u chorych leczonych z powodu padaczki

&ARMACEUTYCZNY0RZEGL’D.AUKOWY††
0OZIOMHOMOCYSTEINYIASYMETRYCZNEJDIMETYLOARGININY!$-!
UCHORYCHLECZONYCHZPOWODUPADACZKI
,EVELOFHOMOCYSTEINEANDASYMMETRICDIMETHYLARGININE!$-!
INTREATMENTPATIENTSFOREPILEPSY
3TANISŒAWA4ATAREWICZLEKMED!LEKSANDRAgNIE˜AWSKADRHAB*OLANTA$ORSZEWSKA
PROFDRHAB7OJCIECH+OZUBSKI
3TUDENCKIE+OŒO.AUKOWE+ATEDRAI+LINIKA.EUROLOGII
0RACOWNIA.EUROBIOLOGII+ATEDRY.EUROLOGII5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW0OZNANIU
+IEROWNIK+ATEDRYI+LINIKI.EUROLOGIIPROFDRHAB7OJCIECH+OZUBSKI
Streszczenie
Homocysteina jest uważana za doświadczalny środek
wywołujący drgawki oraz uznany czynnik ryzyka miażdżycy. Leki przeciwpadaczkowe (LPP) takie jak: karbamazepina (CBZ), sól sodowa kwasu walproinowego
(VPA) mogą prowadzić do wzrostu stężenia osoczowej
homocysteiny.
Badaniu poddano 18 pacjentów z padaczką leczonych
LPP (6 kobiet i 12 mężczyzn w wieku 18-58 lat, średnia
wieku 33,3±13,0 lat) oraz 29 osób z grupy kontrolnej
(17 kobiet i 12 mężczyzn w wieku 22-57 lat, średnia
wieku 40,2±12,7 lat).
Stężenie osoczowej homocysteiny (Hcy) i metioniny
(Met) oznaczano metodą HPLC/EC a asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) i L-argininy (Arg) oznaczano
metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.
Wykazano, że w grupie pacjentów 61% chorych miało podwyższoną Hcy powyżej 15 μM. Jednocześnie
stwierdzono, że stężenie osoczowej Hcy statystycznie
istotnie wzrastało jedynie u pacjentów leczonych VPA
(p<0,01 w porównaniu z kontrolą) a poziom osoczowej metioniny statystycznie istotnie obniżał się jedynie
u pacjentów leczonych CBZ (p<0,05 w porównaniu
z kontrolą i z pacjentami leczonymi VPA). Natomiast
u tych pacjentów nie zmieniało się statystycznie istotnie
stężenie zarówno ADMA, jak i Arg.
Leczenie pacjentów LPP z powodu padaczki może prowadzić do wzrostu stężenia osoczowej Hcy.
Słowa kluczowe: homocysteina, asymetryczna dimetyloarginina, leki przeciwpadaczkowe, padaczka
Abstract
Homocysteine is an experimental convulsant factor and
an established risk factor in atherosclerosis. Antiepileptic drug (AED) as carbamazepine (CBZ), sodium valproate VPA may lead to increased homocysteine plasma
concentration.
18 patients with epilepsy AED treatment (6 women and
12 men aging 18-58 years, mean age 33.3±13.0 years)
and 29 controls (17 women and 12 men aging 22-57
years, mean age 40.2±12.7 years) were enrolled in the
study. Concentrations of homocysteine (Hcy) and methionine (Met) were measured in plasma with HPLC/
EC system and asymmetric dimethylarginine (ADMA)
and L-arginine (Arg) with HPLC coupled to fluorescence detection.
61% of patients with concentrations more than 15 μM
of Hcy were found in the patients group. The homocysteine plasma concentration was significantly increased
in patients on VPA therapy, only (p<0.01 as compared
with controls) but the level of plasma methionine significantly decreased in patients on CBZ, only (p<0.05 as
compared with controls and patients with VPA therapy).
The levels of ADMA and Arg were insignificantly changed in AED treatment patients with epilepsy as compared with controls.
The treatment of patients with epilepsy with AED may
lead to increase of Hcy plasma concentrations.
Key words: homocysteine, asymmetric dimethylarginine, antiepileptic drugs, epilepsy
'˜ ւ
Padaczka jest zespołem napadowo występujących objawów somatycznych, wegetatywnych i psychicznych występujących na podłożu zmian zarówno morfologicznych, jak
i metabolicznych w mózgu. Szacuje się, że około 50 milionów ludzi na świecie choruje na padaczkę, a w Polsce około
400 tysięcy. Najczęściej leczenie padaczki polega na wie-
loletnim stosowaniu leków przeciwpadaczkowych (LPP).
Z doniesień piśmiennictwa wynika, że LPP mogą zaburzać
metabolizm homocysteiny (Hcy) i prowadzić do wzrostu jej
stężenia w organizmie [1].
Wykazano, że podwyższony poziom Hcy (hyperhomocysteinemia) w terapii LPP występujący u około 15%
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
pacjentów z padaczką może być skutkiem upośledzonego
wchłaniania jelitowego witamin: B2, B6, B12, kwasu foliowego (kofaktorów transsulfuracji i remetylacji Hcy), indukcji
enzymów wątrobowych lub bezpośredniego wpływu LPP
na metabolizm Hcy i funkcję wydalniczą nerek. Jednocześnie wykazano, że na podwyższone stężenie Hcy zasadniczo
wpływają LPP I generacji: karbamazepina (CBZ) i sól sodowa kwasu walproinowego (VPA), oraz że nie stwierdza się
korelacji pomiędzy poziomem Hcy a LPP nowej generacji
(lamotrygina) [2].
Podwyższone stężenie Hcy uważane za znaczący, niezależny czynnik miażdżycy naczyń wieńcowych, mózgowych, obwodowych i zakrzepicy żylnej może wpływać na
funkcjonowanie śródbłonka naczyniowego poprzez zmiany
metabolizmu asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA), inhibitora syntazy tlenku azotu kontrolującej produkcję tlenku
azotu (NO). Ukazały się prace wskazujące na wpływ hyperhomocysteinemii na kontrolę napadów padaczkowych
z udziałem NO [3].
Celem pracy było oznaczenie stężenia Hcy i ADMA
wraz z ich metabolitami (metionina, Met i L-arginina, Arg,
odpowiednio) u chorych leczonych LPP z powodu padaczki.
‚l˜Ÿu- R–l-t¥ŸlŸuR |J
Pacjenci. Badaniu poddano 18 chorych z rozpoznaną padaczką (bez dodatkowych schorzeń) leczonych LPP (CBZ,
VPA, LPP nowej generacji), 6 kobiet i 12 mężczyzn w wieku
18-58 lat (średnia wieku 33,3±13,0). W tej grupie chorych
10 pacjentów (2 kobiety i 8 mężczyzn) poddano terapii VPA
a 5 chorych (1 kobieta i 4 mężczyzn) leczono CBZ. 3 Pozostałych pacjentów (3 kobiety) poddano politerapii (VPA,
CBZ, LPP nowej generacji). Pacjenci przyjmowali LPP
w dawkach dziennych od kilku miesięcy do kilku lat. Grupę kontrolną stanowiło 29 osób, 17 kobiet i 12 mężczyzn
w wieku 22-57 lat (średnia wieku 40,2±12,7 lat). Osoby kontrolne nie prezentowały objawów chorób neurologicznych.
Rodzaj padaczki i zespołu padaczkowego weryfikowano
w oparciu o kryteria i terminologię rekomendowaną przez
Międzynarodową Ligę Przciwpadaczkową [4]. Uzyskano
zgodę Lokalnej Komisji Etycznej na prowadzenie badań
oraz pisemną zgodę wszystkich badanych osób.
Analiza stężenia homocysteiny, metioniny
Przygotowanie próbek. Analizowane osoczowe związki tiolowe i odpowiednie standardy (Hcy, Fluka, Niemcy;
Met, Sigma, USA) rozcieńczano wodą w stosunku 2:1
i redukowano za pomocą 1% TCEP (Tris-(2-carboxyethyl)phosphin-hydrochlorid, Applichem, Niemcy) w stosunku
1:9. Następnie próbki odbiałczano 1M HCLO4 w stosunku
2:1 i podawano do układu HPLC/EC.
Oznaczanie stężenia tioli. Próbki podawano do układu
HPLC (P580A, Dionex, Niemcy) połączonego z detektorem
elektrochemicznym (CoulArray 5600, ESA, USA). Analizę
przeprowadzano na kolumnie ThermoHypersil BDS C18
(250 x 4,6 x 5μm, Niemcy) w warunkach izokratycznych
używając jako fazę ruchomą 0,15 M bufor fosforanowy
o pH 2,9 z dodatkiem 12,4-17% acetonitrylu [5]. Do sterowania układem, zbierania i obróbki danych używano oprogramowania Chromeleon (Dionex, Niemcy).
Analiza stężenia ADMA i Arg
Przygotowanie próbek. Analizowane osoczowe związki
i odpowiednie standardy ADMA, Arg (Sigma, USA) rozcieńczano wodą w stosunku 1,5:1 i następnie odbiałczano
8M HCLO4 w stosunku 5:1, i podawano do układu HPLC/
EC. Bezpośrednio przed analizą HPLC próbki poddawano derywatyzacji w roztworze zawierającym 10 mg OPA
(Sigma, USA) w 100 μl metanolu z dodatkiem 900 μl 0,4
M buforu boranowego o pH 8,5 i 5 μl 2-merkaptoetanolu
w stosunku 1:1 [6].
Oznaczanie stężenia ADMA i Arg. Próbki podawano
do układu HPLC (P580A, Dionex, Niemcy) połączonego
z detektorem fluorescencyjnym (RF2000, Dionex, Niemcy). Analizę przeprowadzano na kolumnie ThermoHypersil
BDS C18 (250 x 4,6 x 5μm, Niemcy) w warunkach izokratycznych używając jako fazę ruchomą 0,1 M bufor fosforanowy o pH 6,75 z dodatkiem 25% metanolu [16]. Arg i jej
pochodną mierzono fluorymetrycznie stosując wzbudzenie
i emisję przy długości fali 340 i 455 nm odpowiednio. Do
sterowania układem, zbierania i obróbki danych używano
oprogramowania Chromeleon (Dionex, Niemcy).
Statystyczna ocena wyników
Uzyskane wyniki badań oceniano parametrycznym testem one-way ANOVA dla zmiennych niepowiązanych,
używając oprogramowania GraphPad (Instant, USA).
'¬ylplŸ7-J-Í
W wyniku przeprowadzonych badań wykazano, że spośród 18 osób leczonych LPP z powodu padaczki 11 osób
(61%) miało podwyższone stężenie Hcy powyżej 15 μM
(wartości referencyjne dla Hcy, 5-15 μM). Jednocześnie w
tej grupie chorych 7 osób (70%) spośród 10 leczonych VPA
oraz 3 osoby (60%) spośród 5 leczonych CBZ miało podwyższone stężenie Hcy powyżej wartości referencyjnych,
średnio o 41% i 1,3% odpowiednio (Tabela I). Jednocześnie
tylko u chorych leczonych CBZ odnotowano spadek stężenia Met (p<0,05 w porównaniu z kontrolą i z pacjentami
leczonymi VPA) wyrażony statystycznie istotnym obniżeniem poziomu stosunku Met/Hcy (p<0,01 w porównaniu
z kontrolą). Ponadto u tych pacjentów, pomimo nieistotnego statystycznie obniżenia stężenia Arg nie wykazano
zasadniczych zmian poziomu zarówno ADMA, jak i Arg/
ADMA. Natomiast u pacjentów leczonych VPA wzrostowi
stężenia Hcy (Hcy, p<0,01 w porównaniu z kontrolą; Met/
Hcy, p<0,05 w porównaniu z kontrolą) towarzyszył niewielki wzrost stężenia ADMA wyrażony nieznacznym spadek
poziomu Arg/ADMA.
u}ªlRylR
Homocysteina jest uważana za czynnik ryzyka chorób
naczyniowych. Jej podwyższony poziom w mózgu może prowadzić do uszkodzenia śródbłonka naczyniowego, zaburzeń
produkcji NO i działania neurotoksycznego. Do czynników
generujących Hcy należą: dieta, niektóre schorzenia neurologiczne, polimorfizm genów związanych z metabolizmem
Hcy oraz farmakoterapia lekami obniżającymi poziom lipidów, lewodopą i LPP [1]. Z doniesień piśmiennictwa oraz
&ARMACEUTYCZNY0RZEGL’D.AUKOWY†
y-ql®|ª-y¬Ÿ
®ªlÔ®RpŸ7l|AiRulA®y¬
A¬Ÿ<w=
R Ÿ<w=
R žA¬
–aŸ<w=
Ÿ<w=
–až
|y –|q¤G¤Ÿ‹Ÿ`G¤
¤`GŸ‹ŸG¤
¤G¤Ÿ‹Ÿ°Gz
UUGŸ‹Ÿ¡¤G¡
GzŸ‹ŸG°
¤GzŸ‹Ÿ`^G
i|–®¬Ÿ®Ÿ‚-J-A®pԟ
qRA®RylŸ&
¤GŸ‹ŸG55
¤G¡Ÿ‹ŸG
G`Ÿ‹Ÿ°GU5
œ¡G¤Ÿ‹Ÿ¡¤G¡
¤G¤Ÿ‹ŸGU
^œGUŸ‹Ÿ^`G`
i|–®¬Ÿ®Ÿ‚-J-A®pԟqRA®RylŸ
+
^G¤Ÿ‹Ÿ^G
`G`Ÿ‹ŸœG¡5„5…
G°Ÿ‹Ÿ°G¡55
œ°GzŸ‹Ÿ¡¡G^
GœŸ‹ŸG¡
œ^GŸ‹Ÿ^G°
ۖRJyl-Ÿ‹Ÿ +-˜ |˜|ª-y|Ÿ‚-–-uR –¬A®y¬Ÿ R˜ Ÿ|yRkª-¬Ÿ&ŸJq-Ÿ®ulRyy¬AiŸylR‚|ªlÔ®-y¬Ai‡
5
˜ - ¬˜ ¬A®ylRŸl˜ | yRŸ–}¸ylARŸ‚–®¬Ÿ‚|®l|ulRŸ‚r°G°^ŸªŸ‚|–}ªy-yl¥Ÿ®Ÿp|y –|qÔ
55
˜ - ¬˜ ¬A®ylRŸl˜ | yRŸ–}¸ylARŸ‚–®¬Ÿ‚|®l|ulRŸ‚r°G°ŸªŸ‚|–}ªy-yl¥Ÿ®Ÿp|y –|qÔ
„5…
˜ - ¬˜ ¬A®ylRŸl˜ | yRŸ–}¸ylARŸ‚–®¬Ÿ‚|®l|ulRŸ‚r°G°ŸªŸ‚|–}ªy-yl¥Ÿ®Ÿ‚-AoRy -ulŸqRA®|y¬ulŸ&
"-7Rq-Ÿ‡Ÿ|®l|uŸi|u|A¬˜ Rly¬GŸuR l|yly¬GŸ-–alyly¬ŸlŸŸ¥ŸAi|–¬AiŸ®Ÿ‚-J-A®pԟqRA®|y¬AiŸ&Ÿ|–-®Ÿ+ŸlŸ
ªŸa–¥‚lRŸp|y –|qyRo
z przeprowadzonych badań wynika, że LPP prowadzą do
wzrostu poziomu Hcy zarówno w populacji Europejczyków
(Grecja [7], Niemcy [8], Polska), jak i Japończyków [9] oraz
Koreańczyków [10]. Podobnej zależności nie stwierdzono
jednak w populacji amerykańskiej [11], najprawdopodobniej ze względu na spożywaną przez Amerykanów dietę
bogatą w kofaktory niezbędne do remetylacji Hcy do Met.
W piśmiennictwie i w przeprowadzonych badaniach wykazano również, że poziom generowanej Hcy zależy od rodzaju
stosowanego LPP, oraz że zasadniczo leki przeciwpadaczkowe I generacji: CBZ, VPA wpływają na wzrost poziomu Hcy
u pacjentów z padaczką [2]. Uważa się, że wzrost poziomu
Hcy w przypadku farmakoterapii CBZ jest związany z brakiem niezbędnych kofaktorów do remetylacji Hcy, folianów.
Spadek ich poziomu jest najprawdopodobniej związany
z utrudnionym wchłanianiem oraz ze zwiększonym metabolizmem na skutek pobudzania przez CBZ enzymów wątrobowych [1]. Zaburzenie procesu remetylacji podczas kuracji pacjentów z padaczką CBZ może potwierdzać wykazany
w niniejszej pracy spadek poziomu Met u tych chorych.
Wiadomo również, że farmakoterapia VPA prowadzi zasadniczo do obniżenia poziomu folianów poprzez hamowanie
biosyntezy kwasu foliowego i jego pochodnych. Uważa się
także, że VPA może prowadzić do wzrostu stężenia Hcy na
skutek zaburzeń procesu trassulfuracji do cysteiny i glutationu, naturalnego antyoksydantu oraz wpływu na aktywność
cytochromu P450, enzymu odpowiedzialnego za regulację
poziomu Hcy [12]. Z przeprowadzonych badań wynika, że
u pacjentów leczonych VPA poziom kofaktorów remetylacji Hcy do Met najprawdopodobniej zostaje utrzymany na
poziomie umożliwiającym prawidłową metylację, ponieważ
Met u tych pacjentów utrzymywała się na poziomie kontrolnym. Jednocześnie wiadomo, że LPP odgrywają istotną
rolę we wczesnym rozwoju hyperhomocysteinemii [7]. Wykazany w niniejszej pracy znaczniejszy wzrost stężenia Hcy
po podaniu VPA niż po podaniu CBZ może być związany
z krótkim czasem trwania farmakoterapii u tych pacjentów.
W przeprowadzonych badaniach wykazano również, że LPP
prowadzą do spadku poziomu stosunku Met/Hcy. Według
jednej z nowszych teorii obniżony poziom tego stosunku
może być związany z indukowaniem zmian miażdżycowych
przez Hcy z udziałem tiolaktonu. Ponadto wiadomo, że Hcy
może wpływać na funkcjonowanie śródbłonka naczyniowego również poprzez zmiany metabolizmu asymetrycznej
dimetyloargininy (ADMA), inhibitora syntazy tlenku azotu
kontrolującej produkcję tlenku azotu (NO). Wydaje się, że
farmakoterapia LPP nie zaburza kontroli Hcy nad produkcją ADMA. W przeprowadzonych badaniach wykazano, że
u pacjentów leczonych VPA wraz ze wzrostem poziomu Hcy
wzrastało stężenie ADMA. Jednocześnie u tych pacjentów
zaobserwowano niewielki spadek poziomu Arg/ADMA.
Uważa się, że obniżenie tego stosunku we krwi może prowadzić do hypercholesterolemii, nadciśnienia, chorób mięśnia
sercowego i naczyń [13]. Z doniesień piśmiennictwa wynika, że suplementacja chorych z padaczką leczonych LPP
witaminami z grupy B i kwasem foliowym obniża poziom
Hcy a suplementacja L-argininą powoduje spadek stężenia
ADMA i w ten sposób zapobiega dodatkowym komplikacjom klinicznym u tych pacjentów [8, 9, 10].
'yl|˜pl
1. Farmakoterapia chorych z padaczką VPA, lub/i CBZ,
lekami przeciwpadaczkowymi nowej generacji prowadzi u 61% chorych do wzrostu stężenia osoczowej homocysteine powyżej wartości referencyjnych (15 μM).
2. U chorych z padaczką leczonych VPA znaczniej niż
u chorych leczonych CBZ obniża się stosunek Arg/
ADMA.
3. U chorych z padaczką leczonych CBZ znaczniej niż
u chorych leczonych VPA obniża się stosunek Met/Hcy.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
Siniscalchi A i wsp., Increase in plasma homocysteine
levels induced by drug treatments in neurologic patients. Pharmacol. Res. 2005, 52, 367-375
Lambie DG, Johnson RH, Drugs and folate metabolism.
Drugs 1985, 30, 145-155
Lipton SA i wsp., Neurotoxicity associated with dual
actions of homocysteine at the N-methyl-D-aspartate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 5923-5928
Proposal for revised classification of epilepsies and epileptic syndromes. Commission on Classification and
terminology of the International League Against Epilepsy. Epilepsia 1989, 30, 389-399
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
5.
6.
7.
8.
Accinni R i wsp., Screening of homocysteine from newborn blood spots by high-performance liquid chromatography with coulometric array detection. J Chromatogr
A 2000, 896, 183-189
Pi J i wsp., Improved method for simultaneous determination of L-arginine and its mono- and dimethylated
metabolites in biological samples by high-performance
liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci
Appl 2000, 742, 199-203
Attilakos A i wsp., Early effect of sodium valproate and
carbamazepine monotherapy on homocysteine metabolism in children with epilepsy. Epilepsy Res. 2006,
71, 229-232
Schwaninger M i wsp., Elevated plasma concentrations
of homocysteine in antiepileptic drug treatment. Clinical Res. 1999, 40, 345-350
9.
10.
11.
12.
13.
Ono H i wsp., Plasma total homocysteine concentrations in epileptic patients taking anticonvulsants. Metabolism 1997, 46, 959-962
Yoo JH, Hong SB, A common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene is a determinant of
hyperhomocysteinemia in epileptic patients receiving
anticonvulsants. Metabolism 1999, 48, 1047-1051
Tamura T i wsp., Homocysteine, folate, vitamin B-12
and vitamin B-6 in patients receiving antiepileptic drug
monotherapy. Epilepsy Res. 2000, 40, 7-15
Apeland T, Mansoor MA, Strandjord RE, Antiepileptic
drugs as independent predictors of plasma total homocysteine levels. Epilepsy Res. 2001, 47, 27-35
Matsuoka H i wsp., Asymmetrical dimethylarginine, an
endogenous nitric oxide synthase inhibitor, in experimental hypertension. Hypertension 1997, 29, 242-247