pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str. 31–41
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
ANETTA UNDAS1,2, TERESA IWANIEC3, KRYSTYNA ZAWILSKA4
Problemy diagnostyki dysfibrinogenemii i hipofibrynogenemii wrodzonej
– charakterystyka genetyczna pierwszych „polskich” fibrynogenów
Problems in diagnosing congenital dysfibrinogenemia and hypofibrinogenemia:
the genetic characteristics of the first “Polish” fibrinogens
1
Instytut Kardiologii, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Kierownik: Prof. dr hab. med. Jerzy Sadowski
2
Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, Kraków
Kierownik: Dr n. med. Anna Prokop-Staszecka
3
II Katedra Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Kierownik: Prof. dr hab. med. Jacek Musiał
4
Oddział Hematologii I Chorób Wewnętrznych, Wielospecjalistyczny Szpital im. J. Strusia, Poznań
STRESZCZENIE
Wrodzone zaburzenia ilościowe i/lub jakościowe cząsteczki fibrynogenu charakteryzują się zmniejszonym stężeniem
fibrynogenu funkcjonalnego (zwykle < 1,5 g/l) oraz prawidłowym stężeniem antygenu fibrynogenu w przypadku
dysfibrynogenemii lub podobnie obniżonym w przypadku hipofibrynogenemii. Opisano dotąd ponad 450 przypadków genetycznie uwarunkowanych wariantów fibrynogenów, najczęściej wywołanych mutacją w genie łańcucha α
lub γ fibrynogenu. Dysfibrynogenemię wykrywa się najczęściej przypadkowo u osób dorosłych, z których 50–60%
nie ma objawów zaburzeń hemostazy, u pozostałych obserwuje się objawy żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej albo rzadziej zakrzepicę w układzie tętniczym, a zaledwie u 25% pacjentów występuje tendencja do krwawień, np.
z nosa lub po ekstrakcji zęba. Pierwszy w Polsce przypadek hipofibrynogenemii (γAla82Gly) opisano u pacjentki
w podeszłym wieku ze silną skazą krwotoczną, upośledzeniem gojenia ran i poronieniami. Pierwsze oryginalne „polskie” fibrynogeny, odkryte w latach 2008–2010, to fibrynogen Kraków (γAsn325Ile) – dysfibrynogenemia objawiająca się zakrzepicą żylną w młodym wieku, fibrynogen Poznań (γLys111X) – mutacja typu nonsense związana z hipofibrynogenemią objawiająca się łagodną skazą krwotoczną, oraz fibrynogen Zabrze (γArg275His) – bezobjawowy
dysfibrynogen, cechujący się upośledzoną przepuszczalnością skrzepu fibrynowego i podatnością na lizę. Pierwsze
polskie doświadczenia w szczegółowej diagnostyce genetycznie uwarunkowanych zaburzeń struktury fibrynogenu
potwierdzają, że czas trombinowy i stężenie fibrynogenu powinny być włączone do panelu badań przesiewowych nie
tylko u pacjentów z krwawieniami w wywiadzie, ale także z zakrzepicą żylną lub tętniczą, zwłaszcza, jeśli ich wywiad rodzinny jest obciążony. Nawet stwierdzony jednorazowo obniżony wynik oznaczenia poziomu fibrynogenu
(<1,5 g/l), uzyskany najczęściej koagulometryczną metodą von Claussa, powinien pociągnąć za sobą bardziej szczegółową ocenę pacjenta, z badaniami genetycznymi i poradnictwem genetycznym włącznie.
SŁOWA KLUCZOWE: Krwawienie – Dysfibrynogenemia – Hipofibrynogenemia – Fibrynogen – Mutacja – Zakrzepica
SUMMARY
Congenital quantitative and/or qualitative abnormalities of the fibrinogen molecule are characterized by a decreased
functional fibrinogen concentration (usually <1.5 g/l) and normal fibrinogen antigen in dysfibrinogenemia or similarly reduced in the case of hypofibrinogenemia. Over 450 cases of genetically determined variants of fibrinogens,
mostly caused by a mutation in the α- or γ-chain fibrinogen genes, have been described so far. Dysfibrinogenemia
usually is detected incidentally in adults, 50-60% of them have no symptoms of hemostatic disorders, while in the
remaining subjects there are either venous and/or arterial thrombosis or embolism, only 25% of them have bleeding
tendency, e.g. epistaxis or after tooth extraction. The first case of hypofibrinogenemia (γAla82Gly) has been described in an elderly woman with marked bleeding tendency, impaired wound healing and miscarriages. The first
original "Polish" fibrinogens, discovered in 2008-2010, were named fibrinogen Krakow, fibrinogen Poznan and fibrinogen Zabrze. Fibrinogen Krakow (γAsn325Ile) is a case of dysfibrinogenemia manifested as venous thrombosis
32
A. UNDAS i wsp.
at a young age, fibrinogen Poznan (γLys111X) is a nonsense mutation associated with hypofibrinogenemia and a
mild bleeding diathesis, and fibrinogen Zabrze (γArg275His) is asymptomatic dysfibrinogen, characterized by reduced fibrin clot permeability and susceptibility to lysis. The first Polish experience in the detailed evaluation of genetically determined disorders of fibrinogen structure confirms that the thrombin time and fibrinogen concentration
should be included in the screening panel, not only in patients with a history of bleeding, but also in those with venous or arterial thrombosis, especially if their family history is positive. Once detected reduced levels of fibrinogen
(<1.5 g/l), obtained mostly by the coagulometric (the Clauss) method, should entail a more detailed assessment of the
patient, including genetic testing and genetic counseling.
KEY WORDS: Bleeding – Dysfibrinogenemia – Hypofibrinogenemia – Fibrinogen – Mutation – Thrombosis
Tworzenie skrzepu fibrynowego
Fibrynogen jest glikoproteiną o masie 340 kDa, której okres półtrwania w osoczu wynosi około
4 dni. Cząsteczka fibrynogenu jest heksamerem zbudowanym z trzech par łańcuchów polipetydowych
(Aα, Bβ, γ)2 połączonych 29 mostkami dwusiarczkowymi. W cząsteczce fibrynogenu wyróżnia się trzy
główne domeny czynnościowe połączone fragmentem o strukturze pęczka helis: centralną domenę E
z N-końcowymi fragmentami wszystkich sześciu łańcuchów polipeptydowych (zawierająca fibrynopetydy A i B) i dwie zewnętrzne domeny D z C-końcowymi fragmentami łańcuchów Bβ i γ. C-końcowe
fragmenty łańcuchów Aα to kuliste (globularne) struktury znajdujące się w pobliżu centralnej domeny
E [1,2].
Do utworzenia się skrzepu fibrynowego dochodzi w wyniku szybko postępujących po sobie zdarzeń
inicjowanych działaniem trombiny na łańcuchy Aα i Bβ fibrynogenu. Trombina wiąże się z fibrynogenem w centralnej części cząsteczki. Odszczepia ona fibrynopeptyd A (FPA) oraz – znacznie wolniej –
fibrynopeptyd B (FPB) od końców aminowych łańcuchów (odpowiednio) Aα i Bβ fibrynogenu, wskutek czego powstają monomery fibryny, które mają zdolność polimeryzacji na drodze niekowalentnych
interakcji pomiędzy domenami D i centralnymi domenami E kolejnych monomerów. Proces ten prowadzi do powstania protofibryli, a następnie wskutek tzw. bocznej agregacji, grubych włókien (fibryli).
Intensywność procesu bocznego łączenia się włókien ze sobą determinuje wytrzymałość skrzepu, jednak jego oporność na plazminę zależy głównie od kowalencyjnych wiązań krzyżowych [1, 2]. Wiązania
krzyżowe powstają w wyniku działania aktywnego czynnika XIII (FXIII), transglutaminazy, której
powstanie z nieaktywnego zymogenu katalizuje trombina [3]. Kowalencyjne wiązania krzyżowe między końcami karboksylowymi łańcuchów gamma powstają pomiędzy lizyną w pozycji 406 a glutaminą
w pozycji 398/399 kolejnych łańcuchów. Wiązania między środkowymi fragmentami oraz końcami
karboksylowymi łańcuchów α kolejnych cząsteczek fibrynogenu prowadzą do powstania oligomerów
i polimerów, jest to jednak proces znacznie wolniejszy niż dimeryzacja łańcuchów γ [3].
Degradacja fibryny
Do rozpuszczenia skrzepu dochodzi w wyniku działania tkankowego aktywatora plazminogenu
(tPA, proteazy serynowej uwalnianej z komórek śródbłonka) i plazminogenu na powierzchnię fibryny
(włóknika). Na uwalnianie tPA z komórek śródbłonka ma wpływ wiele czynników, m.in. trombina
i duże siły ścinania. Obecność fibryny znacząco przyspiesza, o co najmniej dwa rzędy wielkości, generację plazminy katalizowaną przez tPA, która jest ograniczona proteolizą plazminogenu [4]. Plazmina
rozszczepia wiązania Lys-Arg w cząsteczkach fibryny zapoczątkowując proces degradacji (rozpuszczania) skrzepu. W przypadku braku inhibitorów odszczepienie amino-końcowych fragmentów plazminy
powoduje powstanie trzech bardzo podobnych cząsteczek plazminy zwanych Lys-plazminą [4]. Proces
fibrynolizy jest hamowany przez grupę inhibitorów proteaz serynowych. Głównym inhibitorem jest α2antyplazmina, która szybko inaktywuje plazminę. Jednakże plazmina związana z fibryną jest chroniona
przed działaniem α2-antyplazminy. Kluczowym, fizjologicznym inhibitorem tPA jest inhibitor aktywa-
Problemy diagnostyki dysfibrinogenemii
33
tora plazminogenu typu 1 (PAI-1) uwalniany przez różne komórki, zwłaszcza śródbłonek naczyniowy,
oraz płytki, w stanach zapalnych, zwiększonego stresu oksydacyjnego i aktywacji krzepnięcia krwi.
Inhibitor fibrynolizy aktywowany trombiną (TAFI) hamuje aktywację plazminogenu [4]. Aktywowany
TAFI usuwa reszty lizynowe wiążące plazminę do fragmentów fibryny powstających w czasie jej degradacji, powodujące zwiększenie stabilności skrzepu [4]. Podczas degradacji fibryny w wyniku działania plazminy dochodzi do powstania dimerów D, produktów degradacji usieciowanej fibryny, które in
vivo są czułymi markerami tworzenia i lizy fibryny.
Dysfibrynogenemie
Dysfibrinogenemie to wrodzone lub nabyte zaburzenia jakościowe cząsteczki fibrynogenu, które
charakteryzują się obniżonym poziomem fibrynogenu funkcjonalnego (zwykle <1,5 g/l) ale prawidłowym stężeniem antygenu fibrynogenu (patrz poniżej). Dysfibrynogenemie można podzielić na trzy
kategorie w oparciu o nieprawidłowości w tworzeniu skrzepu fibrynowego związane z (1) upośledzonym uwalnianiem fibrynopeptydów, (2) opóźnioną polimeryzacją monomerów fibryny czy (3) niedoborem fibrynowych wiązań krzyżowych. W większości znanych dysfibrynogenemii obecne są dwa lub
więcej defekty funkcjonalne, najczęściej dotyczą one zarówno polimeryzacji fibryny jak i uwalniania
fibrynopeptydów. Część badaczy dzieli dysfibrynogenemie na dwie grupy: (1) z zaburzonym uwalnianiem FPA i FPB i (2) bez tych zaburzeń. W pierwszej grupie zaburzenia związane są z obszarami na
końcach aminowych łańcuchów α i β, natomiast w drugiej defekty zlokalizowane są w różnych obszarach cząsteczki fibrynogenu, głównie w łańcuchu γ.
Dotychczas opisano ponad 450 genetycznie uwarunkowanych zmian w strukturze fibrynogenu.
Dysfibrynogenemie wrodzone mają najczęściej przebieg bezobjawowy i wykrywane są przypadkowo
u osób w różnym wieku od kilku miesięcy do ponad 70 lat, najczęściej jednak u osób dorosłych. Objawy kliniczne towarzyszące dysfibrynogenemii wrodzonej obejmują zakrzepicę lub zatorowość w układzie żylnym lub rzadziej tętniczym (około 20% wszystkich opisanych przypadków) lub tendencję do
krwawień, często występujących w czasie zabiegów inwazyjnych np. po ekstrakcji zęba lub samoistnie
zwłaszcza w postaci krwawień z nosa (25% wszystkich opisanych przypadków) [5]. Szacuje się, że
około 25% pacjentów z dysfibrynogenemią, którzy mają dodatni wywiad w kierunku krwawień, przebyło również zakrzepicę [5]. W związku z tym, że zakrzepica lub krwawienia u pacjentów z dysfibrynogenemią mają charakter epizodyczny i występują one także u innych członków rodziny, można uznać
dysfibrynogenemię za rzadki przypadek rodzinnej trombofilii predysponującej do zakrzepicy żylnej lub
tętniczej. Warto podkreślić, że u osób z dysfibrynogenemią obserwuje się zwiększone ryzyko powikłań
w okresie ciąży, w tym poronienia, oraz wydłużenie gojenia ran [6].
Hipofibrynogenemie
Hipofibrynogenemie to nieprawidłowości w ilości krążącego fibrynogenu, charakteryzujące się podobnym obniżeniem poziomu zarówno fibrynogenu funkcjonalnego, jak i tego oznaczanego jak białko
metodami immunologicznymi, zwykle poniżej 1,5 g/l. Hipofibrynogenemie wrodzone są rzadkie, występują najczęściej w społeczeństwach, gdzie częste są małżeństwa osób spokrewnionych. Bardzo rzadko
hipofibrynogenemia jest cechą nabytą – objawem choroby wątroby, głównie w niewydolności tego narządu. W większości przypadków wrodzonej hipofibrynogenemii pacjenci są heterozygotycznymi nosicielami mutacji powodujących także afibrynogenemię (całkowity brak fibrynogenu, stężenie <0,1 g/l) [7].
Często hipofibrynogenemia ma charakter bezobjawowy, ale mogą towarzyszyć jej także krwawienia o różnym nasileniu, od słabych do poważnych [8].
Poziom fibrynogenu około 1 g/l chroni zwykle pacjentów przed krwawieniami i powikłaniami ciążowymi. Większość przypadków hipofibrynogenemii jest bezobjawowa i podobnie jak dysfibrynogenemia jest wykrywana przypadkowo. Do krwawień dochodzi najczęściej podczas zabiegów operacyj-
34
A. UNDAS i wsp.
nych lub po urazie. Najwyżej 20% krwawień u osób z hipofibrynogenemią pojawia się spontanicznie.
U noworodków z niższym poziomem fibrynogenu mogą wystąpić krwawienia z kikuta pępka, które
uważa się za charakterystyczne dla afibrynogenemii, a u dorosłych – krwawienia śródskórne, żołądkowo-jelitowe, dostawowe i rzadko śródczaszkowe. U niektórych kobiet występują powikłania położnicze
w postaci poronień oraz krwawienia poporodowe [9]. Afibrynogenemii mogą także – paradoksalnie –
towarzyszyć powikłania zakrzepowe, co może być związane z nasileniem in vivo agregacji płytek krwi
indukowanej trombiną na skutek braku własności neutralizujących trombinę przez fibrynę [10]. Ponadto w niektórych przypadkach hipofibrynogenemii dochodzi do gromadzenia się fibrynogenu w cytoplazmie hepatocytów, co prowadzi do uszkodzenia wątroby i nawet jej marskości. Hipofibrynogenemia
może też być przyczyną wrodzonych przypadków skrobiawicy z zajęciem nerek, wskutek spontanicznej
agregacji w amyloid w nerkach.
Stosunkowo rzadko występują hypodysfibrinogenemie. Dotychczas opisano około 25 nieprawidłowych funkcjonalnie fibrynogenów u pacjentów z obniżonym poziomem fibrynogenu (<1,5 g/l) oznaczonym zarówno metodą koagulometryczną jak i immunologiczną (np. fibrynogen Kraków, patrz niżej).
Ocena laboratoryjna
Badania wykonywane u pacjenta z podejrzeniem hipo- lub dysfibrynogenemii, zarówno wrodzonej
i nabytej, to czas protrombinowy (PT, wyrażany w sekundach lub jako wskaźnik INR), czas częściowej
tromboplastyny po aktywacji (aPTT), czas trombinowy (TT) oraz poziom fibrynogenu (oznaczany metodą czynnościową oraz immunologiczną). Badania te charakteryzują się dużą czułością, ale małą swoistością [11].
Podstawowym testem przesiewowym jest czas trombinowy (Rycina 1), który ulega przedłużeniu
przy spadku stężenia fibrynogenu poniżej 1,0 g/l. Podobnie zachowuje się PT, podczas gdy aPTT rzadko w tego typu zaburzeniach ulega wydłużeniu (zwykle dopiero przy stężeniu fibrynogenu <0,6 g/l) [7].
TT ocenia szybkość tworzenia się skrzepu fibrynowego po dodaniu standardowego stężenia trombiny
do osocza badanego. Obecność dysfibrynogenu często powoduje przedłużenie TT poprzez blokowanie
uwalniania FPA i/lub FPB lub blokowanie polimeryzacji monomerów fibryny. Niekiedy obok pomiaru
TT wykonuje się pomiar czasu reptylazowego (RT), który mierzy szybkość tworzenia się skrzepu po
dodaniu reptylazy do osocza badanego. Reptylaza (izolowana z jadu węża Bothrops atrox) uwalnia
z fibrynogenu tylko FPA, dlatego też test ten jest czuły zarówno na zaburzenia ilościowe, jak i jakościowe fibrynogenu [11]. Test ten jest szczególnie przydatny w sytuacjach, kiedy podejrzewamy obecność heparyny w próbce (reptylaza nie jest unieczynniana przez heparynę) oraz w tych dysfibrynogenemiach, w których TT jest prawidłowy (np. fibrynogen Oslo I [12], fibrynogen Denver [13]).
Metoda czynnościowa do oznaczania poziomu fibrynogenu funkcjonalnego (koagulometryczna metoda von Claussa) ocenia szybkość tworzenia się skrzepu po dodaniu nadmiaru trombiny do osocza
cytrynianowego. Natomiast stężenie fibrynogenu (tzw. fibrynogen immunoreaktywny) ocenia się przy
użyciu metod immunologicznych, np. nefelometrycznej, immunodyfuzji radialnej lub immunoenzymatycznej. Prawidłowe stężenie fibrynogenu w osoczu, mierzone obiema metodami (koagulometryczną
i immunologiczną) mieści się w zakresie 1,5–3,5 g/l.
Ponieważ poziom fibrynogenu w osoczu zmienia się w odpowiedzi na infekcje, uraz lub czynniki
stresowe, różne oznaczenia powinny być wykonywane w tej samej próbce osocza.
Dla dysfibrynogenemii charakterystyczna jest istotna rozbieżność pomiędzy poziomem fibrynogenu
mierzonego metodą koagulometryczną a metodą immunologiczną [11]. Poziomy fibrynogenu czynnościowego są niższe w porównaniu ze stężeniem antygenu. Współczynnik będący stosunkiem aktywności do antygenu fibrynogenu zwykle wynosi 1:2 (Rycina 1). W >90 % przypadków dysfibrynogenemii
wartość tego wskaźnika ma znaczenie diagnostyczne.
W hipofibrynogenemii poziomy fibrynogenu funkcjonalnego i immunoreaktywnego są zbliżone
i mieszczą się zwykle w przedziale od 0,5 do dolnej granicy zakresu referencyjnego danego laborato-
Problemy diagnostyki dysfibrinogenemii
35
rium (zwykle 1,5 g/l). Testy, w których wynik końcowy zależy od szybkości tworzenia się skrzepu
fibrynowego (PT, aPTT, TT) są w różnym stopniu przedłużone; najbardziej czuły, podobnie jak
w dysfibrynogenemii, wydaje się być TT.
W hypodysfibrynogenemii, gdzie współistnieją oba defekty fibrynogenu, jakościowy i ilościowy,
poziomy fibrynogenu mierzone metodami koagulometrycznymi i immunologicznymi mieszczą się zazwyczaj w zakresie 0,5–1,2 g/l.
Należy jednak pamiętać, że poziom fibrynogenu jako białka ostrej fazy może wzrosnąć do stężeń
zbliżonych do prawidłowych w odpowiedzi na stan zapalny, uraz lub zabieg operacyjny, co może
utrudniać ustalenie właściwego rozpoznania w niektórych przypadkach dysfibrynogenemii.
Wyniki „przesiewowych” testów koagulometrycznych najczęściej nie ułatwiają rozpoznania. PT
i aPTT mogą mieścić się w zakresie wartości prawidłowych, podobnie TT. Aktywność fibrynogenu
zazwyczaj jest obniżona, ale może być prawidłowa (<1,5 g/l), bywa jednak zwykle znacznie niższe od
stężenia antygenu fibrynogenu. Ponadto czułość wskaźnika aktywność/antygen fibrynogenu w dysfibrynogenemiach w znacznym stopniu zależy od stosowanych odczynników i typu mutacji, dlatego też
do ustalenia ostatecznego rozpoznania niezbędne jest wykonanie diagnostyki genetycznej (Rycina 1).
Ryc. 1. Schemat postępowania diagnostycznego przy podejrzeniu dys/hipofibrynogenemii.
Fig. 1. Algorithm for laboratory diagnosis of dys/hypofibrinogenemia.
A. UNDAS i wsp.
36
Wyniki testów diagnostycznych w dys- i hipofibrynogenemiach opisanych u Polaków przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1. Dysfibrinogeny opisane u polskich pacjentów
Table 1. Dysfibrynogens described in Polish patients
Typ mutacji
Fibrinogen
Krakow
γ(Asn325Ile)
[27]
Fibrinogen
Zabrze
γ(Arg275His)
[19]
γ(Ala82Gly)
[6]
Czas częściowej
tromboplastyny
po aktywacji
[s]
Czas
trombinowy
[s]
Fibrinogen
(metoda
Claussa)
[g/L]
Fibrinogen
(metoda
nefelometryczna)
[g/L]
34,0
(N: 28-40)
21,5
(N: 14-21)
0,62
(N: 1,8-3,5)
1,16
(N: 1,8-3,5)
12,9
(N: 10-15 )
30,2
(N: 26-36)
33,0
(N: 14-21)
0,86
(N: 1,8-3,5)
2,8
(N: 1,8-3,5)
16,6
(N:12-18)
35,10
(N: 30-40)
18,0
(N:10-18)
0,93
(N: 1,8-3,5)
1,5-2,0
(N: 1,8-3,5)
Czas
protrombinowy [s]
brak
danych
Objawy
Brak krwawień.
Zakrzepica żylna
Brak krwawień.
Brak zakrzepicy
Ciężkie krwawienia
Poronienia
Wrodzone dys i hipofibrynogenemie – genetyczne podłoże
Synteza fibrynogenu w wątrobie jest kodowana przez trzy geny (jeden dla każdego łańcucha) zlokalizowane na chromosomie 4. U pacjentów z dysfibrynogenemią zmiany są zlokalizowane we wszystkich trzech genach dla fibrynogenu (4q28.1, 4q28.2 dla FGG, FGA i 4q28.3 dla FGB) i w większości
przypadków są to zmiany typu missense (kodowany jest inny aminokwas), nonsense (brak kodowania
aminokwasu) lub mutacje typu frameshift (mutacja zmiany ramki odczytu; małe delecje lub insercje
w części kodującej genu), jak również miejsc splicingowych (splice-site abnormalities) lub rzadko delecje (wyszczególnione na stronie http://www.geth.org/databaseang/fibrinogen).
Przyczyną hipo- lub afibrynogenemii mogą być mutacje (punktowe lub duże delecje) w każdym
z trzech genów dla fibrynogenu (FGA, FGB, FGG), w wyniku których synteza fibrynogenu, łączenie
się włókien fibrynogenu, stabilność w obrębie domen oraz sekrecja białka są upośledzone. Dotychczas
opisano w hipo- lub afibrynogenemii ponad 60 mutacji punktowych, najczęściej typu missense lub typu
nonsense. Znane są pojedyncze duże delecje, jako przyczyny takich nieprawidłowości. Znacząca większość znanych mutacji leżących u podłoża hipo- lub afibrynogenemii jest zlokalizowana w genie dla
łańcucha Aα (FGA) fibrynogenu, ale także w genie dla łańcucha γ (FGG), głównie w C-końcowym
fragmencie kulistej domeny D [8].
W większości przypadków pacjenci z dysfibrynogenemią lub z hipofibrynogenemią są heterozygotycznymi nosicielami określonej mutacji, u których we krwi krążącej obecne są zarówno cząsteczki
„prawidłowego” jak i „nieprawidłowego” fibrynogenu.
Mutacje łańcucha Aα
Mutacje w często są związane z uwalnianiem fibrynopeptydów i obrębie łańcucha Aα towarzyszy
im nasilona tendencja do krwawień. Najczęściej przyczyną α-dysfibrynogenemii są mutacje w obrębie
łańcucha Aα pozycji Arg16 lub Pro18.
Problemy diagnostyki dysfibrinogenemii
37
Afibrynogenemie najczęściej powstają na skutek mutacji w obrębie łańcucha Aα, podczas gdy opisano tylko dwie mutacje dla tego łańcucha w hipofibrynogenemiach [14]. Duże delecje są stosunkowo
rzadkie u rodzin z afibrynogenemią (głównie w genie FGA). W afibrynogenemii często stwierdza się
postaci homozygotyczne w obrębie genu FGA.
Przykładem objawowej dysfibrynogenemii wywołanej mutacją w FGA jest fibrynogen Kaiserslautern III [15] (AαArg16Cys) zidentyfikowany u pacjenta z umiarkowaną tendencją do krwawień. Szybkość odszczepiania FPB przez trombinę była tylko nieco opóźniona, podczas gdy FPA uwalniane były
w liczbie mniejszej o połowę na skutek mutacji w miejscu działania trombiny. Innym przykładem
dysfibrynogenemii jest fibrynogen Novy Jicin [16] (AαArg16Cys), objawiający się powikłaniami krwotocznymi u 12-letniej dziewczynki, u której fibrynogen mierzony metodą koagulometryczną był bardzo
obniżony (0,3 g/l). Kinetyka uwalniania fibrynopeptydów i polimeryzacji fibryny były upośledzone.
Fibrynogen Kyoto II [17] (AαPro18Leu) zdiagnozowano natomiast u kobiety ze skłonnościami do
krwawień, u której uwalnianie fibrinopeptydów było prawidłowe, a polimeryzacja monomerów fibryny
była osłabiona. Poziom fibrynogenu funkcjonalnego był obniżony (0,64 g/l), przy prawidłowym stężeniu fibrynogenu immunoreaktywnego (2,16 g/l).
Mutacje łańcucha Bβ
Nieprawidłowe fibrynogeny, których przyczyną są mutacje genu łańcucha Bβ są rzadkie i często
towarzyszą im nieprawidłowości strukturalne w N-końcowym fragmencie łańcucha α lub C-końcowym
fragmencie łańcucha γ. Mutacje w takiej lokalizacji typowo w hipofibrynogenemii znajdują się
w 2 ostatnich egzonach i zaburzają proces wydzielania fibrynogenu.
Przykładem takiej dysfibrinogenemii jest fibrynogen Nijmegen [18] (BβArg44Cys), zidentyfikowany u pacjenta z zakrzepicą żylną. Liza skrzepu fibrynowego była u niego przedłużona, aktywacja tPA
osłabiona, co sugerowało osłabienie także fibrynolizy. TT był prawidłowy, czas reptylazowy nieznacznie przedłużony, poziom fibrynogenu oznaczony metodą koagulometryczną (1,2 g/l) niższy niż oznaczony metodą immunologiczną (3,5 g/l) [19]. Fibrynogen Nijmegen może wiązać się z albuminami lub
innymi białkami poprzez wiązania disiarczkowe, tworząc w ten sposób wysokocząsteczkowe kompleksy z dodatkowymi wolnymi grupami -SH w cząsteczce dysfibrynogenu [19].
Fibrynogen Znojmo [17] (BβArg237Ser) wykryto u pacjenta, który przebył zakrzepicę i zator tętnicy płucnej. Pomimo prawidłowego uwalniania FPA i FPB stwierdzono w tym przypadku upośledzenie
fibrynolizy i nieprawidłową strukturę skrzepu (z nieznacznym wzrostem średnicy włókien o nierównej
powierzchni).
Mutacje łańcucha γ
Dysfibrynogenemie spowodowane mutacjami łańcucha γ, głównie w C-końcowym fragmencie tego
łańcucha są typowe, ale tylko u około 5% występują krwawienia, a u około 30% zakrzepica. W większości przypadków (65%) pacjenci są bezobjawowi [21]. Typowe dla gamma-dysfibrinogenów jest
osłabienie polimeryzacji monomerów fibryny przy prawidłowym uwalnianiu fibrynopeptydów. Wspólną cechą dla wszystkich opisanych γ-dysfibrynogenów jest wydłużenie TT. Najczęściej γ-dysfibrynogeny powstają na skutek mutacji dla Arg275 (zazwyczaj bez towarzyszących objawów klinicznych),
głównie Arg275His (np. Fibrinogen Peruggia I, Bergamo I, Barcelona IV, Osaka I, Zabrze [22]: tabela
1) lub Arg275Cys (np. Osaka II, Tokio II, Milano V, Baltimore IV) [21].
Hipofibrynogenemie są najczęściej wywołane mutacją typu missense. Mutacje powodująca utratę
25 ostatnich aminokwasów z końca karboksylowego łańcucha γ, np.Gly284Arg i Arg375Trp, hamuje
wydzielanie fibrynogenu i jego spichrzanie w wątrobie.
Defekty genetyczne, których konsekwencją są hypodysfibrynogenemie zlokalizowane są również
najczęściej w C-końcowym fragmencie łańcucha γ, w którym mieszczą się istotne funkcjonalnie miej-
38
A. UNDAS i wsp.
sca, jak choćby miejsce dla wiązania jonów wapnia (γ311-336) lub polimeryzacji (γ374-396). Przykładem takiej nieprawidłowości jest fibrynogen Tokyo V (γAla327Thr), opisany u 43-letniego pacjenta
z nawracającymi powikłaniami zakrzepowo-zatorowymi w wywiadzie. Obecność tego nieprawidłowego fibrynogenu predysponuje do zakrzepicy. W cząsteczce fibrynogenu Tokyo V dochodzi do substytucji γAla327Thr oraz prawdopodobnie glikozylacji w pozycji γAsn 325. Skłonność do powikłań zakrzepowo-zatorowych może wyjaśniać oporność powstającego skrzepu na fibrynolizę oraz tworzenie znacznych ilości rozpuszczalnej fibryny, na skutek zmian konformacyjnych w łańcuchu γ wiążącym jony
wapnia oraz t-PA [23].
Polskie opisy hipo- i lub dysfibrynogenemii z analizą genetyczną
Pierwszym w pełni scharakteryzowanym przypadkiem dysfibrynogenemii, a dokładniej hipodysfibrynogenemii, w Polsce jest nieprawidłowość u młodej kobiety z zakrzepicą w młodym wieku, nazwana przez nas fibrynogen Kraków (γAsn325Ile) [24]. Patologię tę zdiagnozowano u 21-letniej kobiety,
u której wystąpiła zakrzepica żył głębokich w wieku 16 lat, z następowym zespołem pozakrzepowym
(tabela 1). Nie stwierdzono u pacjentki innych znanych przyczyn trombofilii, w tym zespołu antyfosfolipidowego. W wywiadzie nie odnotowano także zwiększonej tendencji do krwawień. W badaniach
laboratoryjnych widoczna jest rozbieżność w poziomach fibrynogenu mierzonego dwoma różnymi
metodami: 0,62 i 0,56 g/l (koagulometryczną metodą Claussa) oraz 1,16 i 1,20 g/l (metodą nefelometryczną). Taka tendencja zachowana jest także u bezobjawowej siostry pacjentki, z tym, że uzyskane
wartości są niższe: <0,2 g/l (met. koagulometryczną) i 1,07 g/l (met. nefelometryczną).
U większości heterozygotycznych nosicieli innych mutacji Asn325 obecne były powikłania zakrzepowe. Reszta przyłączona do Asn w pozycji 82 jest regionem wysoce konserwatywnym, co sugeruje, że
jest niezbędna dla zapewnienia prawidłowej funkcji fibrynogenu. W testach czynnościowych stwierdzono wydłużenie czasu lizy skrzepu fibrynowego, wskazujące na jego upośledzoną lizę. Zaburzenia
struktury i funkcji fibryny na skutek zmniejszenia przepuszczalności oraz zmiany struktury skrzepu
mogą tłumaczyć ewentualne epizody zakrzepowe u nosicieli mutacji γAsn325Ile [24].
Kolejny przypadek dysfibrynogenemii w Polsce rozpoznano u 18-letniej kobiety bez epizodów
krwawień lub zakrzepicy w wywiadzie [22]. Ten dysfibrynogen, nazwany fibrynogen Zabrze, jest
wywołany stosunkowo częstą nieprawidłowością tj. zamianą argininy na histydynę w pozycji 275 łańcucha γ (γArg275His), co zaburza interakcje pomiędzy domenami D, znacząco wpływając na tworzenie
protofibryli. Mutacje γ275His opisywano wcześniej zarówno u pacjentów bezobjawowych (np. fibrynogen Barcelona IV [25], Essen I [26], Osaka III [27]) jak i z obecnymi epizodami zakrzepowymi żylnymi i/lub tętniczymi (Barcelona III [25], Bergamo II [26]) albo niezwykle rzadko ze skłonnościami do
krwawień (np. Saga I [28], Cordoba I [29]).
U pacjentki stwierdzono obniżony poziom fibrynogenu funkcjonalnego 0,86 g/l przy prawidłowym
poziomie oznaczonym metodą immunologiczną (2,8 g/l). Także u ojca pacjentki odnotowano podobne
stężenia fibrynogenu (0,6 g/l met. koagulometryczną i 2,5 g/l met. nefelometryczną). Zarówno matka
pacjentki jak i brat ojca mieli prawidłowe poziomy fibrynogenu funkcjonalnego. Ocena polimeryzacji
oraz degradacji fibryny metodą turbidymetryczną pokazuje, iż dysfibrynogenemia w wyniku mutacji
γ275His związana jest nie tylko z opóźnionym tworzeniem skrzepu i wolniejszą polimeryzacją monomerów fibryny, ale także ze zmniejszeniem przepuszczalności skrzepu fibrynowego i upośledzeniem
procesu fibrynolizy (wydłużenie czasu lizy skrzepu i zmniejszenie szybkości lizy), co może tłumaczyć
stosunkowo częstą tendencję do zakrzepicy u nosicieli tej mutacji. Brak powikłań zakrzepowych u części z nich może być konsekwencją obecności różnych proporcji fibrynogenu prawidłowego i „zmutowanego” krążącego we krwi.
Pierwszy w Polsce przypadek hipofibrynogenemii (γAla82Gly) opisano u pacjentki w podeszłym
wieku ze skazą krwotoczną o znacznym nasileniu, która obejmowała silne krwawienia po zabiegach
chirurgicznych i ekstrakcjach zębów, okresowo z nosa, intensywne krwawienia miesiączkowe, krwa-
Problemy diagnostyki dysfibrinogenemii
39
wienia podczas ciąż, a także 6 poronień oraz długie gojenie ran [6]. Znamienny był także wywiad rodzinny (siostra – zgon po operacji w obrębie jamy brzusznej, matka – krwawienia z nosa, jedno poronienie). Przypadek przez nas opisany był jednak bogatoobjawowy, pomimo, iż wykluczono inne znane
przyczyny skazy krwotocznej oraz zespół antyfosfolipidowy. Co istotne, u pacjentki poziom fibrynogenu często mieścił się w przedziale 1,5 do 2,0 g/l, co mogło być najpewniej spowodowane współistniejącym stanem zapalnym (zapalenie zatok bocznych nosa).
Mutacja została opisana po raz pierwszy w 2000 roku przez Brennana i wsp. [30] w połączeniu
z drugą mutacją typu missense w genie dla łańcucha Bβ (Pro235Leu) u mężczyzny z umiarkowaną tendencją do krwawień i obniżonym poziomem fibrynogenu funkcjonalnego (0,7 do 1,1 g/l). Mutację
γAla82Gly zidentyfikowano także u 4 osób bez objawów klinicznych spośród ponad 600 zdrowych
dawców krwi, co sugeruje, że zaburzenia tego typu są stosunkowo częste, ale mają łagodny przebieg
[31].
Alanina w pozycji γ82 jest zlokalizowana w obszarze wrażliwym na działanie proteazy w centralnej
części potrójnej helisy łączącej domenę E z domenami D. Obecność glicyny w wyniku tej mutacji może
zaburzyć strukturę helisy i w konsekwencji łączenie się włókien fibrynogenu, ale może również zwiększać podatność na proteolizę [30].
Przypadek ten pokazuje, że obecność nieprawidłowego fibrynogenu związanego z mutacją
γAla82Gly może mieć różną kliniczną manifestację, zarówno w postaci krwawień jak i powikłań położniczych. Z drugiej strony pokazuje także, iż warto rozważyć rozszerzenie diagnostyki u pacjentów
z poziomem fibrynogenu 1,5-2,0 g/l, z objawami skazy krwotocznej w wywiadzie.
Nowa mutacja typu nonsense w FGG egzonie 4 c.331A>T (AAG>TAG) p.Lys111X (fibrynogen
Poznań) [32] została zidentyfikowana u trzech członków rodziny z rozpoznaną hypofibrynogenemią
i z umiarkowaną tendencją do krwawień u dwóch z nich. U 25-letniego mężczyzny z objawami skazy
o niezbyt dużym nasileniu w wywiadzie (krwawienia z drobnych ran na skórze, z nosa oraz łatwe siniaczenie się) jednorazowo pojawił się 32-godzinny epizod krwawienia po ekstrakcji zęba. Podstawowe
parametry układu krzepnięcia były prawidłowe, za wyjątkiem przedłużonego TT (21,1 s), obniżonego
stężenia fibrynogenu funkcjonalnego (1,0 g/l) oraz immunoreaktywnego (1,12 g/l). Także u jego 18letniego brata, u którego także pojawiło się krwawienie po ekstrakcji zęba, poziom fibrynogenu był
obniżony (met. immunologiczna 1,37 g/l; met. Claussa 1,0 g/l) a TT wydłużony (23,6 s). U ojca, u którego krwawienia nie były obecne, poziom fibrynogenu był prawidłowy.
Obecność tej mutacji powoduje tworzenie znacznie skróconego łańcucha γ fibrynogenu, pozbawionego części domeny typu coiled coil niezbędnej do tworzenia fibrynogenu oraz łączenia heksamerów,
jak również konserwatywnej domeny C-końcowej, istotnej w procesie tworzenia cząsteczki fibrynogenu. Nieprawidłowy (zmutowany) fibrynogen Poznań ze skróconym łańcuchem γ w miejscu
Lys111(Lys85) nie ulega wbudowaniu do cząsteczki fibrynogenu ani też sekrecji, co fenotypowo daje
obraz hipofibrynogenemii [32].
PODSUMOWANIE
Wrodzone dysfibrynogenemie i hipofibrynogenemie są skutkiem mutacji w jednym z 3 znajdujących się na chromosomie 4 genów kodujących 3 łańcuchy cząsteczki fibrynogenu. W większości przypadków (50–60%) obie genetycznie uwarunkowane nieprawidłowości są bezobjawowe i rozpoznawane
zwykle przypadkowo. Wyniki badań koagulometrycznych charakterystyczne dla dysfibrynogenemii to:
przedłużony czas trombinowy, prawidłowe stężenie antygenu fibrynogenu i niski poziom fibrynogenu
funkcjonalnego (<1,5 g/l). W hipofibrynogenemii obie te metody pomiaru wykrywają podobnie obniżone stężenia fibrynogenu. Dysfibrinogenemia może stanowić czynnik ryzyka zakrzepicy, zarówno
tętniczej jak i żylnej (< 1% pacjentów z zakrzepicą), ale również powodować krwawienia podczas zabiegów operacyjnych, urazów czy porodu (rzadko zagrażające życiu). Krwawienia są najczęstszą manifestacją kliniczną hipofibrynogenemii, jeśli jest objawowa.
A. UNDAS i wsp.
40
Z uwagi na istotne znaczenie pomiaru czasu trombinowego w rozpoznawaniu hypo- i dysfibrynogenemii test ten powinien być włączony do panelu badań przesiewowych nie tylko u pacjentów z krwawieniami w wywiadzie, ale także z zakrzepicą żylną lub tętniczą, zwłaszcza, jeśli wywiad rodzinny jest
obciążony. Nawet jednorazowy, nieprawidłowo obniżony wynik oznaczania poziomu fibrynogenu
(<1,5 g/l), uzyskany najczęściej koagulometryczną metodą Claussa, powinien pociągnąć za sobą bardziej szczegółową ocenę pacjenta, z badaniami genetycznymi i poradnictwem genetycznym włącznie.
Podziękowania
Autorki dziękują Prof. M. Neerman-Arbez za wsparcie i pomoc w badaniach na hipo- i dysfibrynogenemiami. Praca powstała dzięki grantowi Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego nr
K/ZDS/000565 (dla A.U).
Autorzy nie zgłaszają sprzeczności interesów.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Blombäck B. Fibrinogen and fibrin- proteins with complex roles in haemostasis and thrombosis. Thromb Res 1996; 83: 175.
Mosesson MW. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 2005; 3: 1894-1904.
Muszbek L, Yee LC, Hevessy Z. Blood coagulation factor XIII: structure and function. Thromb Res 1999; 94: 271-305.
Cesarman-Maus G, Hajjar KA. Molecular mechanisms of fibrinolysis. Br J Haematol. 2005; 129: 307-321.
Haverkate F, Samama M. Familial dysfibrinogenemia and thrombophilia. Report on a study of the SSC Subcommittee on
Fibrinogen. Thromb Haemost. 1995; 73: 151-161.
Zdziarska J, Undas A, Basa J, Iwaniec T, Skotnicki AB, de Moerloose P, et al. Severe bleeding and miscarriages in a
hypofibrinogenemic woman heterozygous for the gamma Ala82Gly mutation. Blood Coagul Fibrinolysis 2009; 20: 374376.
de Moerloose P, Neerman-Arbez. Congenital fibrinogen disorders. Semin Thromb Hemost. 2009; 35: 356-366.
Asselta R, Duga S, Tenchini L. The molecular basis of quantitative fibrinogen disorders. J Thromb Haemost 2006; 4:
2115-2129.
Acharya SS, Dimichele DM. Rare inherited disorders of fibrinogen. Haemophilia 2008; 14: 1151-1158.
de Bosch NB, Mosesson MW, Ruiz-Saez A, Echenagucia M, Rodriguez-Lemoin A. Inhibition of thrombin generation in
plasma by fibrin formation (Anthrombin I). Thromb Haemost. 2002; 88: 253-258.
Cunningham MT, Brandt JT, Laposta M, Olson JD. Laboratory diagnosis of dysfibrinogenemia. Arch Pathol Lab Med
2002; 126: 499-505.
Thorsen LI, Brosstadt F, Solum NO, Stormorken H. Increased binding to ADP-stimulated platelets and aggregation effect
of the dysfibrynogenemia Oslo I as compared with normal fibrinogen. Scand J Haematol 1986; 36: 203-210.
Walter S, Stabler S, Lefkowitz JB. Fibrinogen Denver: a dysfibrynogenemia associated with an abnormal Reptilase time
and significant bleeding. Haemophilia 2006; 12: 393-397.
Hanss M, French P, Vinciguerra C, Bertrand MA, de Mazancourt P. Four cases of hipofibrinogenemia associated with
four novel mutations. J Thromb Haemost 2005; 3: 2347-2349.
Loreth RM, Meyer M, Albert FW. Fibrinogen Kaiserslautern III: a new case of congenital dysfibrinogenemia with Aalpha
16 arg-->cys substitution. Haemostasis 2001; 31: 12-17.
Kotlín R, Chytilová M, Suttnar J, Riedel T, Salaj P, Blatný J, et al. Fibrinogen Nový Jicín and Praha II: cases of hereditary
Aalpha 16 Arg-->Cys and Aalpha 16 Arg-->His dysfibrinogenemia. Thromb Res 2007; 121: 75-84.
Yoshida N, Okuma M, Hirata H, Matsuda M, Yamazumi K, Asakura S. Fibrinogen Kyoto II, a new congenitally abnormal
molecule, characterized by the replacement of A alpha proline-18 by leucine. Blood 1991; 78: 149-153.
Engesser L, Koopman J, de Munk G, Haverkate F, Nováková I, Verheijen JH, et al. Fibrinogen Nijmegen: congenital
dysfibrinogenemia associated with impaired t-PA mediated plasminogen activation and decreased binding of t-PA.
Thromb Haemost 1988; 60: 113-120.
Koopman J, Haverkate F, Grimbergen J, Engesser L, Nováková I, Kerst AF, et al. Abnormal fibrinogens IJmuiden (B beta
Arg14----Cys) and Nijmegen (B beta Arg44----Cys) form disulfide-linked fibrinogen-albumin complexes. Proc Natl Acad
Sci U S A 1992; 89: 3478-3482
Kotlín R, Reicheltová Z, Suttnar J, Salaj P, Hrachovinová I, Riedel T, et al. Two novel fibrinogen variants in the Cterminus of the Bβ-chain: fibrinogen Rokycany and fibrinogen Znojmo. J Thromb Thrombolysis 2010; 30: 311-318.
Problemy diagnostyki dysfibrinogenemii
41
21. Côté HC, Lord ST, Pratt KP. Gamma-chain dysfibrinogenemias: molecular structure-function relationships of naturally
occurring mutations in the gamma chain of human fibrinogen. Blood 1998; 92: 2195-2212.
22. Undas A, Pastuszczak M, Iwaniec T, Kapelak K, Neerman-Arbez M. Functional characterisation of plasma fibrin clots in
Polish carriers of fibrinogen gammaArg275His mutation (fibrinogen Zabrze). Thromb Haemost 2010; 104: 415-417.
23. Hamano A, Mimuro J, Aoshima M, Itoh T, Kitamura N, et al. Thrombophilic dysfibrinogen Tokyo V with the amino acid
substitution of γAla327Thr: formation of fragile but fibrinolysis-resistant fibrin clots and its relevance to arterial thromboembolism. Blood 2004; 103: 3045-3050.
24. Undas A, Zdziarska J, Iwaniec T, Stepien E, Skotnicki AB, de Moerloose P, et al. Fibrinogen Krakow: A novel
hypo/dysfibrinogenemia mutation in fibrinogen gamma chain (Asn325Ile) affecting fibrin clot structure and function.
Thromb Haemost 2009; 101: 975–976.
25. Borrel M, Gari M, Coll I, et al. Abnormal polymerization and normal binding of plasminogen and t-PA in three new dysfibrynogenaemias: Barcelona III and IV (γArg275His) and Villajoyosa (γArg275Cys). Blood Coagul Fibrynolysis. 1995;
6: 198-206.
26. Reber P, Furlan M, Henschen A, et al. Three abnormal fibrinogen variants with the same amino acid substitution
(γ275ArgHis): Fibrinogen Bergamo II, Essen and Perugia. Thromb Haemost. 1986; 56: 401-406.
27. Yoshida N, Imoaka S, Hirata H, et al. Heterozygous abnormal fibrinogen Osaka III with the replacement of γarginine-275
by histidine has an apparently higher molecular weigh γ-chain variant. Thromb Haemost. 1992; 68: 534-538.
28. Yamazumi K, Terukina S, Onohara S, et al. Normal plasmic cleavage of the γ-chain variant of „fibrinogen Saga” with an
Arg-275 to His substitution. Thromb Haemost. 1988; 60: 476-480.
29. Guglielmone HA, Minoldo S, Jarchum GD. Fibrinogen Cordoba I: A γArg275His substitution associated with defective
polymerization. Thromb Res 2007; 121: 429-430.
30. Brennan S, Fellowes Ap, Faed JM, George PM. Hypofibrinogenemia in an individual with 2 coding (γ82 A→G and
Bβ235 P→L) and 2 noncoding mutations. Blood 2000; 95: 179-113.
31. Ivaskevicius V, Jusciute E, Steffens M, et al. Gamma Ala82Gly represents a common fibrinogen gamma-chain variant in
Caucasians. Blood Coagul Fibrinolysis 2005; 16: 205-208.
32. Zawilska K, Undas A, Fish RJ, Molendowicz-Portala L, de Moerloose P, Neermen-Arbez M. Characterisation of a novel
nonsense mutation in FGG (Fibrinogen Poznan) causing hypofibrinogenaemia with a mild bleeding tendency. Thromb
Haemost. 2010; 103: 677-679.
Praca wpłynęła do Redakcji 18.02.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 07.04.2011 r.
Adres Autora:
Prof. dr hab.n.med. Anetta Undas
Zakład Kardiochirurgii, Anestezjologii
i Kardiologii Doświadczalnej
Instytutu Kardiologii CM UJ
ul. Prądnicka 80
31-202 Kraków
[email protected]