Recenzja_2

Prof. dr hab. Bogdan Lesyng
Zakład Biofizyki IFD, Wydział Fizyki
Uniwersytet Warszawski
oraz
Pracownia Bioinformatyki
Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN
Warszawa
Warszawa, 6.01.2015
RECENZJA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ
Tytuł rozprawy:
Theoretical Studies of Biodegradation of Nitrobenzene by Nitrobenzene Dioxygenase
w języku polskim
Teoretyczne badania biodegradacji nitrobenzenu przez dioksygenazę nitrobenzenową
Autor rozprawy:
Mgr inż. Anna Pabiś
Promotor rozprawy: Prof. dr hab. inż. Piotr Panneth
Rozprawa doktorska mgr inż. Anny Pabiś zrealizowana została pod kierunkiem prof.
Piotra Panetha na Wydziale Chemicznym Politechniki Łódzkiej, z wykorzystaniem m.in.
infrastruktury informatycznej i serwisów Centrum Komputerowego Politechniki Łódzkiej.
Obiektem badań teoretycznych jest białko - dioksygenaza nitrobenzenowa (NBDO,
nitrobenzene dioxygenase): enzym należący do niehemowych dioksygenaz typu Rieskiego.
Przewodnim elementem badań jest wskazanie wzajemnej zależności pomiędzy strukturą i
funkcją tego enzymu, w szczególności stworzenie teoretycznego modelu mechanizmu
katalizowanej przez ten enzyme reakcji cis-dihydroksylacji nitrobenzenu. Enzym katalizuje
procesy utleniania związków aromatycznych z wykorzystaniem tlenu atmosferycznego,
prowadząc do cis-dihydrodioli. Rodzina dioksygenaz charakteryzuje się szerokim spektrum
procesów utleniania i redukcji, uczestniczy w wielu kluczowych komórkowych procesach
metabolicznych i sygnałowych, stosowana jest też w biotechnologii oraz w technologiach
utylizacji zanieczyszczeń środowiska. Znane są np. prace dotyczące utylizacji materiałów
wybuchowych
z
wykorzystaniem
tego
typu
enzymów. Z
punktu
widzenia
teoretycznych NBDO jest trudnym obiektem, bowiem symulacje z wyminą
badań
elektronów i
protonów oraz z udziałem atomów żelaza nie należą do najłatwiejszych.
Wybór obiektu badań jest więc podyktowany zarówno aspektami praktycznymi jak i
rozwojem metodologii badania układów o złożonej strukturze i dynamice.
1 W badaniach teoretycznych mgr inż. Pabiś wykorzystała metody molekularnego
modelowania, w tym metody klasycznej dynamiki molekularnej (MD), metody obliczeniowe
molekularnej mechaniki kwantowej (QM) oraz kwantowo-klasyczne symulacje hybrydowe
(QM/MM). Zastosowała znane biblioteki metod obliczeniowych i modelowania, m.in. pakiet
MM/MD Amber 11 z graficznym interface’m VMD, pakiet kwantowy Gaussian 09, oraz tzw.
addytywny schemat symulacyjny QM/MM, z iteracyjnym schematem sprzężenia podukładow
kwantowego i klasycznego z wykorzystaniem biblioteki fDynamo sprzężonej z Gaussianem.
Praca o objętości 88 stron napisana jest poprawnie w języku angielskim, zawiera
streszczenie w języku angielskim i polskim, wstęp, rozdział prezentujący obiekt badań i
stosowane metodologie modelowania, trzy rozdziały prezentujące wyniki obliczeń i ich
interpretację, podsumowanie i wnioski końcowe oraz bibliografię zawierającą 94 cytowanych
prac. Treść rozprawy bazuje m.in. na następujących dwóch publikacjach, których
Doktorantka jest pierwszym autorem:
•
Pabis, A.; Geronimo, I.; Paneth, P. A DFT Study of the cis-Dihydroxylation of
Nitroaromatic Compounds Catalyzed by Nitrobenzene Dioxygenase. J. Phys. Chem.
B 2014, 118, 3245-3256.
•
Pabis, A.; Geronimo, I.; York, D.M.; Paneth, P. Molecular Dynamics Simulation of
Nitrobenzene Dioxygenase Using AMBER Force Field. J. Chem. Theory Comput.
2014, 10, 2246.
Trzy rozdziały prezentujące wyniki badań omawiają kolejno wyniki symulacji MD dla
dioksygenazy nitrobenzenowej, wyniki kwantowych obliczeń metodami funkcjonału gęstości
elektronowej (DFT) dla centrum aktywnego enzymu z substratem, z zastosowaniem więzów
na końcowe atomy molekularnych fragmentów stanowiących to centrum i wreszcie wyniki
symulacji dla całego enzymu z wykorzystaniem hybrydowej metody QM/MM i podziałem
struktury na część kwantową (QM, centrum aktywne z substratem) i klasyczną (MM, resztę
enzymu).
Symulacje MD pokazały, że uśredniona dynamiczna struktura enzymu zbliżona jest do
struktury krystalograficznej. Ruchliwa pętla przykrywająca centrum aktywne pozostawała
głównie w konfiguracji zamykającej centrum. Wartościowym wynikiem symulacji okazała się
analiza układu wiązań wodorowych w centrum aktywnym. Ważnymi okazały się wiązania
wodorowe z dwoma aminokwasami Asp203 oraz Asn258. Istotnym wynikiem symulacji
okazały się oddziaływania z niektórymi molekułami wody pochodzącymi z roztworu, w
szczególności z tymi przy wejściu do centrum i tworzącymi stabilne wiązania z Asn199.
2 Obliczenia DFT dla centrum aktywnego z zadokowanym substratem jakim był nitrobezen i
dla kilku alternatywnych mechanizmów procesu enzymatycznego na poziomie B3LYP i bazy
funkcyjnej LACVP*, z pseudopotencjałem ECP Hay’a i Wadt’a dla atomu Fe, pozwoliły na
wstępną selekcję najbardziej prawdopodobnej ścieżki reakcji katalizy cis-dihydroksylacji
substratu. Prawdopodobna reakcja rozpoczyna się atakiem tlenu hydroksylowego fragmentu
HO-FeV=O na C2 substratu tworząc rodnikowy stan przejściowy. W kolejnym kroku drugi
atom tlenu tego fragmentu atakuje C1 tworząc silnie stabilizowany produkt końcowy, cis-diol.
W badaniach posłużono się procedurami szacowania energii swobodnej możliwych stanów
przejściowych reakcji.
W kolejnym etapie z wykorzystaniem metody QM/MM Doktorantka zbadała dokładniej dwie
możliwe drogi reakcji z udziałem ataku FeIII-OOH oraz HO-FeV=O na pierścień aromatyczny.
Badania potwierdziły mechanizm wskazany wcześniej z wykorzystaniem obliczeń DFT dla
centrum aktywnego. Dokładniej wyznaczone zostały geometrie struktury oraz energie stanów
przejściowych wzdłuż możliwych ścieżek reakcji, w tym ścieżki najbardziej prawdopodobnej.
Chciałbym podkreślić, że symulacje komputerowe i ich analiza przedstawione w rozprawie
zostały zrealizowane szczegółowo i solidnie. Można z całą pewnością stwierdzić, że
uzyskane wyniki niewątpliwie przyczynią się do lepszego zrozumienia struktury i funkcji
badanego enzymu. Praca napisana jest poprawnie pod względem redakcyjnym i jasno jeżeli
chodzi o zawartość merytoryczną. Ważniejsze wyniki dyskutowane w rozprawie zostały w
większości opublikowane w dobrych czasopismach.
Niemniej mam kilka niewielkich uwag krytycznych lub dyskusyjnych, które są następujące:
•
W pracy nie zastosowano procedury wirtualnego miareczkowania do wyznaczenia
stanów uprotonowania aminokwasów enzymu. Co prawda struktura badanego
enzymu jest bardzo dobrze znana i jest dla niego sporo danych doświadczalnych,
niemniej lokalne wielkości pK przy zadanym zewnętrznym pH mogą różnić się od
standardowych wartości i przed symulacjami MD lub QM/MM dobrze jest się upewnić,
np. z wykorzystaniem metodologii równania Poissona-Boltzmanna, czy jakieś miejsce
w enzymie nie charakteryzuje się „anomalną” wartością lokalnego pK.
Struktura
centrum aktywnego była szczegółowo zbadana w tej pracy i nie mam tutaj uwag
krytycznych, moja uwaga dotyczy w tym przypadku raczej dalszych obszarów
enzymu.
•
W przypadku symulacji MD przyjęty cutoff A dla długozasięgowych oddziaływań
elektrostatycznych wynoszący 10 A (str. 17) jest zbyt mały, szczególnie gdyby to był
„atom-based” a nie „residue-based” cut off.
3 Z reguły przyjmuje się obcięcia w
granicach 12-20 A. Z tekstu nie wynika która z wersji obcięcia oddziaływań była
zastosowana. Ponieważ symulacje MD nie były wykorzystywane do oceny energii
swobodnych badanych stanów, nie ma to istotnego znaczenia dla wniosków
końcowych pracy, a jakościowa analiza dotycząca dynamiki wiązań wodorowych przy
przyjętych parametrach jest w moim przekonaniu poprawna.
•
Praca nie zawiera szczegółowych formuł stosowanych do wyznaczania różnic
„energii swobodnych” szczególnie w przypadku kwantowych obliczeń DFT. Ponieważ
obliczenia tego typu nie zawierają w sobie dynamiki, więc prawie na pewno różnice
te nie zawierają wkładów entropowych. Zapewne energie te poza kwantową energią
Borna-Oppenheimera, zawierały efektywny wpływ pola reakcji otoczenia, ale
to
powinno być uwidocznione w szczegółowym matematycznym opisie formalnego
modelu, bo modeli wpływu otoczenia na podukład kwantowy jest wiele i bardzo różnią
się od szkoły do szkoły tworzącej systemy modelowania.
wynika,
że
autorzy
nawet
bardzo
zaawansowanych
Z moich doświadczeń
kwantowych
pakietów
#
nadużywają określenia „Gibbs free energies of activation (ΔG )” do wyznaczania
profilu energii swobodnej wzdłuż dróg reakcji.
•
Również nieco dokładniej powinien być zrelacjonowany model QM/MM, z mojej
wiedzy wynika bowiem, że w literaturze znane są dwa modele tego typu fDynamo i
pDynamo. Autorka wymienia model fDynamo, ale pDynamo jest nowszy i być może
w stosowanym pakiecie ten właśnie model był wykorzystywany ?
Mgr inż. Anna Pabiś jest doświadczonym pracownikiem naukowym. W sumie jest
współautorką 9-ciu publikacji w dobrych i bardzo dobrych czasopismach naukowych. Odbyła
staże naukowe na Uniwersytecie w Walencji (Hiszpania), na Universytecie Rutgersa (USA)
oraz
na
Uniwersytecie
w
Ghent
(Belgia).
Brała
udział
w
8-miu
konferencjach
międzynarodowych oraz 4 krajowych, dając w sumie 5 ustnych prezentacji. Jest bardzo
aktywnym, młodym pracownikiem naukowym w środowisku akademickim.
W podsumowaniu chciałbym wyrazić opinię, że rozprawa spełnia wszystkie warunki stawiane
rozprawom doktorskim, jak również stwierdzam że mgr inż. Anna Pabiś posiada odpowiednie
doświadczenie naukowe i wnoszę o jej dopuszczenie do dalszych etapów przewodu
doktorskiego.
Prof. dr hab. Bogdan Lesyng
4