przepis do ćwiczenia 2

ĆWICZENIE 2
Enzymy
Wykrywanie obecności katalazy w ziemniaku
Potrzebne odczynniki na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
2 mL 3% wody utlenionej
3 mL wyciśniętego soku z ziemniaka
Szkło:
2x szklanych probówek
2x pipetki plastikowe
1x ziemniak
1x zlewka na 100 mL
sokowirówka
wrząca łaźnia wodna
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
nóż
Wykonanie
Przygotować dwie probówki. Do pierwszej nalać 1 mL 3% roztworu H2O2, a następnie dodać kilka
kropli wyciśniętego soku z ziemniaka. Katalaza ziemniaka powoduje szybki rozkład H 2O2 do H2O i
O2, co uwidacznia się gwałtownym wydzielaniem pęcherzyków tlenu. Do drugiej probówki nalać 2
mL surowego soku z ziemniaka i gotować go na wrzącej łaźni wodnej przez 5 min Po schłodzeniu
probówki dodać kilka kropli H2O2. Brak pęcherzyków tlenu świadczy o inaktywacji katalazy.
Aktywność peroksydazy
Potrzebne odczynniki na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
3 mL 0,3% wody utlenionej
3 mL 0,5% pirogalolu
2 mL wyciśniętego soku z chrzanu lub imbiru
1 mL wody destylowanej
Szkło:
3x szklanych probówek
4x pipetki plastikowe
1x korzeń chrzanu
1x zlewka na 100 mL
sokowirówka
wrząca łaźnia wodna
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
nóż
Wykonanie
Przygotować 3 probówki. Do pierwszej nalać 1 mL soku chrzanowego, do drugiej 1 mL
zagotowanego soku chrzanowego a do trzeciej 1 mL wody destylowanej. Następnie do każdej
probówki dodać 1 mL 0,3% H2O2 i 1 mL 0,5% pirogalolu. Zaobserwować zmiany zachodzące w
kolejnych probówkach.
6
Wpływ temperatury na aktywność amylazy
Potrzebne odczynniki na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
8 mL 0.5% roztworu skrobi
4 mL ekstraktu białek enzymatycznych
roztwór I2 w KI (rozcieńczony 10 razy)
Szkło:
4x probówki szklane
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
Łaźnia wodna o temp 40°C
Pudełko styropianowe z lodem
Wykonanie
Przygotować 4 probówki szklane. Do 3 probówek dodać po 2 mL 0.5% skrobi i 0.1 mL ekstraktu
białek enzymatycznych. Wymieszać zawartość każdej probówki. Probówkę pierwszą umieścić w
łaźni lodowej (pudełko styropianowe z lodem), probówkę drugą w łaźni wodnej w temp 40°C, probówkę trzecią pozostawić w temperaturze pokojowej. Po upływie 5 min reakcję przerwać przez dodanie 1 ml płynu Lugola i dodać 5 ml wody. Zbadać zabarwienie z I 2 przez pomiar absorbancji przy
620 nm. Jako próbę ślepą użyć płynu Lugola rozcieńczonego 8.1x. Równolegle odczytać absorbancję próby, w której reakcję przerwano w czasie „0” (pipetujemy najpierw 1 ml płynu Lugola, potem
0.1 ml ekstraktu, 2 ml skrobi i 5 ml H2O). Aktywność enzymu jest wyrażona ubytkiem skrobi – jest
to różnica pomiędzy absorbancją w czasie „0”, a absorbancją mierzoną po 5 minutach inkubacji.
Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji
Potrzebne odczynniki na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
10 mL 0.5% roztworu skrobi
4 mL ekstraktu białek enzymatycznych
roztwór I2 w KI (rozcieńczony 10 razy)
Szkło:
5x probówki szklane
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
Wykonanie
Przygotować 5 probówek szklanych. Do każdej z nich wlać po 2 mL 0.5% skrobi. Pierwszą
probówkę pozostawić kontrolną, a do następnych dodać kolejno 0,1; 0.2; 0.4; 0.8 mL ekstraktu
enzymatycznego, zawartość wymieszać. Po upływie 5 min reakcję przerwać przez dodanie 1 ml
płynu Lugola. Dodać 5 ml wody. Zbadać zabarwienie z I2 przez pomiar absorbancji przy 620 nm.
Dla kolejnych stężeń enzymu jako próbę ślepą użyć płynu Lugola rozcieńczonego odpowiednio
8.1x, 8.2x, 8.4x, 8.8x. Równolegle odczytać absorbancję próby, w której reakcję przerwano w czasie
„0” (pipetujemy najpierw 1 ml płynu Lugola, potem odpowiednio 0.1, 0.2, 0.4 i 0.8 ml ekstraktu, 2
ml skrobi i 5 ml H2O). Aktywność enzymu jest wyrażona ubytkiem skrobi – jest to różnica
pomiędzy absorbancją w czasie „0”, a absorbancją mierzoną po 5 minutach inkubacji.
7