Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen

Monoclonal Mouse
Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen
Clone PC10
Nr kat. M 0879
Wydanie 19.12.02
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), Clone PC10, jest przeznaczone do
badań immunocytochemicznych. Przeciwciało znakuje ludzkie komórki wykazujące ekspresję PCNA i może
stanowić użyteczne narzędzie do oznaczania komórek proliferujących tkanek zdrowych i niektórych postaci
nowotworów (1). Identyfikacja różnicująca jest wspomagana przez wyniki panelu przeciwciał. Interpretację powinien
przeprowadzić wykwalifikowany patolog w oparciu o historię choroby pacjenta oraz inne testy diagnostyczne.
Wstęp
PCNA jest wielofunkcyjnym białkiem o masie 36 kDa (2) początkowo zakwalifikowanym jako cyklina, ponieważ
obserwowano jego ekspresję na wysokim poziomie w komórkach biorących udział w cyklu komórkowym
podczas ostatnich 5% fazy G1 i pierwszych 35% fazy S. Obecnie wiadomo, że PCNA nie jest ani strukturalnie,
ani ewolucyjnie powiązane z cyklinami. PCNA ma zasadnicze znaczenie dla ciągłości przebiegu cyklu
komórkowego, natomiast oligonucleotydy o działaniu przeciwnym do PCNA zapobiegają przejściu komórek do
fazy S cyklu. PCNA spełnia trojaką rolę dla życia i śmierci komórek. Jest ważnym elementem mechanizmu
replikacji DNA, działając jako białko pomocnicze dla polimerazy DNA , niezbędnej do syntezy
chromosomalnego DNA, oraz polimerazy DNA , niezbędnej do rekombinacji DNA i naprawy jego uszkodzeń.
Brak lub niski poziom czynnościowego PCNA może prowadzić do apoptozy komórki (3, 4).
Gen PCNA jest jednym z nielicznych genów naprawczych aktywowanych działaniem promieniowania i
zawiadujących odpowiedzią komórkową na urazy lub apoptozę. Nadmierną ekspresję PCNA wykorzystuje się
do monitorowania fazy cyklu komórek guzów ; jest to najczęściej występująca zmiana względem kontroli
obserwowana w komórkach nowotworowych, szczególnie wykazujących zwiększoną radiooporność (4).
Odczynnik dostarczony
Mysie przeciwciało monoklonalne jest dostarczone w postaci płynnej jako supernatant hodowli komórkowej
oczyszczony przez dializę z 0,05 mol/L Tris/HCL o pH 7,2 i zawierający 15 mmol/L NaN 3.
Klon: PC10 (5). Izotyp: IgG2a, kappa.
Stężenie IgG u myszy: zob. informację podaną na etykiecie fiolki.
Immunogen:
Produkt białkowy genu fuzyjnego szczurzego PCNA i proteiny A, uzyskany z wektora pC2T (5).
Swoistość
Analiza SDS-PAGE immunoprecypitatów utworzonych przez przeciwciało i znakowany 35S-metioniną ekstrakt
komórek CV-1 (unieśmiertelniona linia małpich komórek nabłonka nerki) wykazuje początkowo reakcję z
polipeptydem odpowiadającym PCNA (5).
Podczas stosowania techniki „Western-blot" wobec ekstraktów komórek HeLa, S. pompe (drożdże) lub S.
frugiperda (owad) przeciwciało znakuje pasmo odpowiadające PCNA (5).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować
z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych
azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w
kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych należy stosować
prawidłowe procedury postępowania.
Przechowywanie
Przechowywać w temp. 2-8 C. Nie używać po dacie ważności podanej na etykiecie fiolki. Jeśli odczynniki są
przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi zweryfikować te warunki. Nie ma
oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek
pacjenta należy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. Jeśli wystąpi nieoczekiwane zabarwienie, którego nie
można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, że przyczyną może być
problem z przeciwciałem, należy niezwłocznie skontaktować się z działem pomocy technicznej naszej firmy.
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciało można stosować dla znakowania skrawków tkanek utrwalonych w formalinie,
metakarnie (1), 100% etanolu, metanolu lub płynie Carnoy'a, zatopionych w parafinie. Utrwalacz Bouina daje
niską intensywność barwienia (6). Wymagane jest wstępne przygotowanie tkanek za pomocą podwyższonej
temperatury podczas odzyskiwania epitopu. W przypadku tkanek utrwalonych w formalinie optymalne wyniki
uzyskano przy użyciu Dako Target Retrieval Solution, nr kat. S 1700, Dako Target Retrieval Solution o
wysokim pH, nr kat. S 3308, 10 mmol/L buforu cytrynianowego o pH 6,0 lub 10 mmol/L buforu Tris, 1 mmol/L
EDTA o pH 9,0. Wstępne przygotowanie tkanek proteinazą K okazało się niszczące dla epitopu. Nie wolno
dopuścić do wyschnięcia skrawków tkanki podczas przygotowania lub następującej po nim procedury barwienia
immunocytochemicznego.
Skrawki zamrożone i przygotowanie komórek: Przeciwciało można stosować do znakowania skrawków
zamrożonych po utrwaleniu w następujący sposób:
(106755-002)
M 0879/PL/CE/19.12.02 p. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Dania · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17
1. Utrwalać w 4% buforowanej formalinie w temperaturze pokojowej przez 8 minut.
Utrwalać w 99% etanolu przez 2 minuty.
Procedura barwienia
Rozcieńczanie: Przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), nr kat. M 0879,
można rozcieńczać w zakresie 1:200-1:400 w przypadku stosowania na skrawkach ludzkich migdałków
utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, stosując podwyższoną temperaturę podczas odzyskiwania
epitopu w Dako Target Retrieval Solution, nr kat. S 1700 przez 20 minut oraz inkubację w temperaturze
pokojowej z pierwszym przeciwciałem przez 30 minut. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zależności od
próbki i metody przygotowania i powinny być określone przez każde z poszczególnych laboratoriów. Zalecaną
kontrolą ujemną jest Dako Mouse IgG2a, nr kat. X 0943, rozcieńczona do takiego samego stężenia mysiego
IgG jak pierwsze przeciwciało. Jeśli stabilność rozcieńczonego przeciwciała i kontroli ujemnej nie została
ustalona podczas rzeczywistej procedury barwienia, zaleca się, aby rozcieńczać te odczynniki bezpośrednio
przed użyciem lub rozcieńczyć w rozcieńczalniku Dako Antibody Diluent, nr kat. S 0809. Kontrolę dodatnią i
ujemną należy wykonać jednocześnie z testem próbki pacjenta.
Wizualizacja: Zaleca się stosowanie zestawu DAKO LSAB™+/HRP, nr kat. K 0679 oraz zestawów DAKO
EnVision™+/HRP, nr kat. K 4004 i K 4006. Zestaw Dako APAAP, nr kat. K 0670, stanowi dobrą alternatywę dla
zamrożonych skrawków i przygotowywania komórek, jeśli pod uwagę brane jest barwienie peroksydazy
endogennej. Należy postępować zgodnie z procedurą załączoną do wybranego zestawu wizualizacji.
Ograniczenia specyficzne
dla produktu
Charakterystyka działania
W przypadku niektórych guzów, w tym raka sutka i raka żołądka, oraz niektórych linii komórkowych in vitro
zanika prosta zależność pomiędzy ekspresją PCNA a proliferacją komórek. Ponadto w przypadku niektórych
guzów sutka i trzustki obserwuje się wyraźną deregulację genu PCNA z jego zwiększoną ekspresją w tkankach
sąsiadujących z guzem (1). PCNA może również wykazywać ekspresję w związku z naprawą DNA, a nie
proliferacją (2).
W komórkach znaczonych przeciwciałem barwienie jest prawie całkowicie ograniczone do jądra i ma ono
charakter rozlany, ziarnisty, bądź mieszany. Niekiedy obserwuje się barwienie cytoplazmy, mogące być oznaką
syntezy lub rozkładu cytoplazmatycznego. W komórkach mitotycznych barwienie ma najczęściej charakter
odczynu rozlanego w całej komórce, ze względu na utratę błony jądrowej (1).
Tkanki normalne: Przeciwciało znakuje tkanki aktywnie proliferujące. Dlatego pozytywną reakcję obserwuje się
w warstwie podstawnej wielowarstwowego nabłonka płaskiego oraz większości komórek cebulek włosowych,
jak również w proliferujących kompartmentach żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy. W tkankach limfatycznych
przeciwciało znakuje komórki ośrodka rozrodczego węzła oraz pojedyncze komórki okołokorowe. W jądrach
znakowana jest większość spermatogonii; jednakże nieoznakowane pozostają spermatydy i plemniki, podobnie
jak komórki śródmiąższowe i Sertoli'ego. W jajnikach komórki jajowe z zatrzymanym podziałem mejotycznym
wykazują znakowanie zarówno jądra, jak i cytoplazmy. W tkankach nieproliferujących lub wykazujących jedynie
niewielki obrót (turnover) znakowanie przeciwciałem jest minimalne. Przykładowo, w nerkach osoby dorosłej
obserwuje się bardzo nieznaczne znakowanie, a w trzustce znakowane są jedynie nieliczne komórki groniaste i
kanałowe. Znakowania nie obserwuje się u dorosłych w ośrodkowym ani obwodowym układzie nerwowym,
mięśniu poprzecznie prążkowanym, gładkim i serca ani zdrowych hepatocytach, chociaż pojedyncze komórki
Kupffera wykazują barwienie jądra (1).
Tkanki patologiczne: W 20 węzłach chłonnych reprezentujących 4 przypadki czynnościowej hiperplazji
limfatycznej oraz 16 przypadków chłoniaka nie obserwowano liniowej zależności pomiędzy procentem komórek
oznakowanych przeciwciałem PCNA a przeciwciałem przeciwko Ki-67 (1). W 16 przypadkach miejscowego
kosmkowo-guzkowego zapalenia błony maziowej z przebarwieniami zaobserwowano istotną dodatnią korelację
pomiędzy rozmiarem zmiany chorobowej a współczynnikiem znakowania PCNA (7).
Piśmiennictwo
1. Hall PA, Levison DA, Woods AL, Yu CC-W, Kellock DB, Watkins JA i wsp. Proliferating cell nuclear antigen
(PCNA) immunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence of deregulated
expression in some neoplasms. J Pathol 1990;162:285-94.
2. Yu CC-W, Filipe MI. Update on proliferation-associated antibodies applicable to formalin-fixed paraffinembedded tissue and their clinical applications [Przegląd]. Histochem J 1993;25:843-53.
3. Kelman Z. PCNA: structure, functions and interactions [Review]. Oncogene 1997;14:629-40.
4. Paunesku T, Mittal S, Proctić M, Oryhon J, Korolev SV, Joachimiak A i wspl. Proliferating cell nuclear
antigen (PCNA): ringmaster of the genome. Int J Radiat Biol 2001;77:1007-21.
5. Waseem NH, Lane DP. Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J Cell Sci 1990;96:121-9.
6. Rowlands DC, Brown HE, Barber PC, Jones EL. The effect of tissue fixation on immunostaining for
proliferating cell nuclear antigen with the monoclonal antibody PC10. J Pathol 1991;165:356-7.
7. Rosa MA, Galli M, Fadda G, Maggiano N, Gambino GF. Proliferating cell nuclear antigen labelling index in
localised pigmented villo-nodular synovitis and its relationship to the size of nodules. Int Orthop (SICOT)
2000;24:197-201.
(106755-002)
M 0879/PL/CE/19.12.02 p. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Dania · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17
Objaśnienie symboli
(106755-002)
Numer katalogowy
Zakres temperatur
Urządzenie medyczne do
diagnostyki in vitro
Nr serii
Przed użyciem zapoznać się z
instrukcjami
Termin ważności
Producent
M 0879/PL/CE/19.12.02 p. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Dania · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17