Pomiary równowagowe procesu denaturacji białka

Pomiary równowagowe procesu denaturacji białka
W warunkach zbliżonych do fizjologicznych, białko posiada ściśle określoną strukturę
przestrzenną. Jest ona wynikiem gry pomiędzy siłami stabilizującymi stan natywny,
a oddziaływaniami faworyzującymi stan zdenaturowany. Jeżeli podniesie się odpowiednio
wysoko temperaturę, zmieni pH na ekstremalnie kwaśne lub zasadowe, lub doda się do
roztworu pewnych substancji chemicznych (denaturantów), wówczas łańcuch polipeptydowy
ulegnie rozwinięciu (denaturacji) i przyjmie postać tzw. kłębka statystycznego. Efektem tego
będzie utrata szeregu charakterystycznych własności białka Jednocześnie można się
przekonać, że informacja o tym, jaką strukturę przestrzenną przyjmie łańcuch polipeptydowy
w warunkach fizjologicznych jest w całości zawarta w sekwencji aminokwasowej. Okazuje
się, bowiem, że po powrocie do warunków fizjologicznych, uprzednio zdenaturowane białko
spontanicznie odzyskuje stroją natywną strukturę przestrzenną, a wraz z nią swoje
specyficzne własności.
Badając proces przechodzenia białka ze stanu natywnego do zdenaturowanego można
określić energię stabilności białka równoważną entalpii swobodnej procesu denaturacji
(GD). Okazuje się, że wartość energii stabilności strukturalnej jest rzędu 50±15 kJ/mol.
Wartość ta jest równoważna energii kilku wiązań wodorowych, par jonowych, czy też łat
oddziaływań hydrofobowych. Struktura przestrzenna białka jest utrzymywana przez wiele
wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań zarówno stabilizujących jak i destabilizujących jego
natywną, trójwymiarową strukturę. Prowadzi to do wniosku, iż wartość energii stabilności
jest doskonale wypośrodkowana pomiędzy termodynamiczną możliwością zwinięcia się
łańcucha polipeptydowego w swoją trójwymiarową strukturę, a możliwością zachodzenia
nawet dość znacznych zmian podczas pełnienia przez białka ich funkcji fizjologicznych.
Bardzo często proces denaturacji białek bada się przy użyciu różnych związków
chemicznych będących czynnikami wywołującymi proces denaturacji. Do najczęściej
używanych należą mocznik i chlorowodorek guanidyny. Mechanizm działania tych
związków polega na preferencyjnym wiązaniu się cząsteczek denaturanta do formy
zdenaturowanej białka i stabilizacji formy rozwiniętej białka. Po rozwinięciu białka zwiększa
się znacznie jego powierzchnia kontaktu z roztworem, co powoduje, iż forma rozwinięta
może związać znacznie więcej cząsteczek denaturanta w porównaniu z formą natywną i być
przez stabilizowaną przez cząsteczki substancji denaturujących. W ten sposób w wysokich
stężeniach denaturanta forma rozwinięta jest bardziej stabilna
Do śledzenia procesu denaturacji białka można wykorzystać szereg metod czułych na
zmianę struktury przestrzennej białka. Najczęściej wykorzystywane są metody
spektroskopowe takie jak absorpcja w zakresie reszt aromatycznych, pomiar fluorescencji
reszt aromatycznych oraz dichroizm kołowy. Metody te informują o zmianach struktury
drogo- i trzeciorzędowej badanego białka. Z kolei metody hydrodynamiczne takie jak pomiar
lepkości wewnętrznej czy pomiar współczynnika sedymentacji informują o zmianach
struktury czwartorzędowej.
Zmiany we własnościach fizykochemicznych białka, powstające pod wpływem czynnika
denaturującego, przedstawia się w postaci krzywych denaturacji. Najczęściej wyniki
prezentowane są w postaci znormalizowanej tj. frakcji cząsteczek natywnych obecnych
w roztworze w danych warunkach, w funkcji stężenia denaturanta (lub temperatury czy pH).
Pokrywanie się znormalizowanych krzywych denaturacji otrzymanych przy użyciu różnych
technik świadczy o kooperatywności procesu denaturacji, co oznacza, że podczas denaturacji
istnieje równowaga tylko pomiędzy dwiema formami białka, całkowicie natywną
i całkowicie zdenaturowaną. Brak jest natomiast form pośrednich. Drugie kryterium
świadczące o kooperatywności procesu denaturacji związane jest z denaturacją termiczną.
Jeżeli wyznaczona z równania van't Hoffa zmiana entalpii (w temperaturze odpowiadającej
środkowi przejścia fazowego) równa jest ciepłu przemiany wyznaczonemu bezpośrednio na
drodze pomiarów kalorymetrycznych, wówczas przejście denaturacyjne ma charakter
kooperatywny. Trzecie kryterium kooperatywności dotyczy kinetyki procesu. W przypadku
procesu kooperatywnego zarówno kinetyka procesu denaturacji i renaturacji jest opisana
funkcją monoeksponencjalną.
Dla procesu jednoetapowego:
Stała równowagi dana jest wzorem:
ND
KD 
D
N 
Jednocześnie:
fN  fD  1
gdzie fN i fD są ułamkami odpowiednio frakcji natywnej i zdenaturowanej. Wartość
mierzona parametru fizycznego Y dana jest wzorem:
Y  YN f N  YD f D
Stąd otrzymuje się wyrażenie na wartość ułamka frakcji natywnej:
fN 
Y  YD
YN  YD
Entalpia swobodna procesu denaturacji w danym stężeniu denaturanta dana jest wzorem:
GD   RT ln K D   RT ln
1  fN
Y  YN
  RT ln
fN
YD  Y
Wartość energii stabilności białka w roztworze niezawierającym denaturanta wylicza się na
drodze ekstrapolacji wartości entalpii swobodnych denaturacji uzyskanych przy różnych
stężeniach denaturanta do zerowego stężenia denaturanta Obecnie używa się trzech metod
ekstrapolacji: modelu Tanforda, modelu wiązania denaturanta i modelu ekstrapolacji
liniowej. Najczęściej używany ze względu na prostotę jest model ekstrapolacji liniowej,
zakładający liniową zależność pomiędzy entalpią swobodną denaturacji a stężeniem
denaturanta w strefie przejścia denaturacyjnego:
GD  G0  mdenaturant 
gdzie: G0 odpowiada entalpii swobodnej konformacji białka w czystym rozpuszczalniku,
tzn. jest to wartość G wtedy, gdy stężenie denaturanta równe jest zero; m jest nachyleniem
prostej i określa funkcjonalną zależność GD od stężenia denaturanta oraz jest miarą
kooperatywności oddziaływania denaturanta z białkiem.
Dla wartości GD=0 można wyznaczyć tzw. wartość [denaturant]1/2. Jest to stężenie
denaturanta, w którym białko jest w połowie „drogi” do stanu zupełnego rozwinięcia
struktury.
Badania denaturacji i renaturacji białek są interesujące ze względu na fakt, iż
dostarczają informacji zarówno na temat struktury białek jak i ich stabilności. Pozwalają
także na wyznaczenie parametrów termodynamicznych opisujących cząsteczkę badanego
białka Dodatkowo renaturacja białek, następująca po ich początkowej denaturacji
chemicznej, jest szczególnie interesująca jako model badania procesu zwijania się łańcucha
polipeptydowego w trakcie syntezy na rybosomie. Badania procesów denaturacji mają
wreszcie znaczenie praktyczne. Obecny rozwój biotechnologii pozwala na poprawienie
stabilności enzymów, tak by wykazywały aktywność w warunkach silnie odbiegających od
fizjologicznych.
Cel ćwiczeń
Wyznaczenie krzywej denaturacji mioglobiny poprzez równowagowe pomiary procesu
denaturacji białka przy użyciu spektroskopii dichroizmu kołowego; wyznaczenie stabilności
mioglobiny.
Wykonanie ćwiczenia
Przygotować po 0,5 ml roztworów mocznika o następujących stężeniach (mol/dm3):
Stężenie mocznika [M]
2
3
3,5
3,75
4,0
4,25
4,5
4,75
5
5,25
5,5
5,75
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
Objętość białka
Objętość końcowa próbki: 500 l
Stężenie białka: 5 mg/ml
Stężenie białka w próbce: 0,25 mg/ml
Stężenie mocznika: 10 M
Objętość mocznika
Objętość buforu
Opracowanie wyników (sprawozdanie):
1. Wstęp teoretyczny do pół strony (nie jest wymagany)
2. Opis wykonania ćwiczenia
3. Zamieścić w tabeli zmierzone wartości kąta eliptyczności  w funkcji stężenia
mocznika
4. Wykreślić zależność  od stężenia mocznika
5. Wyznaczyć wartości YN oraz YD
6. Wyliczyć wartości KD oraz GD
7. Wykreślić zależność GD od stężenia mocznika
8. Wyznaczyć wartości G0, [mocznik] 1/2
9. Na podstawie uzyskanych wyników przedyskutować proces denaturacji mioglobiny
mocznikiem oraz otrzymaną wartość G0 dla mioglobiny.