Synteza peptydów

Rozdział 10
Synteza peptydów
MoŜliwość chemicznej syntezy białek zawsze nurtowała badaczy, niestety pomimo udanych
prób syntezy przez R.B. Marrifielda tak duŜych białek jak interferon (155 reszt a.a.) czy
rybonukleaza (124 reszty a.a.), metoda ta nie znalazła powszechnego zastosowani przede
wszystkim ze względu na wysokie koszty syntezy peptydów dłuŜszych niŜ zawierające 30
reszt aminokwasowych.
Otrzymanie peptydów o określonej sekwencji ma duŜe znaczenie między innymi ze względu
na ich potencjalne zastosowanie jako:
-
antygenów do stymulacji wytwarzania specyficznych przeciwciał
-
leków np. pochodna wazopresyny regulująca wchłanianie zwrotne wody u pacjentów
z moczówką prostą
-
ligandów w chromatografii powinowactwa do izolowania np. receptorów hormonów i
innych cząstek sygnałowych rozpoznających sekwencję tych peptydów
-
modeli doświadczalnych do badania struktur przestrzennych występujących w
elementach strukturalnych białek.
Peptydy syntetyzuje się poprzez łączenie α aminowej grupy jednego aminokwasu z uprzednio
aktywowaną, zwykle dicykloheksylokarbodiimidem (DCC), grupą karboksylowa drugiego
aminokwasu
co
prowadzi
do
dicykloheksylomocznika (rys.10-1).
utworzenia
wiązania peptydowego
z
uwolnieniem
Rysunek 10-1: Aktywacja grupy karkoksylowej dicykloheksylokarbodiimidem w celu
utworzenia wiązania peptydowego.
W czasie reakcji wszystkie pozostałe, potencjalne reaktywne grupy, muszą być chemicznie
zablokowane np. grupa α aminowa aminokwasu z aktywowaną DCC grupą karboksylowa,
grupy ε aminowe lizyny etc., przy czym ta protekcja po przeprowadzeniu reakcji kondensacji
musi być łatwo usuwalna. Grypa α aminowa jest w syntezie peptydów zwykle blokowana
czwartorzędowa grupą tert-butylokarboksykarbonową (t-Boc) lub 9-fluorenylometoksy
karbonylową (Fmoc) (rys. 10-2A i B).
Rysunek 10-2 A i B: Schemat syntezy peptydów w fazie stałej.
Pierwsza modyfikacja jest usuwana przy pomocy rozcieńczonego kwas trifluorooctowego
(TFA), a deprotekcja drugiej, z uwagi na nietrwałość połączenia w środowisku zasadowym,
następuje przez 20% roztworze piperydyny w N,N-dimetyloformamidzie.
Peptydy zwykle syntetyzuje się metodą fazy stałej na aktywowanej Ŝywicy polisterynowej
(chlorometylopolistyren lub aminometylopolistyren) zaproponowaną w 1962 roku przez R.B.
Marrifielda. Do wydłuŜającego się od C-końca łańcucha polipeptydowego związanego z
podłoŜem polistyrenu dodaje się stopniowo kolejne
aktywowane DCC (rys. 10-3).
t-Boc (lub Fmoc) aminokwasy
Rysunek 10-3: Ogólny schemat syntezy peptydów.
Główną zaleta tej metody jest moŜliwość dokładnego przemycia od reagentów produktu
reakcji, po jej zakończeniu bez konieczności zastosowania pracochłonnego i niewydajnego
procesu oczyszczania produktów pośrednich. Najpierw do ziaren polistyrenu (zwykle jest to
polistyren modyfikowany 1% diwinylobenzenem o ziarnach 50-100 µm) przyłącza się Ckońcowy aminokwas poŜądanego peptydu blokowany na grupie aminowej (rys. 10-3), a
następnie po usunięciu grupy ochronnej i przemyciu złoŜa dodaje się kolejny aminokwas w
formie t-Boc, aktywuje DCC jego grupę –COOH i po utworzeniu wiązania peptydowego i
odmyciu nadmiaru odczynników przyłącza się w tej samej kolejności reakcji następny
aminokwas. Po zakończeniu syntezy peptydu uwalnia się go z ziaren polistyrenu przez
dodanie stęŜonego TFA, który nie naruszając wiązań peptydowych, uwalnia peptyd i
odblokowuje równocześnie grupę aminową ostatniego dołączonego aminokwasu oraz
zablokowane ε aminowe grupy lizyny.