Recenzja 2

Ocena pracy doktorskiej mgr. inż. Joanny Krzciuk-Guli
p.t. „Synteza i badanie właściwości konformacyjnych wybranych grup
peptydomimetyków”
Szczególne nadzieje pokładane w możliwościach wykorzystania endogennych i
syntetycznych peptydów w praktyce medycznej wiążą się z ich korzystnymi cechami takimi
jak: wysoka aktywność i specyficzność, niska toksyczność, niska akumulacja w tkankach oraz
praktycznie brak oddziaływań z innymi lekami. Niestety, peptydy ulegają szybkiej proteolizie
w przewodzie pokarmowym, stąd ich utrudniona biodostępność, która bardzo limituje drogi
podania. Właściwości te, a także inne, między innymi ograniczona przenikalność przez błony
komórkowe,
szybka
degradacja
w
komórkach
czy
ryzyko
wystąpienia
efektów
immunogenicznych bardzo ogranicza ich zastosowanie jako środki terapeutyczne. Jednym ze
sposobów minimalizujących te niekorzystne cechy jest wprowadzenie do struktur peptydów
syntetycznych ugrupowań przypominających budową wiązania peptydowe lub łańcuchy
boczne aminokwasów proteinogennych. Badania nad tą grupą modyfikowanych peptydów,
określanych jako „peptydomimetyki”, są intensywnie prowadzone przez wiele grup i bez
wątpienia należą do głównego nurtu zainteresowania współczesnej chemii bioorganicznej.
Problematyka ta stanowi od wielu lat jeden z wiodących tematów badawczych ośrodka
wrocławskiego. Sukcesy na tym polu, bardzo dobrze udokumentowane licznymi publikacjami
w renomowanych czasopismach z listy JCR, stanowią także znakomity przykład owocnej
współpracy między grupami badawczymi Politechniki Wrocławskiej, Uniwersytetu
Wrocławskiego i Uniwersytetu Opolskiego. W nurt tych badań wpisuje się rozprawa
doktorska mgr inż. Joanny Krzciuk-Guli, której promotorem jest dr hab. Rafał Latajka, prof.
nadzw. PWr.
Przedłożona do recenzji rozprawa doktorska to148 stronic tekstu. Układ pracy jest
typowy dla tego typu opracowań. Zasadnicze rozdziały pracy to: Wstęp teoretyczny (40
stron), Cel pracy (1 strona), Część eksperymentalna (45 stron), Wyniki i dyskusja (40 stron).
Rozprawę uzupełniają: Podsumowanie, Wykaz skrótów oraz literatury cytowanej (251
pozycji). Opis prowadzonych eksperymentów i dyskusja wyników uzyskanych przez
Kandydatkę stanowi ponad 50% opracowania. Proporcje takie uznaję za właściwe.
W przeglądzie literaturowym Kandydatka wyróżniała trzy podrozdziały, w których
przedstawia
zagadnienia
odwołujące
się
bezpośrednio
do
Jej
badań
własnych.
Najobszerniejszy z nich zawiera charakterystykę dehydropeptydów. Autorka szczegółowo
relacjonuje wyniki badań, uzyskanych zarówno w macierzystym ośrodku jak i
opublikowanych przez inne grupy badawcze, nad udziałem reszt dehydroaminokwasów
(głównie ΔPhe) w indukowaniu struktur drugorzędowych krótkich peptydów. Stosunkowo
duża ilość danych eksperymentalnych pozwala na wyciągnięcie uogólnionych wniosków
odnośnie wpływu charakteru dehydroaminokwasów, ich liczby oraz umiejscowienia w
łańcuchu peptydowym na preferencje konformacyjne dehydropeptydów. Dodatkowe
możliwości
w
projektowaniu
związków
chemicznych
o
pożądanych
strukturach
przestrzennych stwarza też wykorzystanie trwałych izomerów (Z i E) dehydroaminokwasów.
Zamieszczone
w
tablicach
zależności
między
strukturami
pierwszorzędowymi
a
zidentyfikowanymi kanonicznymi strukturami drugorzędowymi ułatwiają lekturę tekstu. W
dalszej części tego podrozdziału Autorka podaje przykłady naturalnie występujących i
syntetycznych
dehydropeptydów
–
są
to
głównie
związki
o
działaniu
przeciwdrobnoustrojowym. Duży potencjał aplikacyjny mają także krótkie dehydropeptydy
cechujące
się
zdolnościami
do
przejmowania
struktur
samoorganizujących
się.
Charakterystyka triazolamerów, związków chemicznych zawierających ugrupowania 1,4- i
1,5-dipodstawione pierścienie triazolowe Doktorantka przedstawiła w kolejnym podrozdziale
przeglądu literaturowego. Ten typ mimetyków wiązań peptydowych jest w ostatniej dekadzie,
dzięki opisanej metodzie cykloaddycji zwanej chemią „Click”, przedmiotem intensywnych
badań wielu grup badawczych. W rozprawie Doktorantka prezentuje sposoby syntezy
ugrupowań triazolowych oraz możliwości ich zastosowania w syntezie nowych polimerów o
ograniczeniach
swobody konformacyjnej. Podaje
też
przykłady ich aplikacji
do
kowalencyjnego łączenia związków o różnym charakterze chemicznym. Ostatnia część
rozdziału poświęcona jest glikopeptydom przeciwdziałającym zamarzaniu wody. Ta
interesująca grupa peptydów stanowi jeden ze składników umożliwiających przetrwanie
organizmu w niskich temperaturach. Oprócz mechanizmu ich działania, znajdują się tu także
2
przykłady motywów glikopeptydów o takim działaniu. Badania nad grupą związków mają,
oprócz aspektu poznawczego także walor aplikacyjny jako krioprotektanty w praktyce
medycznej i przemyśle spożywczym, odpowiednio tkanek biologicznych i konserwacji
żywności. Poziom merytoryczny tego rozdziału jest wysoki, Kandydatka przekonuje, że
potrafi redagować tekst naukowy. Na równie wysoką ocenę zasługuje też strona językowa tej
części rozprawy. Dostrzeżone tu niedociągnięcia są niewielkie. Z obowiązku recenzenta
wymienię kilka: w języku polskim rysunek i tabela piszemy z małej litery, niefortunne
określenie w podpisie rys. 16 „struktura sekwencji AFGP”, pochodna serynowa (str. 44), brak
rysunków 20-23.
Zagadnienia prezentowane w poprzednim rozdziale nawiązują bezpośrednio do badań
własnych Doktorantki, tym samym w pełni uzasadniają cele badawcze rozprawy. Zostały one
sformułowane bardzo syntetycznie (niepełna stronica tekstu). Dwa główne cele to badania
konformacji, metodą NMR wspomaganą obliczeniami teoretycznymi, serii krótkich
(zawierających od 3 do 6 wiązań peptydowych lub ugrupowań je imitujących)
dehydroapeptydów i triazolamerów oraz chemiczna synteza glikopeptydów. Oba cele, choć o
odmiennym charakterze oceniam wysoko. Istotnym niedopatrzeniem, utrudniającym lekturę
rozprawy, jest brak listy związków będących przedmiotem badań. Dla porządku, Doktorantka
dokonała analizy konformacyjnej 15 dehydropeptydów zawierających ΔPhe i ΔAla, a celem
badań było ustalenie korelacji między położeniem reszt Val i His a preferencjami
konformacyjnymi badanych peptydomimetyków. Doktorantka zsyntetyzowała i poddała
badaniom jako związki referencyjne 4 peptydy (w rozprawie niefortunnie określane jako
„naturalne analogi dehydropeptydów”) zbudowane z reszt aminokwasów proteinogennych.
Grupa badanych triazolamerów zawierających ugrupowania 1,4- albo 1,5-dipodstawionego
triazolu liczyła 7 związków. Syntetyzowane glikopeptydy to 3 związki chronione na N- i Ckońcach odpowiednio grupą acetylową i metyloamidową zawierające N-acetylo-Dgalaktozoaminę połączoną wiązaniem O-glikozydowym z łańcuchem bocznym reszty Thr.
W kolejnym rozdziale zatytułowanym „Część doświadczalna” oprócz syntetycznego
opisu stosowanych technik eksperymentalnych, Kandydatka dla wszystkich badanych
związków podaje wartości przesunięć chemicznych 1H i 13C zidentyfikowanych na widmach
NMR. Szkoda, że w rozprawie (lub suplementu do niej) nie zamieszono przynajmniej
przykładów widm NMR z wpisaną analizą sekwencyjną. Zasadniczo nie mam zastrzeżeń do
wyboru technik eksperymentalnych, aczkolwiek na str. 71 warunki analizy HPLC
syntetyzowanych związków są niewłaściwe; kolumnę o średnicy 21,2 mm trudno uznać za
3
analityczną, zdziwienie budzi krótki czas realizacji gradientu (5 min. – tablica 8). Niestety w
pracy nie zamieszczono nawet przykładowych chromatogramów, nie znalazłem również
wartości czasów retencji badanych związków. Trudno uwierzyć, że wydajności syntez
peptydów (po oczyszczaniu?) zawierały się w zakresie 90-95% (str. 74). Z dużym
zainteresowaniem przeczytałem rozprawy, w którym Kandydatka opisuje syntezy
glikopeptydów. Nie można zaliczyć ich do rutynowych, należy więc docenić starania
Doktorantki uwieńczone sukcesem. Mojej wysokiej oceny nie obniża fakt, iż w swoich
eksperymentach wykorzystała ścieżki syntetyczne opracowane na Uniwersytecie w Bielefeld.
Procedury były wieloetapowe i wymagały od Doktorantki doświadczenia w posługiwaniu się
technikami chemii organicznej. Do tego fragmentu rozprawy mam szereg uwag krytycznych.
Oto niektóre z nich: odnośnik [5] na str. 64 to nie praca Bocka i współpr., czy badane
triazolamery miały na C-końcach grupę benzyloksykarbonylową; może jednak ester
benzylowy jak sugeruje rysunek 64?, określenia żargonowe np. „wykonano analityczne PRHPLC..”; czytając rozprawę można odnieść wrażenie, że Doktorantka za aminokwasy
naturalne uważa jedynie proteinogenne (np. „naturalne analogi dehydropeptydów”, czy
„sprzęganie naturalnego aminokwasu do naturalnego aminokwasu” (str. 73) – chociaż w tym
wypadku
do
utworzenia
wiązań
peptydowych
stosowano
odpowiednie
pochodne
aminokwasów proteinogennych), roztwór żywicy (str. 88).
Wyniki uzyskane przez Kandydatkę zawarte są w następnym rozdziale. Dla każdego z
badanych
peptydomimetyków
konformacje
obliczone
z
uwzględnieniem
więzów
strukturalnych uzyskanych z analizy widm 1HNMR, zostały na podstawie podobieństwa
wartości kątów torsyjnych, pogrupowane w rodziny. Kolejny etap to identyfikacja
kanonicznych struktur drugorzędowych. W większości z przebadanych związków
Doktorantka
znalazła
tego
typu
struktury.
Prosta
korelacja
między
strukturami
pierwszorzędowymi a preferencjami konformacyjnymi badanych peptydomimetyków nie jest
możliwa, niemniej analiza uzyskanych wyników i wnioski, jakie na ich podstawie wyciąga
mgr inż. Krzciuk-Gula uważam za prawidłowe. Wyniki zdają się wskazywać, że w krótkich
peptydomimetykach rola strukturotwórcza reszt Val jest większa niż reszt His. Obecność
wolnych N- i C-końców jest powodem większego uporządkowania struktury przestrzennej
peptydomimetyków. Nieoczekiwanie peptydy zbudowane z aminokwasów proteinogennych o
sekwencjach odpowiadających badanym dehydropeptydów posiadały lepiej zdefiniowaną
strukturę przestrzenną, co prawdopodobnie związane było z charakteru rozpuszczalnika, w
jakim rejestrowano widma NMR. Izomery Z dehydrofenyloalaniny w pozycjach 2 i 3
ograniczają swobodę konformacyjną, podczas gdy izomer E umiejscowiony na C-końcu
4
wywiera efekt przeciwny. Jak już podkreślałem, badane triazolamery to interesująca grupa
peptydomimetyków. Ugrupowania 1,4-dipodstawionego triazolu są mimetykami wiązań
peptydowych o geometrii trans, podczas gdy 1,5-dipodstawionego imitują geometrię cis.
Obecność pochodnych 1,4-dipodstawionych w łańcuchu głównym nie prowadzi do
wyraźnego ograniczenia swobody konformacyjnej, niemniej uporządkowanie struktury
wydaje się rosnąć wraz z wielkością
cząsteczek peptydomimetyku. W wypadku
peptydmimetyku zawierającego ugrupowania 1,5-dipodstawionego triazolu, geometria ich
łańcuchów
głównych
jest
lepiej
zdefiniowana,
przyjmując
konformacje
skrętne.
Podsumowując tę część stwierdzam, że Doktorantka uzyskała interesujące, oryginalne
wyniki, które uzupełniają wiedzę na temat preferencji konformacyjnych dwóch ważnych klas
peptydomimetyków. Wykazała, że niektóre z motywów strukturalnych przyjmują dobrze
zdefiniowaną strukturę. Dzięki temu stwarzają uzasadnione nadzieje na ich wykorzystanie w
projektowaniu folderów imitujących konformacje biomolekuł o zakładanej aktywności
biologicznej. Badania konformacji peptydomimetyków nie należą do rutynowych, wymagają
między innymi parametryzacji niestandardowych ugrupowań. Dzięki współpracy w ramach
macierzystej jednostki Kandydatka bardzo dobrze poradziła sobie z tym problemem. Szkoda
tylko, że w rozprawie nie zamieściła szczegółów (wartości kątów, rozkład ładunków) struktur
np. dipodstawionych pochodnych triazolu. Niedosyt budzi też brak opisu analizy
sekwencyjnej (podano jedynie wartości przesunięć chemicznych). Nie podano nawet liczby
więzów strukturalnych wykorzystanych w obliczeniach. To bardzo istotna informacja
uwiarygadniająca wartość obliczonych konformacji. Na szczęście, wyniki dla trzech
pierwszych dedydropeptydów zostały już opublikowane (Beilstein J. Org. Chem., 2014, 10,
660), o czym Kandydatka nie wspomina. W suplemencie do pracy zestawiono
zidentyfikowane efekty NOE i obliczone na ich podstawie odległości międzyprotonowe. Z
pracy dowiedzieć się można, że w obliczeniach jako więzy wykorzystano również wartości
wicynalnych stałych sprzężeń (3JHN-Hα). Takiej informacji nie znalazłem w rozprawie.
Syntetyzowane przez Kandydatkę glikopeptydy zawierały na C-końcach ugrupowanie
metyloamidowe powstałe w wyniku N-metylowania odpowiedniego amidu. Nie można
jednak tego zabiegu nazwać „metylowaniem C-terminalnej aminy” (str. 131). Zamieszczony
ma końcu rozprawy wykaz skrótów nie zawiera wszystkich stosowanych w tekście, niektóre z
nich odwołują się tylko do terminów angielskich, a np. podane rozwinięcie skrótu RP-HPLC
jest błędne.
Na podstawie lektury rozprawy doktorskiej mgr inż. Joanny Krzciuk-Guli, uważam, że
jest Ona dobrze wykształconym chemikiem, zarówno od strony teoretycznej jak też
5
praktycznej. Wysoko oceniam zarówno zakres badań przeprowadzonych przez Doktorantkę,
jak też ich objętość. Na tej podstawie wnioskuję, że opanowała metody syntezy i analizy
konformacyjnej związków organicznych. Kandydata przygotowała interesującą rozprawę
doktorską, a uzyskane przez Nią wyniki wnoszą istotny wkład w badania zależności
preferencji konformacyjnej peptydomiemetyków od ich struktury pierwszorzędowej. Ogólna
ocena rozprawy byłaby wyższa gdyby Doktorantka poświęciła więcej uwagi jej redakcji.
Zdaję sobie jednak sprawę, że rozprawa doktorska to zwykle pierwsze duże opracowanie
przygotowane samodzielnie przez kandydata. Doświadczenie nabyte w trakcie redakcji
rozprawy to także jeden z ważniejszych celów, nie do przecenienia w przyszłej pracy
zawodowej. Uwagi krytyczne recenzenta mają więc pomóc doktorantowi w doskonaleniu
swoich umiejętności i z taką intencją zostały też zamieszczone.
Z pełnym przekonaniem stwierdzam, że recenzowana rozprawa doktorska spełnia
wszystkie kryteria ustawowe (Ustawa z dnia 14 marca 2003 r., Dz.U.03.65.595 wraz z
późniejszymi zmianami (Dz. U. z 2014r. poz. 1852) i zwyczajowe, dlatego wnoszę do Rady
Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej o dopuszczenie
mgr inż. Joanny Krzciuk-Guli do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
Gdańsk, dnia 22 stycznia 2016 roku
6