Ćw. 5 Ekstrakcja mieszaniny herbicydów o

UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Chemia środków ochrony roślin
Katedra Analizy Środowiska
Instrukcja do ćwiczeń
Ćwiczenie 5
Ekstrakcja mieszaniny herbicydów o charakterze
kwaśnym z gleby
Gdańsk 2015
Ćwiczenie 5 Ekstrakcja mieszaniny herbicydów o charakterze kwaśnym z żywności
1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA
Środki ochrony roślin, zwane także pestycydami, to substancje oraz mieszaniny
przeznaczone do ochrony roślin uprawnych przed grzybami (fungicydy), owadami
(insektycydy) oraz chwastami (herbicydy). Ich stosowanie przynosi wiele korzyści,
m. in. zwiększa plony upraw rolniczych poprzez ograniczenie chorób roślin, niszczenie
patogenów czy chwastów, a także zmniejsza straty żywności podczas magazynowania
i transportu. Niemniej jednak, pestycydy uważane są za jedne z najbardziej
toksycznych substancji zanieczyszczających układ przyrodniczy. Jednocześnie,
niektóre ze związków używanych jako pestycydy stanowią zagrożenie dla zdrowia
człowieka, ze względu na obserwowane efekty toksyczne zarówno przy narażeniu
jednorazowym, jak i przewlekłym. Niektóre z pestycydów wykazują wysoką trwałość,
zdolność do bioakumulacji, czy też mobilność w środowisku naturalnym człowieka.
Pestycydy docierają do roślin w wyniku bezpośredniego oprysku części nadziemnych
oraz przez system korzeniowy, mogą być również używane w celu zapobiegania
stratom podczas magazynowania i transportu żywności. Kumulacja szkodliwych
pozostałości po tych zabiegach zależy od gatunku rośliny, rodzaju pestycydu,
wielkości dawki oraz sposobu aplikacji.
Największe ryzyko związane jest z występowaniem pozostałości środków
ochrony roślin w produktach przeznaczonych do spożycia. Stanowią one łatwe źródło
narażenia ludzi na zatrucia. Główną drogą przenikania pestycydów do organizmu
człowieka jest przewód pokarmowy. Dostarczone jednorazowo dawki tych środków nie
są na ogół szkodliwe, jednak nawet niewielka ich ilość przyjmowana wielokrotnie może
prowadzić do efektów toksycznych w dłuższym okresie czasu. Dlatego też jednym
z priorytetowych zadań współczesnej chemii analitycznej stał się monitoring stężeń
pozostałości pestycydów w żywności. Dużą uwagę poświęca się owocom i warzywom
ze względu na duże coroczne spożycie tych produktów. Właściwe urzędy, jak również
producenci żywności są zobowiązani do kontrolowania poziomu pozostałości
pestycydów w owocach i warzywach, w celu określenia, czy obserwowane stężenia
nie są wyższe, niż pozwala na to obowiązujące prawo.
Utrudnieniem podczas analizy pozostałości pestycydów w produktach
przeznaczonych do konsumpcji jest skomplikowany skład badanej próbki, która
zawiera znaczną ilość interferentów, takich jak kwasy tłuszczowe, sterole czy barwniki.
Dodatkowo, znacznym utrudnieniem w analizie są zwykle niskie stężenia oznaczanych
substancji w materiale badawczym. Dlatego też niezwykle ważnym etapem całej
procedury analitycznej jest etap izolacji i wzbogacania pestycydów z odpowiednio
przygotowanej próbki.
Powszechnie stosowanymi technikami ekstrakcji są:
• Ekstrakcja z użyciem rozpuszczalnika (LLE, Liquid-Liquid Extraction) – anality są
izolowane za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika, którego dobór uzależniony jest
od stopnia polarności pestycydów, są to: aceton, acetonitryl, octan etylu,
dichlorometan, heksan, eter naftowy i inne. Wadami tej metody jest zużycie dużych
ilości rozpuszczalników, możliwość powstawania emulsji oraz długi czas izolacji
2
Ćwiczenie 5 Ekstrakcja mieszaniny herbicydów o charakterze kwaśnym z żywności
• Ekstrakcja do fazy stałej (SPE, Solid Phase Extraction) – anality z próbki ciekłej
adsorbowane są na odpowiednio przygotowanym złożu umieszczonym w kolumience
ekstrakcyjnej. Zatrzymane związki wymywa się niewielką ilością mieszaniny
rozpuszczalników. Najczęściej stosowanymi adsorbentami są florisil, tlenek glinu, żel
krzemionkowy oraz żel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi.
Metoda ta zaliczana jest do prostych i szybkich, łączy w sobie proces ekstrakcji,
oczyszczania oraz wzbogacania analitów
• Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME, Solid Phase Microextraction) – anality
znajdujące się w ciekłej próbce lub nad próbką w gazowej fazie nadpowierzchniowej
są adsorbowane na włóknie z sorbentem umieszczonym w igle strzykawki. Zaletą tej
techniki jest szybkość oraz brak konieczności stosowania rozpuszczalników.
W ostatnich latach jedną z najczęściej wybieranych technik ekstrakcji pozostałości
pestycydów z żywności jest metoda QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged and Safe). Polega ona na ekstrakcji i podziale w układzie ciecz–ciecz
składników próbki z użyciem acetonitrylu, a następnie oczyszczeniu ekstraktu z
wykorzystaniem metody dyspersyjnej ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Głównymi
etapami techniki QuEChERS są:
• Ekstrakcja pestycydów z próbki stałej niewielką ilością acetonitrylu poprzez
wytrząsanie
• Dodatek ok. 1 g NaCl i 4 g MgSO4 w celu oddzielenia warstw wody i acetonitrylu
• Oczyszczenie wydzielonej objętości ekstraktu metodą dyspersyjnej SPE
(opcjonalnie, jeśli matryca tego wymaga)
• Dodatek 5 % roztworu kwasu mrówkowego w acetonitrylu w celu osiągnięcia wartości
pH ok. 5
• Oznaczanie wyizolowanych z próbki pestycydów techniką LC lub GC
Istnieją także modyfikacje tej metody, dostosowane do specyfiki konkretnych
matryc (np. o wysokiej zawartości tłuszczu) lub analitów. Jest to m. in. dodatek
odpowiednich sorbentów skutecznie eliminujących lipidy, lub kwasu octowego, który
ułatwia ekstrakcję polarnych pestycydów fosforoorganicznych.
Technika QuEChERS charakteryzuje się niewielkim zużyciem próbek
i odczynników, prostotą wykonania, niewielkimi kosztami analiz, dobrymi efektami
w usuwaniu interferentów i zadowalającymi odzyskami analizowanych związków.
Stosunkowo gorsze rezultaty uzyskuje się przy ekstrakcji wielu związków o bardzo
zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych.
W niniejszym ćwiczeniu ekstrakcji QuEChERS (w dwóch różnych wariantach)
poddane zostaną próbki żywności zanieczyszczone herbicydami o charakterze
syntetycznych hormonów roślinnych (auksyn). Herbicydy te występują w handlu pod
postacią wolnych związków (umiarkowanie rozpuszczalnych w wodzie, o średniej
lipofilowości), soli (rozpuszczalnych w wodzie, hydrofilowych) oraz estrów (bardzo
słabo rozpuszczalnych w wodzie, stosunkowo najbardziej lipofilowych). Różne
właściwości fizykochemiczne (lipofilowość i rozpuszczalność w wodzie) form
omawianych herbicydów sprawiają, że standardowe procedury izolacji tych związków
3
Ćwiczenie 5 Ekstrakcja mieszaniny herbicydów o charakterze kwaśnym z żywności
z próbek środowiskowych i próbek żywności często nie wykazują wymaganej
skuteczności, i są mniej wiarygodne i powtarzalne, niż w przypadku analizy
pestycydów należących do innych grup.
2. WYKONANIE ĆWICZENIA
2.1 Cel ćwiczenia
Celem niniejszego ćwiczenia jest wykorzystanie techniki QuEChERS do izolacji
mieszaniny herbicydów o charakterze kwaśnym z próbki żywności oraz ich analiza
przy użyciu techniki GC-FID. Porównana zostanie przydatność modyfikacji wyjściowej
procedury QuEChERS w analizie pestycydów o charakterze słabych kwasów
organicznych, pod postacią związków wolnych oraz estrów metylowych.
2.2 Wykonanie ćwiczenia
1. Procedura ekstrakcji przedstawiona jest na Rysunku 1.
Rysunek 1. Schemat procedury ekstrakcji herbicydów z próbki żywności.
4
Ćwiczenie 5 Ekstrakcja mieszaniny herbicydów o charakterze kwaśnym z żywności
Próbki należy poddać sililowaniu: do wysuszonej próbki dodać 100 μl BSTFA+TMCS
(99:1) i ogrzewać w bloczku grzejnym w temperaturze 90°C przez 15 minut. Następnie,
próbki analizować według wskazań prowadzącego zgodnie z następującymi
warunkami:
•
chromatograf gazowy SCHIMADZU z detektorem FID
•
kolumna DB-5 (Zebron) o długości 30 m, średnicy wewnętrznej 0,25 mm
oraz grubości warstwy filmu fazy stacjonarnej 0,25 μm
•
gaz nośny argon ze stałym przepływem 1,5 mL min-1
•
temperatura dozownika 310°C, dzielnik przepływu (spliter) 1:25
•
temperatura detektora FID 310°C
•
temperatura kolumny: 100°C-310°C z narostem temperatury 6°C min-1
2. Dodatkowo przygotować próbę ślepą niezawierającą badanej żywności.
Postępować zgodnie z procedurą przedstawioną na Rysunku 1.
3. OPRACOWANIE WYNIKÓW
1. Na podstawie powierzchni sygnałów chromatograficznych pestycydów oraz
wzorca, należy obliczyć zawartość poszczególnych związków w próbkach,
wyrażoną w mg/g mokrej masy.
2. Bazując na tych wynikach, należy obliczyć zawartość poszczególnych
związków w całkowitej masie pestycydów (w %).
4. SZKŁO I ODCZYNNIKI
• Próbki żywności zanieczyszczone mieszaniną pestycydów
• Bezwodny siarczan (VI) magnezu (II)
• Chlorek sodu
• Cytrynian trisodu uwodniony
• Acetonitryl
• BSTFA + TMCS (99:1)
• Roztwór kwasu mrówkowego w acetonitrylu 5 %
• Roztwór wzorca wewnętrznego (kwas dichlorofenylooctowy)
• Probówki polipropylenowe 30 ml – 2 szt.
• Kolba sercowa 50 mL – 2 szt.
5
Ćwiczenie 5 Ekstrakcja mieszaniny herbicydów o charakterze kwaśnym z żywności
• Łyżka metalowa
• Strzykawka szklana 100 µL – 2 szt.
• Strzykawka do GC 10 µL
• Pipety Pasteura – 10 szt.
• Pipeta szklana 10 mL – 1 szt.
• Butelka szklana 2 mL – 3 szt.
Aparatura laboratoryjna
•
Chromatograf gazowy SCHIMADZU z detektorem FID
•
Waga analityczna
•
Rotator
•
Wirówka
LITERATURA
1. Raczkowski M., Hołodyńska A., Nowacka A., Gnusowski B., Zastosowanie metody
QuECHERS do analizy pozostałości pestycydów w pomidorach za pomocą GCNPD/ECD. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin, 51: 727-731, 2011.
2. Sadowska-Rociek A., Cieślik E., Stosowane techniki i najnowsze trendy w
oznaczaniu pozostałości pestycydów w żywności metodą chromatografii gazowej.
Chemia Dydaktyka Ekologia Metrologia, 1-2, 33-38, 2008.
3. Snopczyński T., Struciński P., Góralczyk K., Czaja K., Hernik A., Korcz W.,
Kucharska A., Zastosowanie metody QuEChERS w połączeniu chromatografii
gazowej z detektorem wychwytu elektronów (GC-ECD) w analizie pozostałości
pestycydów w żywności. Roczn. PZH, 62, 145-151, 2011.
4. Czeczko R., Zastosowanie metod chromatograficznych do oznaczania pozostałości
pestycydów w owocach i warzywach. Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych,
48, 462-466, 2011.
6