkach proces agregacji nie zatrzymuje się na etapie małych agregatów
(dimerów, trimerów, itp.) lecz tworzy się całe spektrum agregatów. Opis matematyczny takiego
procesu jest trochę bardziej skomplikowany, ale możliwy do przeprowadzenia. W literaturze znaleźć
można wiele szczegółowych modeli matematycznych. Poniżej przedstawię 3 typowe przykłady takich
modeli.
wersja etapowa
Najprostszy model nieograniczonej agregacji zakłada etapowy przebieg tego procesu. Jeżeli
ponadto przyjmiemy, że stałe agregacji na każdym etapie są takie same, to otrzymamy model:
M + M = D = A2
M + A2 = T = A3
M + A3 = A4
M
M + A n −1 = A n
M
A2 = K A M 2
A 3 = K A A 2 M = K 2A M 3
A 4 = K A A 3 M = K 3A M 4
M
A n = K nA−1M n
M
Możemy teraz określić bilans cząsteczkowy:
10
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
c = M + 2 K A M 2 + 3K 2A M 3 + L + nK nA−1M n + L
i molowy:
z = M + K A M 2 + K 2A M 3 + L + K nA−1M n + L
Należy zauważyć, że są to wyrażenia o nieskończonej liczbie składników i wyznaczenie ich sumy,
zwłaszcza w przypadku bilansu cząsteczkowego nie jest proste. Na szczęście w przypadku bilansu
molowego mamy do czynienia z szeregiem geometrycznym o ilorazie q = KAM. Jak wiadomo, suma
nieskończonego szeregu geometrycznego dana jest wzorem:
S∞ =
a1
1− q
.
W naszym przypadku a1 = M, a więc:
z=
M
.
1− KAM
Suma ta ma skończoną wartość tylko wtedy, gdy |q| < 1. Tak więc pojawia się nowa, ciekawa
zależność:
KAM < 1
M<
==>
1
KA
mówiąca, że stężenie monomeru w układzie nie rośnie nieograniczenie jak
45.0
w przypadku dimeryzacji czy trimeryzacji, lecz istnieje pewna graniczna
40.0
wartość równa 1/KA, którą oznacza się symbolem MMC (ang. Maximal
35.0
Monomer Concentration).
30.0
Pozostaje jeszcze problem wyznaczenia bilansu cząsteczkowego. Najłatwiej
całkowitym c i funkcją podziału z:
c=M
ν
to zrobić korzystając z podanej wcześniej zależności pomiędzy stężeniem
25.0
20.0
15.0
∂z
.
∂M
10.0
5.0
W naszym przypadku daje to:
0.0
-9.0 -8.0 -7.0 -6.0
c=M
(
)
(
)
)
logM
⎞
11− KAM − M − KA
1− KAM + KAM
M
M
∂ ⎛⎜
⎟=M
=
M
=
2
2
⎟
⎜
∂M ⎝ 1 − K A M ⎠
1− KAM
1− KAM
1− KAM
(
(
)
(
)2
Tak więc średni stopień agregacji dany jest wzorem:
c M 1− KAM
1
ν= =
=
2
z 1− K M M 1− KAM
(
(
A
)
)
Warto zwrócić uwagę, że w miarę jak stężenie monomeru M zbliża się do wartość granicznej
MMC = 1/KA wartość mianownika dąży do 0, co oznacza, że średni stopień agregacji dąży do
nieskończoności.
11
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
-3.0
logc od logM: występuje wyraźna asymptota pionowa umożliwiająca
-4.0
łatwe wyznaczenie logMMC (rysunek obok).
-5.0
logC
Istnienie MMC odbija się również na kształcie zależności
wersja dwuetapowa
-6.0
Nie zawsze założenie o jednakowych wartościach stałych
-7.0
agregacji jest prawdziwe. Zwłaszcza w układach biologicznych
-8.0
obserwuje się układy w których stała równowagi pierwszego etapu
-9.0
logC = logM
log(MMC)
-9.0 -8.0 -7.0 -6.0
(dimeryzacji) jest dużo większa niż następne. Zmienia się wtedy
logM
również charakter następnych etapów agregacji: agregują już nie pojedyncze cząsteczki (monomery),
lecz dimery.
Poniżej przedstawiono model takiego procesu:
M+M=D
D + D = A2
D + A2 = A3
M
D + A n −1 = A n
M
D = KDM2
A 2 = K A D 2 = K A K 2D M 4
A 3 = K A A 2 D = K 2A K 3D M 6
M
A n = K nA−1K nD M 2 n
M
Funkcja podziału tego modelu ma postać:
z = M + D + A2 + A3 + L + A n + L =
= M + K D M 2 + K A K 2D M 4 + K 2A K 3D M 6 + L + K nA−1K nD M 2 n + L
W powyższym wyrażeniu możemy zaobserwować, że poczynając od drugiego wyrazu mamy do
czynienia z szeregiem geometrycznym o a1 = KDM2 i ilorazie q = KAKDM2. A więc:
z=M+
KDM2
1− KAKDM
-3.0
2
-4.0
Tym samym całkowite stężenie związku można przedstawić jako:
2K D M 2
∂z
=M+
∂M
1− KAKDM2
(
)
2
logC
c=M
-5.0
-6.0
-7.0
Podobnie jak w przypadku nieograniczonej agregacji etapowej
-8.0
również przy agregacji dimerów pojawia się wielkość MMC
-9.0
wynikająca z warunku skończonej sumy szeregu geometrycznego.
logC = logM
log(MMC)
-9.0 -8.0 -7.0 -6.0
logM
Tym razem wynosi ona:
MMC =
1
KAKD
12
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
O ile wyznaczenie wartości MMC z powyższego wykresu nie nastręcza trudności, o tyle oszacowanie
wartości stałych KD i KA nie jest już możliwe na drodze graficznej i wymaga zastosowania
numerycznego dopasowywania krzywej do danych doświadczalnych.
3.2.5 Agregacja micellarna
Od szeregu lat dla związków powierzchniowoczynnych stosuje się specyficzny model agregacji
zwany agregacja micellarną. Jest to model jednoetapowy zakładający, że n cząsteczek monomeru
tworzy agregat zwany micellą:
nM = A
ze stałą agregacji K nA . Stężenie micelli można wtedy okreslić z zależnosci:
A = K nA M n .
Funkcja podziału przyjmuje w tym modelu postać:
z = M + A = M + K nA M n ,
-3.0
a całkowite stężenie związku wynosi:
c = M + nA =
-4.0
M + nK nA M n .
-5.0
(
logC
Po zlogarytmowaniu tej zależności otrzymujemy:
)
log c = log M + log 1 + nK nA M n −1 .
(
Dla KAM << 1 możemy przyjąć, że log 1 + nK nA M n −1
)
-6.0
-7.0
-8.0
jest w
-9.0
przybliżeniu równy log(1) czyli 0. Tak więc dla małych stężeń
logCMC
-10.0
powinniśmy otrzymać linię prostą log c = log M o nachyleniu
-10.0 -9.0
-8.0
-7.0
-6.0
logM
równym 1.
(
)
Dla KAM >> 1 możemy z kolei przyjąć, że log 1 + nK nA M n −1 jest w
(
)
przybliżeniu równy log nK nA M n −1 , czyli:
-3.0
log c = log M + log 1 + nK nA M n −1 ≈
-4.0
≈ log M + log(nK nA ) + (n − 1)log M = n log M + log n + n log(K A )
-5.0
)
Tak więc otrzymujemy równanie linii prostej o nachyleniu równym n.
Na wykresie powyżej przedstawiono przebieg zależności dla tego
Asocjacja dimer w
Asocjacja etapowa
logC
(
-6.0
-7.0
modeli agregacji. Przedłużenie stycznej do wykresu wyznacza na osi
poziomej wielkość CMC (ang. Critical Micellar Concentration).
Asocjacja micellarna
-8.0
-9.0
-9.0
Należy w tym miejscu wyraźnie powiedzieć, że jednoznaczne
-8.0
logM
-7.0
-6.0
odróżnienie agregacji micellarnej dla n większego niż kilkanaście od obu powyższych modeli
13
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
agregacji nieograniczonej jest w zasadzie niemożliwe. Wynika to po pierwsze z faktu występowania
nieuniknionych błędów pomiarowych. Po drugie, należy pamiętać, że wszystkie 3 modele są tylko
przybliżonymi modelami rzeczywistego procesu agregacji w którym upraszczające założenia
poczynione przy konstruowaniu modeli nie muszą być spełnione.
3.3 Oddziaływanie małocząsteczkowego ligandu z biopolimerem
W badaniach biofizycznych spotykamy się często z zagadnieniem oddziaływania
małocząsteczkowych ligandów z biopolimerem, np. białkiem. Do opisu takiego oddziaływania modele
wyprowadzone na gruncie chemii ogólnej nie znajdują zwykle zastosowania.
Załóżmy, że w badanym układzie znajduje się makrocząsteczka M posiadająca n miejsc
wiążących ligand. Na gruncie makroskopowym zachodzące procesy możemy wtedy opisać
zależnością:
⎧ M1 ⇔ M 0 + L
⎪M ⇔ M + L
1
⎪⎪ 2
⎨M 3 ⇔ M 2 + L
⎪M
⎪
⎪⎩M n ⇔ M n −1 + L
Przy tworzeniu modelu takiego oddziaływania znamy ogólne stężenie biopolimeru M oraz ogólne
stężenie ligandu c. Zakładamy zwykle ponadto, że z odpowiednich pomiarów jesteśmy w stanie
określić stężenie wolnego ligandu, L. Podstawowy problem sprowadza się do ustalenia
poszczególnych stałych dysocjacji kompleksów ligand-biopolimer, Ki:
Ki =
M i −1 ⋅ L
Mi
Pomocą może służyć opis mikroskopowy wraz z pewnymi założeniami upraszczającymi.
3.3.1 Niezależne miejsca wiązania
Najprostsze założenie jakie zwykle czynimy w modelach tego typu polega na rozważaniu
sytuacji gdy n miejsc wiązania ligandu jest od siebie niezależnych. W opisie mikroskopowym oznacza
to, że mikroskopowe stałe kolejnych kompleksów są sobie równe.
jeden rodzaj miejsc wiązania
Zwykle zakłada się również, że makrocząsteczka posiada tylko jeden rodzaj miejsc wiązania.
Oznacza to, że mikroskopowa stała dysocjacji w danym miejscu wiązania nie jest zależna od tego co
dzieje się w innych miejscach. Jednakże ponieważ jest to opis mikro, więc rozróżniamy poszczególne
miejsca wiązania. Pojawia się teraz pytanie ile różnych stanów mikro odpowiada poszczególnym
stanom makro.
14
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
Rozpatrzmy to na przykładzie makrocząsteczki zawierającej n = 4 miejsca wiązania:
Stan makro
M0
Stany mikro
Liczba stanów mikro
1
M1
4
M2
6
M3
4
M4
1
Można wykazać, że liczba stanów mikro dla n miejsc wiązania z których i jest obsadzonych równa jest
liczbie kombinacji i-elementowych z n-elementowego zbioru:
Ω n, i = C in =
n!
(n − i )!i!
Jeżeli założymy, że wszystkie miejsca wiązania są jednakowe i niezależne, to wartości
makroskopowych stałych dysocjacji wyrazić można zależnością:
Ki =
Ω n , i −1
Ω n, i
k
Dla n = 4 otrzymamy:
Ω 4,0 = 1
Ω 4,1 = 4
Ω 4, 2 = 6
Ω 4,3 = 4
Ω 4, 4 = 1
Ω 4, 0
1
k= k
Ω 4,1
4
Ω
2
K 2 = 4,1 k = k
Ω 4, 2
3
Ω
3
K 3 = 4, 2 k = k
Ω 4, 3
2
Ω
K 4 = 4, 3 k = 4 k
Ω 4, 4
K1 =
Wyznaczmy teraz stężenie związanego ligandu, B:
B = M1 + 2 M 2 + 3M 3 + L + nM n
gdzie: M1 =
M2 =
M3 =
Mn =
M0L
K1
M1L
K2
M2L
K3
=
=
M n −1 L
Kn
M 0 L2
K1K 2
M 0 L3
K1 K 2 K 3
=
M 0 Ln
K1 K 2 K 3 L K n
Analogicznie bilans różnych form makrocząsteczki wyraża się zależnością:
15
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
M = M 0 + M1 + M 2 + M 3 + L + M n
Bez utraty ogólności rozważań zastosujmy te wzory do przypadku, gdy n = 4:
M = M 0 + M1 + M 2 + M 3 + M 4 =
= M0 +
M0L
K1
M 0 L2
+
K1 K 2
M 0 L3
+
K1 K 2 K 3
+
M 0 L4
K1 K 2 K 3 K 4
=
M 0 L M 0 L2
M 0 L3
M 0 L4
= M0 +
+
+
+
=
1
1 2 2 1 2 3 3 1 2 3
4
k
⋅ k
⋅ ⋅ k
⋅ ⋅ ⋅ 4k
4
4 3
4 3 2
4 3 2
= M0 + 4
M0L
k
+6
M 0 L2
k2
+4
M 0 L3
k3
+
M 0 L4
k4
Po wyłączeniu M0 i niewielkich przekształceniach otrzymamy:
2
3
4
⎡
⎛L⎞ ⎛L⎞ ⎤
⎛L⎞ ⎛L⎞
M = M 0 ⎢1 + 4⎜ ⎟ + 6⎜ ⎟ + 4⎜ ⎟ + ⎜ ⎟ ⎥
⎝ k ⎠ ⎝ k ⎠ ⎦⎥
⎝k⎠ ⎝k⎠
⎣⎢
4
⎛ L⎞
Wyrażenie w nawiasach kwadratowych jest rozwinięciem wzoru ⎜1 + ⎟ , otrzymamy więc
⎝ k⎠
ostatecznie:
⎛ L⎞
M = M 0 ⎜1 + ⎟
⎝ k⎠
n
Zastosowanie analogicznych podstawień do bilansu związanego ligandu prowadzi do zależności:
B=4
M0L
k
+ 2⋅6
= 4M 0
M 0 L2
+ 3⋅ 4
k2
M 0 L3
k3
+4
M 0 L4
k4
=
2
3
3
L⎛ L⎞
L⎡
⎛L⎞ ⎛L⎞ ⎛L⎞ ⎤
⎢1 + 3⎜ ⎟ + 3⎜ ⎟ + ⎜ ⎟ ⎥ = 4 M 0 ⎜1 + ⎟
k⎝ k⎠
k ⎢⎣
⎝ k ⎠ ⎝ k ⎠ ⎝ k ⎠ ⎥⎦
W przypadku ogólnym otrzymamy:
L⎛ L⎞
B = nM 0 ⎜1 + ⎟
k⎝ k⎠
n −1
Możemy teraz obliczyć średni stopień obsadzenia makrocząsteczki, ν, czyli liczbę moli związanego
ligandu przypadająca na mol makrocząsteczki:
ν=
B
=
M
L⎛ L⎞
nM 0 ⎜1 + ⎟
k⎝ k⎠
⎛ L⎞
M 0 ⎜1 + ⎟
⎝ k⎠
n −1
n
L
= k
L
1+
k
n
Dokonajmy teraz kilku przekształceń. Rozpocznijmy od pozbycia się mianownika:
16
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
ν+ν
L
L
=n
k
k
Podzielmy teraz obie strony przez stężenie wolnego ligandu, L:
ν ν n
+ =
L k k
i przenieśmy ν/k na prawą stronę:
ν n 1
= − ν
L k k
Jeżeli nasze założenia co do istnienia n jednakowych i niezależnych miejsc wiązania są
prawdziwe, to wykres zależności ν/L w funkcji ν, czyli tzw. wykres Scatcharda powinien mieć
postać linii prostej o nachyleniu tgα = -1/k. Jak można się przekonać analizując powyższy wzór linia
ta przecina oś poziomą w punkcie ν = n, a oś pionową
w punkcie ν/L = n/k. Tak więc wykres Scatcharda
4.0
umożliwia wyznaczenie obydwu parametrów modelu:
Y = -0.991 * X + 3.97
dysocjacji, k.
Pojawia się jednak pytanie skąd wziąć wartość
ni/[L]
liczby miejsc wiązania, n, i mikroskopowej stałej
n = 3,97
k = 1,01 µ M
2.0
ν? Umówiliśmy się przecież, że dysponujemy tylko
wiedzą o ogólnym stężeniu makrocząsteczki, M, i
ligandu, c, oraz znamy z pomiaru stężenie wolnego
ligandu, L. Okazuje się, że dysponując tymi danymi
0.0
0.0
2.0
4.0
ni
można obliczyć ν. Powróćmy do definicji:
ν=
B
.
M
Ponieważ B = c – L, więc:
ν=
c−L
.
M
Uzyskanie na wykresie Scatcharda zależności w postaci linii prostej potwierdza założenie o
istnieniu tylko jednej puli jednakowych i niezależnych miejsc wiązania.
dwa niezależne rodzaje miejsc wiązania
Zobaczmy jak będzie wyglądał wykres Scatcharda jeżeli makrocząsteczka posiada dwa rodzaje
miejsc wiązania o zdecydowanie różnych stałych dysocjacji. Sytuacja taka występuje często w
przypadku białek. Posiadają one niewielką ilość miejsc specyficznie i silnie wiążących ligand (miejsca
receptorowe) oraz pewną liczbę miejsc gdzie może dochodzić do niespecyficznego i słabego
oddziaływania z ligandem, np. na powierzchni białka.
17
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
Załóżmy, że makrocząsteczka posiada n1 miejsc receptorowych o stałej dysocjacji k1 oraz n2
niespecyficznych miejsc wiązania o stałej dysocjacji k2. Pomiędzy stałymi dysocjacji zachodzi przy
tym zależność: k1 < k2. Ponieważ obydwa rodzaje miejsc wiązania są od siebie niezależne, więc dla
każdego z nich możemy napisać wyrażenie na średni stopień obsadzenia:
L
k1
ν1 =
L
1+
k1
L
k2
ν2 =
L
1+
k2
n1
n2
Ogólny stopień obsadzenia jest sumą stopni obsadzenia obu typów miejsc wiązania:
n1L
n 2L
⎛ n
k1
k2
n2 ⎞
⎟⎟
ν = ν1 + ν 2 =
+
= L⎜⎜ 1 +
k1 + L k 2 + L
⎝ k1 + L k 2 + L ⎠
k1
k2
Po podzieleniu obu stron równania przez stężenie wolnego ligandu otrzymamy:
n1
n2
ν
=
+
L k1 + L k 2 + L
Jest to zależność analogiczna do równania Scatcharda, jednak jej kształt nie jest tak oczywisty jak przy
jednym rodzaju miejsc wiązania. Można jednak uzyskać wiele informacji rozpatrując przypadki
graniczne. Należy przy tym zdać sobie sprawę, że niskie wartości ν oznaczają jednocześnie niskie
stężenie wolnego ligandu, a duże wartości ν wystąpić mogą tylko przy wysokich lub bardzo wysokich
stężeniach wolnego ligandu.
5.0
Zobaczmy więc jak będzie się zachowywała nasza zależność
n1 = 3,25
k1 = 0,65 µM
ν
=0
lim
L→∞ L
3.0
ni/[L]
n1
n2
n
n
ν
=
+
= 1+ 2
lim
k1 + 0 k 2 + 0 k 1 k 2
L→0 L
Ln
Y = -1.53 * X + 4.98
4.0
przy granicznych wartościach L:
2.0
n1 + n2 = 11,4
k2 = 6,58 µ M
1.0
Ln
1
2
ν=
+
= n1 + n 2
lim
k
+
L
k
+
1
2 L
L→∞
Y = -0.152 * X + 1.74
0.0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
ni
Tak więc krzywa na wykresie Scatcharda w przypadku dwóch niezależnych typów miejsc wiązania
będzie przecinać oś pionową w punkcie o rzędnej n1/k1+n2/k2, a oś poziomą w punkcie o odciętej
n1+n2. Ponieważ zwykle k1<<k2, więc w pierwszym przybliżeniu można przyjąć, że:
n1 n 2 n1
+
≈
k1 k 2 k1
i
n1 + n 2 ≈ n 2 .
18
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
Można ponadto wykazać, że gdy L→0, to tgα→-1/k1, a gdy L→∞,
5.0
to tgα→-1/k2. Pozwala to wyznaczyć graficznie przybliżone
4.0
wartości parametrów modelu. Parametry te można znacznie
3.0
n1 = 2,01
k1 = 0,50 µM
n2 = 10,02
k2 = 10,12 M
ni/[L]
udokładnić w kolejnych cyklach obliczeń korzystając z wartości z
2.0
poprzedniego cyklu.
Dokładne wartości tych parametrów można jednak otrzymać
1.0
dopiero po zastosowaniu numerycznego dopasowania krzywej. W
0.0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
ni
większości przypadków wystarczają jednak wartości przybliżone
uzyskane metodami graficznymi.
3.3.2 Zależne miejsca wiązanie
W rozpatrywanych dotychczas modelach zakładaliśmy niezależność miejsc wiązania.
Wiadomo jednak doskonale, że w układach biologicznych istnieją również przypadki gdy związanie
pierwszej cząsteczki ligandu zmienia zdolność wiązania kolejnych ligandów. Gdy związanie pierwszej
cząsteczki ligandu przeszkadza wiązaniu następnych mówimy o antykooperatywności wiązania, a gdy
ułatwia mamy do czynienia z kooperatywnością wiązania.
antykooperatywne miejsca wiążące
Scatcharda
uzyskiwany
w
przypadku
6.0
antykooperatywnych miejsc wiążących jest podobny do wykresu
5.0
dla modelu dwóch różnych, niezależnych typów miejsc
4.0
wiążących. Obydwa modele opisują bowiem podobną sytuację: w
Antykooperatywne miejsca wiążące
ni/[L]
Wykres
3.0
miarę wzrostu średniego obsadzenia makrocząsteczki ligand
2.0
wiąże się do miejsc wiązania o coraz mniejszym powinowactwie.
1.0
Rozróżnienie tych dwóch modeli tylko na podstawie wykresu
0.0
0.0
2.0
4.0
Scatcharda jest w praktyce niemożliwe.
6.0
ni
8.0
10.0 12.0 14.0
kooperatywne miejsca wiążące
Dużo korzystniejsza sytuacja istnieje w przypadku wiązania
kooperatywnego.
Ten
typ
oddziaływania
miejsc
3.0
Kooperatywne miejsca wiążące
wiążących
prowadzi bowiem do bardzo charakterystycznego kształtu wykresu
nadaje się jedynie prawa część wykresu. Można wykazać, że
ni/[L]
Scatcharda (rysunek obok). Jednakże do interpretacji ilościowych
2.0
1.0
styczna do tego fragmentu krzywej przecina oś poziomą w punkcie
o odciętej równej n.
Do analizy wiązania ligandu do miejsc kooperatywnych
0.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
ni
zaproponowano specjalny, jednoetapowy model:
19
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
M n ⇔ M 0 + nL
n
K =
M 0 Ln
Mn
==>
Mn =
M 0 Ln
Kn
⎛L⎞
= M0 ⎜ ⎟
⎝K⎠
n
Opis taki zakłada całkowitą, idealną kooperatywność: związanie pierwszego ligandu tak bardzo
zwiększa powinowactwo pozostałych miejsc wiązania, że zostają one zaraz obsadzone. Jak widzimy
jest to model bardzo wyidealizowany, ale warto zobaczyć do jakich wniosków prowadzi.
Wyznaczmy sobie najpierw średni stopień obsadzenia, ν. Dla tego modelu wielkość ta ma
nieco odmienną interpretację. Ponieważ makrocząsteczka występuje jedynie w dwóch stanach:
wolnym i obsadzonym, jest to więc wielkość charakteryzująca wzajemne proporcje obu stanów
makrocząsteczki, a nie stopień obsadzenia pojedynczej makrocząsteczki.
n
nM 0 L
nLn
n
n
nM n
B
nLn
K
K
ν=
=
=
= n
=
M M 0 + M n M + M Ln
K + Ln K n + Ln
0
0
Kn
Kn
Zależność tą należy teraz poddać kilku przekształceniom:
ν
Ln
= n
n K + Ln
(
2.0
)
ν n
K + Ln = Ln
n
ν n
ν
n−ν n
K = Ln − Ln =
L
n
n
n
1.0
logL [ M]
ν n ν n
K + L = Ln
n
n
Y = -0.252*X - 0.001
0.0
νK n = (n − ν )Ln
⎛n ⎞
K n = ⎜ − 1⎟ Ln
⎝ν ⎠
-1.0
-6.0
-4.0
-2.0
0.0
2.0
log(n/ni - 1)
Ostatnią zależność należy teraz zlogarytmować i po kilku prostych przekształceniach otrzymujemy
zależność:
1 ⎛n ⎞
log L = log K − log⎜ − 1⎟ .
n ⎝ν ⎠
Jeżeli teraz na osi pionowej odłożymy wartości logL, a na osi poziomej log(n/ν-1) to otrzymamy tzw.
wykres Hilla. Jeżeli układ spełnia nasze założenia, to powinniśmy otrzymać linię prostą o nachyleniu
tgα = -1/n przecinającą oś pionową w punkcie o rzędnej logK.
W praktyce okazuje się, że sprawa nie jest taka prosta. Nawet w przypadku poprawnie dobranej
wartości n (np. z wykresu Scatcharda) otrzymuje się zależność w przybliżeniu liniową, ale o
20
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
nachyleniu różnym od -1/n. Wskazuje to, że kooperatywność nie jest tak idealna jak zakłada model.
Przyjęto więc, że:
tgα = −
1
αH
gdzie αH nosi nazwę stałej Hilla. Stała ta przyjmuje wartości od 1 do n. Gdy bliska jest 1 oznacza to
brak kooperatywności, a im bliższa jest n tym kooperatywność jest silniejsza. I tak np. dla wiązania
tlenu do hemoglobiny (n = 4) otrzymujemy αH w zakresie od 2,5÷3,0.
3.3.3 Liniowa matryca miejsc wiązania
Opisane powyżej modele zostały stworzone dla makrocząsteczki w której miejsca wiązania nie
są ułożone w jakiś szczególny sposób. Dlatego ich zastosowanie ogranicza się w zasadzie do białek.
Jednakże jednym z ważnych obiektów badań biofizyki są również kwasy nukleinowe, a w
szczególności DNA. W tej cząsteczce miejsca wiązania są jednak ustawione w porządku linearnym
wzdłuż podwójnej helisy. Jeżeli jednocześnie wiążący się ligand zajmuje kilka sąsiadujących ze sobą
miejsc wiązania, np. n, to modele opracowane dla białek stają się nieodpowiednie.
Podstawowy problem polega na tym, że ligand nie ma
dostępu do miejsc wiązania tworzących ciągi krótsze niż liczba
zajmowanych miejsc (patrz rysunek poniżej dla n = 3). Liczba
dostępnych miejsc maleje więc nieliniowo wraz ze wzrostem
stopnia obsadzenia matrycy. Zjawisko to nazwano wiązaniem z wykluczeniem sąsiada (ang. neighbour
exclusion binding). Zaproponowano szereg modeli matematycznych opisujących takie oddziaływanie.
Najszersze zastosowanie spośród nich zdobył model zaproponowany przez McGhee i von Hippel.
W modelu tym zakładamy, że matryca jest bardzo długa, tak że można ją traktować jako
nieskończoną. Ligand wiąże się z matrycą ze stałą dysocjacji k zajmując n kolejnych miejsc wiązania.
Brak jest przy tym oddziaływań pomiędzy sąsiadującymi ze sobą ligandami. Niech ν oznacza średnią
liczbę ligandów przypadających na jedno miejsce wiązania, np. parę zasad w DNA. Makroskopowo
można ν wyrazić jako stężenie związanego ligandu, B, podzielone przez stężenie DNA wyrażone w
parach zasad, Z:
ν=
B
Z
Wyprowadzenie równań modelu McGhee - von Hippel wymaga znajomości dosyć zaawansowanych
metod kombinatorycznych zapoznamy się wiec tylko z ostateczną zależnością.
⎛ 1 − nν ⎞
ν
= k (1 − nν )⎜⎜
⎟⎟
L
⎝ 1 − (n − 1)ν ⎠
n −1
gdzie: L oznacza stężenie wolnego ligandu.
21
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
Dokładne wartości parametrów modelu: n oraz k, można wyznaczyć tylko przez numeryczne
dopasowanie równania modelu do danych doświadczalnych. Przybliżone wartości można jednak
oszacować z odpowiednich wykresów.
1.2
1200
n=1
n=1
1000
n=2
n=2
n=4
n=4
1
0.8
ni*n
ni/L
800
600
0.6
400
0.4
200
0.2
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0
1.0E-06 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 1.0E-02 1.0E-01 1.0E+00
1
ni
L
Jeden z takich wykresów jest analogiem wykresu Scatcharda (powyżej po lewej). Od oryginału różni
się jednak znaczeniem wielkości ν: teraz jest to liczba cząsteczek ligandu przypadająca na jedną parę
zasad. Ze względu na omówione powyżej problemy z dostępem do niektórych miejsc wiązania
zależność ma charakter nieliniowy, podobny do obserwowanego dla wiązania antykooperatywnego.
Jedynie dla n = 1 obserwujemy zależność prostoliniową. Uzyskana zależność przecina osie wykresu w
charakterystycznych punktach (rysunek). Punkt przecięcia na osi pionowej odpowiada stałej wiązania
k, a na osi poziomej 1/n. Jednakże wyznaczenie tych punktów obarczone jest zwykle dużymi błędami
ponieważ dane doświadczalne urywają się z daleka od obu osi, a zależność ma charakter nieliniowy.
Innym
typem
wykresu
pomocnym
przy
analizie
danych
z
zastosowaniem
modelu
McGhee - von Hippel jest tzw. wykres wysycenia (powyżej po prawej). Na osi pionowej wykresu
znajduje się iloczyn n*ν będący ułamkiem wysycenia wszystkich miejsc wiązania, a na osi poziomej
stężenie wolnego ligandu, zwykle w skali logarytmicznej. Z zamieszczonego obok wykresu widać, że
wraz ze wzrostem liczby miejsc zajmowanych przez cząsteczkę ligandu przy niezmiennej wartości
stałej wiązania coraz trudniej jest uzyskać pełne wysycenie matrycy.
Model McGhee - von Hippel można jeszcze rozbudować uwzględniając oddziaływania jakie
mogą wystąpić pomiędzy sąsiadującymi ze sobą ligandami. Wprowadzono w tym celu parametr
kooperatywności, ω.
Dla ω > 1 obecność związanego ligandu sprzyja przyłączeniu w jego bezpośrednim sąsiedztwie
kolejnego ligandu. Wiązanie ma więc charakter kooperatywny.
Dla ω < 1 obecność związanego ligandu przeszkadza związaniu kolejnego w jego bezpośrednim
sąsiedztwie. Wiązanie ma więc charakter antykooperatywny.
Dla ω = 1 mamy do czynienia z wiązaniem niekooperatywnym. Ligand wiąże się z matrycą bez
względu na sąsiedztwo.
22
Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych
1.2
1600
omega = 0,1
omega = 0,1
1400
omega = 1
omega = 1
1200
1
omega = 10
omega = 10
0.8
ni*n
ni/L
1000
800
0.6
600
0.4
400
0.2
200
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0
1.0E-06 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 1.0E-02 1.0E-01 1.0E+00
L
ni
Rodzaj oddziaływania z sąsiednim ligandem znajduje swoje odzwierciedlenie zarówno na wykresie
typu Scatcharda (powyżej po lewej) jak i na wykresie wysycenia (powyżej po prawej).
Pełny model McGhee - von Hippel ma już bardzo skomplikowana postać matematyczną. Dla
porządku przedstawię go jednak poniżej:
⎛ (2ω + 1)(1 − nν ) + ν − R ⎞
ν
= k (1 − nν )⎜⎜
⎟⎟
L
2(ω − 1)(1 − nν )
⎝
⎠
gdzie: R =
n −1
⎛ 1 − (n + 1)ν + R ⎞
⎜⎜
⎟⎟
⎝ 2(1 − nν ) ⎠
2
[1 − (n + 1)ν]2 + 4ων(1 − nν )
Jednakże nawet przy zastosowaniu tak skomplikowanych modeli w praktyce zdarzają się
czasami układy wyraźnie odbiegające od przyjętych założeń. Najczęściej jest to wynikiem:
•
dużych różnic w powinowactwie do różnych sekwencji zasad - więcej niż jedna stała wiązania
•
różnic w stechiometrii wiązania - więcej niż jedna wartość n
•
oddziaływanie ligandu nie tylko z najbliższymi sąsiadami - więcej niż jedna wartość ω.
23