Monoclonal Mouse

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD71/FITC
Anti-Human CD235a/RPE
Anti-Human CD45/APC
Nr kat. TC675
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC675 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik jest przeznaczony
do stosowania w identyfikacji komórek wykazujących ekspresję CD71, CD235a i CD45.
CD71 jest receptorem transferyny. W tkankach prawidłowych wysoki poziom ekspresji CD71 wykazują
prekursory komórek erytroidalnych i retikulocyty syntetyzujące hemoglobinę (1), ekspresja ta jednak zanika
w dojrzałych erytrocytach (2). Limfocyty aktywowane wykazują ekspresję CD71, nie zachodzi ona jednak
w limfocytach w fazie spoczynku (2). Status proliferacji, zarówno w komórkach prawidłowych, jak
i nowotworowych, jest skorelowany z ekspresją CD71 (3). Przeciwciała anty-CD71, wraz z panelem innych
przeciwciał, uznaje się za istotne we wstępnej ocenie ostrych białaczek pochodzących z komórek linii
erytroidalnych (4).
Ekspresję CD235a (glikoforyny A) wykazują komórki erytroidalne, począwszy od rozpoznawalnych
morfologicznie prekursorów komórek erytroidalnych, zaraz po fazie CFU-E, aż po dojrzałe erytrocyty. Po
osiągnięciu maksymalnego poziomu ekspresji CD235a, ilość tego białka w erytrocycie pozostaje stała i nie
zmienia się w trakcie dalszego dojrzewania (5). W większości przypadków choroby di Gugliemo ekspresję
CD235a wykazują erytroblasty po przemianie nowotworowej, podczas gdy w ostrej białaczce szpikowej
i limfoblastycznej ekspresja CD235a zachodzi bardzo rzadko (6).
CD45 jest jedną z najobficiej występujących glikoprotein powierzchniowych błony komórkowej leukocytów,
a jego ekspresja zachodzi wyłącznie w komórkach układu krwiotwórczego i potomnych (7). Anty-CD45, wraz
z panelem przeciwciał, uważany jest za kluczowy do wstępnego rozpoznania przewlekłych zaburzeń proliferacji
limfocytów i ostrych białaczek (8).
Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych —
powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Dostarczany odczynnik
TC675 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD71, klon Ber-T9, sprzężone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD235a, Glycophorin A, klon JC159, sprzężone z R-fikoerytryną (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, klon 2D1, sprzężone z allofikocyjaniną (APC).
Trzy koniugaty w TC675 wytworzono z oczyszczonych mysich przeciwciał monoklonalnych izotypu IgG1 kappa.
Odczynnik TC675 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy wołowej
(BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL koniugatu dla
leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała anty-CD71, Ber-T9, opisano podczas warsztatów Fifth International Workshop and Conference on
Human Leucocyte Differentiation Antigens (5. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD71 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (9).
Przeciwciała anty-CD235a, JC159, dają silny odczyn w prawidłowych komórkach erytroidalnych na wszystkich
etapach różnicowania, od erytroblastów po dojrzałe krwinki czerwone (6).
Przeciwciała anty-CD45, 2D1, opisano podczas warsztatów Third International Workshop and Conference on
Human Leucocyte Differentiation Antigens (3. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących leukocyty ludzkie), a ich reaktywność z CD45 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (10).
Nazwa klonu przeciwciała to anty-Hle-1 (10).
Środki ostrożności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
Przechowywanie
(113857-002)
Przechowywać w ciemności, w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na
opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do
opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących
o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów
należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego
nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem,
należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
TC675/PL/SSA/06.09.05 s.1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Wykonanie odczynu
Ponieważ przeciwciała anty-CD235a reagują z erytrocytami, niezbędne jest usunięcie erytrocytów przed
rozpoczęciem wykonania odczynu przy użyciu odczynnika TC675.
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Zlizować erytrocyty po etapie 3–5 albo wyizolować komórki jednojądrzaste przez wirowanie w gradiencie
gęstości i przejść do etapu 6.
3.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
4.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
6.
Dodać 20 µL TC675 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
7.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8°C lub przez 15–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25°C).
8.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
9.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą
mieszadła wibracyjnego.
10.
Powtórzyć etap 8.
11.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
12.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie
wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne
w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 6: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do odczynnika ze sprzężonymi przeciwciałami. Zalecanym trójbarwnym odczynnikiem kontrolnym
dla TC675 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0978.
Etap 12: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca
ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru.
Dzięki minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC ich połączenie
umożliwia wyjątkowo łatwą analizę.
Piśmiennictwo
(113857-002)
1.
Goding J. CD71. CD Guide. In: Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin C, Clark E, et al.,
editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th International
Workshop and Conference; 2000 Jun 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York: Oxford University
Press Inc.; 2002. p. 823-4.
2.
Sutherland R, Delia D, Schneider C, Newman R, Kemshead J, Greaves M. Ubiquitous cell-surface
glycoprotein on tumor cells is proliferation-associated receptor for transferrin. Proc Natl Acad Sci (USA)
1981;78:4515-9.
3.
Newman R, Schneider C, Sutherland R, Vodinelich L, Greaves M. The transferrin receptor. [Review].
Trends Biochem Sci 1982;1:397-400.
4.
Basso G, Buldini B, De Zen L, Orfao A. New methodologic approaches for immunophenotyping acute
leukemias. Haematologica 2001;86:675-92.
5.
Loken MR, Shah VO, Dattilio KL, Civin CI. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal
erythroid development. Blood 1987;69:255-63.
6.
Erber WN, McLachlan J, Cordell JL, Turley H, Reid M, Mason DY. A new monoclonal antibody (JC159)
that detects glycophorin A for the diagnosis of erythroleukaemia. Hematol Rev 1991;5:113-20.
7.
Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. London:
Greenwich Medical Media Ltd.; 2003. p. 121-4.
8.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
9.
Boeker M, Werfel T. AA12.1. Binding of activation antigen panel mAb to mononuclear cells after antigenspecific stimulation in vitro. In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto
C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5th
TC675/PL/SSA/06.09.05 s.2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford
University Press; 1995. p. 1181-2.
10.
Cobbold S, Hale G, Waldmann H. Non-lineage, LFA-1 family, and leucocyte common antigens: new and
previously defined clusters. In: McMichael AJ, Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch
FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd
International Workshop and Conference; 1986 Sep 21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1987. p. 788-803.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
W
y
d
i
a
r
g
ó
b
n
m
o
s
e
t
d
y
k
y
i
c
i
n
z
n
v
y
i
t
d
r
Temperatura przechowywania
o
o
Chronić przed słońcem (patrz
s
e
k
c
j
a
n
t
.
p
r
z
e
c
h
o
w
y
w
a
n
i
a
Zużyć przed
Producent
)
Sprawdzić w instrukcji
N
s
(113857-002)
t
o
s
o
w
a
n
i
u
m
e
r
s
e
r
i
i
a
TC675/PL/SSA/06.09.05 s.3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17