(Link) Nr kat. IR091

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human ERCC1
Clone 4F9
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR091
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciała FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human ERCC1, Clone 4F9, Ready-to-Use, (Link), są przeznaczone
do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Te przeciwciała stosowane są do
znakowania białka ERCC1 w prawidłowych i zmienionych nowotworowo tkankach (1, 2). Interpretacja kliniczna
wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem
odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z
uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
COFS4; ERCC-1; Excision Repair Cross-Complementation Group; Excision repair cross-complementing rodent
repair deficiency, complementation group 1 (zawiera nakładającą się sekwencję antysensowną); UV20
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency – 1 (ERCC1) to białko jądrowe o masie ~33 kDa
związane z mechanizmem naprawczym polegającym na wycinaniu nukleotydów (ang. nucleotide excision repair,
NER). Mechanizm naprawczy NER jest wykorzystywany do naprawy mutacji DNA, które zachodzą w wyniku
uszkodzenia DNA pod wpływem zewnętrznych związków chemicznych, środowiskowych czynników
rakotwórczych oraz promieniowania ultrafioletowego. Białko ERCC1 tworzy heterodimer z białkiem ERCC4,
znanym równieŜ jako endonukleaza XPF. Kompleks katalizuje reakcję nacięcia w kierunku 5' uszkodzonego
fragmentu DNA. Kompleks ERCC1-XPF jest równieŜ związany z naprawą wewnątrzniciowych wiązań
krzyŜowych oraz rekombinacyjną naprawą DNA poprzez mechanizm naprawczy dopasowania pojedynczych nici
DNA (ang. single-strand annealing) (3).
Wykazano, Ŝe przeciwciała ERCC1 wykrywają białko ERCC1 w komórkach nowotworowych róŜnych typów
nowotworów, w tym niedrobnokomórkowego raka płuc (1, 4-7), raka przełyku i Ŝołądka (8), raka urotelialnego (9),
raka pęcherza moczowego (10) oraz raka kolczystokomórkowego skóry głowy i szyi (11)
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub instrukcje
do systemu detekcji IHC.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciało monoklonalne jest dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i azydek sodu w stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: 4F9. Izotyp: IgG1, kappa
Immunogen
Rekombinowane białko ludzkie ERCC1 o pełnej długości, ulegające ekspresji w komórkach HEK293T.
Swoistość
Przy zastosowaniu techniki Western blot przeciwciała znakują w liniach komórkowych HepG2, HeLa, A549,
Jurkat oraz MCF7 główną frakcję o masie 33 kDa, odpowiadającą spodziewanej masie cząsteczkowej białka
ERCC1. Przeciwciało skierowane przeciwko białku ERCC1, klon 4F9, wiązało się wyłącznie z docelowym
białkiem ERCC1 w mikromacierzy białkowej o wysokiej gęstości, zawierającej ponad 10 000 ludzkich białek
wykazujących nadekspresję w lizatach komórkowych, co dowiodło, Ŝe jest wysoce swoiste względem ERCC1
(1).
Środki ostroŜności
1.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
2
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego
na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne.
(123626-003)
P02765PL_001a_IR091/2013.05 strona 1/4
W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
Skrócona instrukcja
uŜytkownika
Krok
Utrwalanie
Obróbka
wstępna
Rozcieńczenie
Bufor do
rozcieńczania
Kontrola
negatywna
Wizualizacja
Comments (Komentarze)
Formalina
EnVision™ FLEX, High pH (nr kat. K8004)
Produkt gotowy do uŜycia
Produkt rozcieńczony fabrycznie
ND
20 min HIER, 3 w 1 z uŜyciem PT
Link i PT Link Rinse Station
Inkubacja 20 min
ND
FLEX Negative Control, Mouse (nr kat. IR750)
Inkubacja 20 min
EnVision™ FLEX+, Mouse, High pH (nr
kat. K8002)
Inkubacja Mouse (LINKER) 15 min,
inkubacja HRP 20 min, Flex DAB
2x5 min + inkubacja
Barwnik
kontrastowy
Tkanka kontrolna
Szkiełka
EnVision™ FLEX Hematoxylin (nr kat. K8008)
Inkubacja 5 min
Wyrostek robaczkowy
FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020)
Odczyn jądrowy
Zaleca się stosowanie w celu
uzyskania lepszego przylegania
skrawków tkankowych do szkiełek.
Zatapianie
preparatu
Wymagane niewodne, trwałe zatapianie
preparatów
Po przeprowadzeniu barwienia
skrawki muszą zostać odwodnione,
oczyszczone i zatopione w środku do
trwałego zatapiania.
Oprzyrządowani
e
Autostainer Link 48
NaleŜy stosować fiolki dostosowane
do aparatu (nr kat. SK201-SK203)
*UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje
przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem.
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą zostać wykorzystane do znakowania utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie skrawków tkankowych. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4
µm.
Obróbka wstępna: Wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje po przeprowadzeniu na
tkankach HIER przy uŜyciu EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004).
Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie antygenu (HIER) moŜna przeprowadzić z uŜyciem Dako
PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link (PT
Link User Guide). W przypadku aparatów PT Link naleŜy stosować następujące parametry: temperatura
wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas odmaskow ania antygenu: 97°C przez 20 (±1) minut; ochłodzi ć
do 65°C. Usun ąć statywy na szkiełka ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w
słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station (nr kat. PT109)) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision™
FLEX Wash Buffer (20x) (nr kat. K8007) o temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na
1-5 minut.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać
odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
Procedura barwienia
Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, Mouse, High pH, (Link) (nr kat. K8002)
Program: W systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana
objętość uŜytego odczynnika to 1 x 200 µl lub 2 x 150 µl na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące
wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer
Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer Link, naleŜy skontaktować się z działem
wsparcia technicznego firmy Dako. Program instalacyjny oprogramowania systemu Autostainer Link znajduje się
na stronie internetowej pod adresem www.dako.com\Installer. Ten program instalacyjny uzupełni
oprogramowanie DakoLink o dane protokołu i odczynnika Anti-Human ERCC1, Clone 4F9. Krótka nazwa
protokołu przeciwciała brzmi ERCC1 4F9. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w
temperaturze pokojowej.
Barwienie kontrastowe: Zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (nr
kat. K8008). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do
zatapiania.
Próby kontrolne: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać
(123626-003)
P02765PL_001a_IR091/2013.05 strona 2/4
pozytywne i negatywne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Tkankowa kontrola pozytywna
powinna obejmować wyrostek robaczkowy, którego komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak
opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative
Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Przeciwciała dają odczyn jądrowy. W obecności odczynu jądrowego moŜna równieŜ zaobserwować odczyn
cytoplazmatyczny.
Charakterystyka
działania
Prawidłowe tkanki: Przeciwciała Monoclonal Mouse Anti-Human ERCC1, Clone 4F9 wykazują dodatni odczyn
jądrowy w kilku róŜnych typach komórek, w tym w tkance łącznej, śródbłonku, nabłonku, limfocytach, mięśniach
gładkich oraz zrębie. W wyrostku robaczkowym, nabłonku gruczołowym, limfocytach i komórkach zrębowych
przeciwciała wykazują odczyn o nasileniu od umiarkowanego do silnego (2).
Rodzaj tkanki
(liczba
badanych
przypadków)
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
Nadnercza (3)
3/3 Kora nadnerczy (>50%)
3/3 Rdzeń nadnerczy (<50%)
Jajniki (3)
Wyrostek
robaczkowy (1)
1/1 Nabłonek (100%)
1/1 Śródbłonek (80%)
1/1 Limfocyty (80%)
1/1 Mięśnie gładkie (100%)
1/1 Zrąb (80%)
0/1 Neutrofile
2/2 Komórki blastyczne (>50%)
2/2 Komórki przewodów (>50%)
2/2 Komórki pęcherzykowe (>50%)
Trzustka (2)
2/2 Komórki osłonki (50%)
3/3 Zrąb (<50%)
1/1 Nabłonek powierzchniowy
(100%)
0/2 Komórki warstwy ziarnistej
2/2 Komórki zewnątrzwydzielnicze
(>50%)
2/2 Przewody (>50%)
2/2 Wyspy Langerhansa (>50%)
Szpik kostny (2)
Piersi (2)
Przytarczyce (3)
Przysadka mózgowa
(3)
MóŜdŜek (3)
3/3 Komórki glejowe (>50%)
3/3 Komórki nerwowe/koszyczkowe
(>50%)
3/3 Komórki ziarniste (<50%)
0/3 Komórki Purkiniego
Gruczoł krokowy (3)
Mózg (2)
2/2 Komórki glejowe (>50%)
2/2 Opony mózgowe (<50%)
2/2 Neurony (niewiele)
3/3 Nabłonek podstawowy (wartość
zmienna*)
3/3 Komórki zrębowe (<50%)
3/3 Nabłonek (>50%)
2/2 Mięśnie gładkie (>50%)
1/1 Komórki zwojowe (ogniskowo)
3/3 Warstwa podstawowa nabłonka
(>50%)
3/3 Mięśnie gładkie (>50%)
3/3 Kłębuszki nerkowe (>50%)
3/3 Kanaliki nerkowe (>50%)
3/3 Przewody zbiorcze (<50%)
2/2 Hepatocyty (>50%)
Ślinianki (3)
Szyjka macicy (3)
Jelito grube (3)
Przełyk (3)
Nerki (3)
Wątroba (2)
Płuca (3)
Skóra (3)
Jelito cienkie (3)
Śledziona (3)
śołądek (1)
Jądra (3)
Grasica (3)
Komórki
mezotelialne (1)
3/3 Limfocyty (>50%)
3/3 Nabłonek pęcherzyków płucnych
(>50%)
3/3 Makrofagi (>50%)
1/1 Mezotelium (>50%)
1/1 Limfocyty (>50%)
Mięsień sercowy
(3)
Mięśnie
szkieletowe (3)
3/3 Komórki mięśnia sercowego
(>50%)
3/3 Tkanka łączna (>50%)
0/3 Komórki mięśniowe
Migdałki (3)
Tarczyca (3)
Macica (3)
Nabłonek przytarczyc (>50%)
3/3 Część gruczołowa (wartość
zmienna*)
2/2 Część nerwowa (>50%)
3/3 Komórki zrębowe (>50%)
3/3 Komórki nabłonkowe (10–
50%)
1/1 Komórki cewki
moczowej/pęcherza moczowego
(>50%)
3/3 Nabłonek gruczołowy (>50%)
3/3 Nabłonek przewodowy (30%)
3/3 Warstwa podstawowa (50%)
3/3 Gruczoły potowe (50%)
3/3 Nabłonek płaski (50%)
3/3 Nabłonek (>50%)
3/3 Mięśnie gładkie (>50%)
3/3 Limfocyty (>50%)
3/3 Komórki wyściółki/brzeŜne
zatoki (>50%)
1/1 Gruczoły Ŝołądkowe (>50%)
2/2 Komórki zarodkowe w
kanalikach (>50%)
3/3 Komórki Leydiga (>50%)
3/3 Komórki zrębowe (>50%)
3/3 Nabłonek grasicy (<50%)
3/3 Limfocyty (>50%)
3/3 Ciałka Hassalla (nieliczne)
3/3 Nabłonek pęcherzykowy
(>50%)
3/3 Komórki okołopęcherzykowe
(>50%)
3/3 Limfocyty (>50%)
3/3 Nabłonek (>50%)
3/3 Nabłonek błony śluzowej
macicy (wartość zmienna*)
3/3 Zrąb błony śluzowej macicy
(wartość zmienna*)
3/3 Błona mięśniowa macicy
(wartość zmienna*)
Nerwy obwodowe
(3)
3/3 Komórki naczyniowe onerwia
(wartość zmienna*)
3/3 Onerwie (wartość zmienna*)
* Wartość zmienna oznacza, Ŝe jedna lub większa liczba badanych tkanek wykazała odczyn w mniej niŜ 50% tego typu
komórek, natomiast w pozostałych tkankach uzyskano odczyn w ponad 50% tego typu komórek.
(123626-003)
P02765PL_001a_IR091/2013.05 strona 3/4
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
Ma D, Baruch D, Shu Y, Yuan K, Sun Z, Ma K, et al. Using protein microarray technology to screen antiERCC1 monoclonal antibodies for specificity and applications in pathology. BMC Biotechnology 2012;12:88.
Report of Normal Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Mouse Anti-Human
ERCC1, Clone 4F9; Dokument wewnętrzny nr D14806.
deLaat W, Jaspers N, Hoeijmakers J. Molecular mechanism of nucleotide excision repair. Genes & Dev.
1999; 13:768-785
4.
Olaussen KA, Dunant A, Fouret P, Brambilla E, André F, Haddad V, et al. DNA Repair by ERCC1 in Non–
Small-Cell Lung Cancer and Cisplatin-Based Adjuvant Chemotherapy. N Engl J Med 2006;355:983-91.
5.
Bhagwat N, Roginskaya V, Acquafondata M, Dhir R, Wood R, Niedernhofer L. Immunodetection of DNA
repair endonuclease ERCC1-XPF in human tissue. Cancer Res 2009;69:6831-8.
6.
Vilmar AC, Santoni-Rugiu E, Sørensen JB. ERCC1 and histopathology in advanced NSCLC patients
randomized in a large multicenter phase III trial. Ann Oncol 2010;21:1817-24.
7.
Holm B, Mellemgaard A, Skov T, Skov BG. Different impact of excision repair cross-complementation group
1 on survival in male and female patients with inoperable non–small-cell lung cancer treated with carboplatin
and gemcitabine. J Clin Oncol 2009;27:4254-9.
8.
Fareed KR, Al-Attar A, Soomro IN, Kaye PV, Patel J, Lobo DN. Tumour regression and ERCC1 nuclear
protein expression predict clinical outcome in patients with gastro-oesophageal cancer treated with
neoadjuvant chemotherapy. Br J Cancer 2010;102:1600-7.
9.
Kim KH, Do IG, Kim HS, Chang MH, Kim HS, Jun HJ, et al. Excision repair cross-complementation group 1
(ERCC1) expression in advanced urothelial carcinoma patients receiving cisplatin-based chemotherapy.
APMIS 2010;118:941-8.
10. Sun JM, Sung JY, Park SH, Kwon GY, Jeong BC, Seo SI, et al. ERCC1 as a biomarker for bladder cancer
patients likely to benefit from adjuvant chemotherapy. BMC Cancer 2012;12:187.
11. Chiu TJ, Chen CH, Chien CY, Li SH, Tsai HT, Chen YJ. High ERCC1 expression predicts cisplatin-based
chemotherapy resistance and poor outcome in unresectable squamous cell carcinoma of head and neck in
a betel-chewing area. J Trans Med 2011;9:31.
Wydanie 05/13
(123626-003)
P02765PL_001a_IR091/2013.05 strona 4/4