W ramach realizacji niniejszego projektu badawczego zatytułowanego

Nr wniosku: 200583, nr raportu: 19235. Kierownik (z rap.): dr Monika Kijewska
W ramach realizacji niniejszego projektu badawczego zatytułowanego „Badania nad syntezą
i selektywną detekcją karbonylowych peptydów powstających w wyniku nieenzymatycznych
modyfikacji potranslacyjnych reszt aminokwasowych w białkach” zaproponowano i zoptymalizowano
warunki reakcji pozwalające na wysokowydajną syntezę analitycznie czystych modyfikowanych
peptydów zawierających w łańcuchach bocznych reszty utlenionej treoniny oraz semialdehydu kwasu
glutaminowego. W tym celu zaprojektowano, zoptymalizowano i wykonano syntezy niebiałkowych
ortogonalnie blokowanych aminokwasów Fmoc-Atda-OH (Fmoc kwas amino(2,5,5-trimetylo-1,3dioksolan-2-yl)octowy) oraz Fmoc-Amdb-OH (Fmoc kwas (2-amino-4-(1,3-dioksolan-2-yl)butanowy)
a następnie zastosowano je w syntezie na nośniku stałym karbonylowych peptydów zgodnie ze strategią
Fmoc. Zastosowanie nowych niebiałkowych aminokwasów pozwoliło na regioselektywne
wprowadzenie reszty zawierającej ugrupowanie karbonylowe w dowolną pozycję łańcucha
peptydowego. Jest to pierwsza z opisanych w literaturze naukowej metoda syntezy karbonylowych
peptydów na nośniku stałym. Ponadto przeprowadzono badania kinetyki odblokowania grupy
karbonylowej w zależności od pozycji niebiałkowego aminokwasu w sekwencji badanego peptydu.
Odkryto, że wprowadzenie Thr(O) na N-koniec peptydu uniemożliwia usunięcie osłony z grupy
karbonylowej katalizowanej kwasem trifluorooctowym. Zaobserwowano także dwa sygnału na
chromatogramie odpowiadające związkom o identycznych masa cząsteczkowych. Analiza LC-MS
wykazała identyczne rozkłady pików izotopowych zarejestrowane dla różnych czasów retencji,
dowiodły obecność dwóch izomerycznych form. Przeprowadzone w ramach realizacji projektu badania
w szerokim stopniu rozwinęły wiedzę dotyczącą syntetycznych peptydów zawierających oksydatywne
modyfikacje.
Ważnym osiągnięciem było zastosowanie handlowej pochodnej zawierającej modyfikację
oksydatywną – pochodną semialdehydu aminoadypinowego, występującą w organizmach żywych,
Fmoc-Aea-OH (Fmoc-L-alizyna acetalu etylenowego) w syntezie na nośniku stałym modyfikowanych
peptydów. Wykazano, że zastosowanie pochodnej Fmoc-Aea-OH nie pozwala uzyskać karbonylowych
peptydów posiadających w łańcuchu bocznym pochodną semialdehydu aminoadypinowego. Analiza
peptydów zawierających pochodną Aea w sekwencji oraz wolną grupę aminową na N-końcu prowadzi
do uzyskania peptydu zawierającego zasadę Schiffa, natomiast acetylacja N-końca nieoczekiwanie
prowadzi do dehydratacji oraz rozpadu wiązania amidowego występującego przed niebiałkowym
aminokwasem. Odkryto, że w obecności kwasu trifluorooctowego (warunki uwalniania peptydu
z żywicy) następuje atak uprotonowanej grupy aldehydowej na wiązanie amidowe prowadząc
do powstania w łańcuchu bocznym nienasyconego pierścienia sześcioczłonowego (1,2,3,4tetrahydropirydyny) i kolejno rozpadu tego wiązania. Analiza LC-MS wykazała również, że
wprowadzenie aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach bocznych przed niebiałkowym
aminokwasem faworyzuje rozpad wiązania amidowego. Uzyskane wyniki niewątpliwie wzbogacą
aktualny stan wiedzy na temat otrzymywania nowych związków chemicznych stosując pochodną FmocAea-OH oraz możliwości ich wykorzystania.
Kolejnym etapem realizacji projektu badawczego było zaprojektowanie i zsyntezowanie
nowych żywic polimerowych w których reaktywne pochodne hydroksyloaminy są związane
kowalencyjnie z żywicą (do selektywnego wiązania związków zawierających ugrupowanie
karbonylowe tzw. „wyłapywacze” karbonyli) oraz czwartorzędowe sole amoniowe w celu poprawienia
efektywności jonizacji produktu peptydowego po jego uwolnieniu z żywicy. Wyniki badań wykazały
rozpad hydroksyloaminy w obecności czwartorzędowego atomu azotu. Problem ten został rozwiązany
przez zastąpienie czwartorzędowej soli resztą argininy. Do wyłapywania glikokoniugatów
zaprojektowano znaczniki zawierające pochodne kwasu fenyloboronowego oraz czwartorzędowe sole
amoniowe. Wydajność selektywnej detekcji glikowanych peptydów oraz sacharydów stosując technikę
spektrometrii mas była bardzo wysoka. Metoda ta ułatwi analizę cukrów oraz oligosacharydów za
pomocą spektrometrii mas, gdyż umożliwi ich jonizowalność podczas standardowych metod ESI-MS.
Dodatkowe odkrycia wynikające z realizacji projektu, obejmujące analizę materiału
biologicznego pochodzącego z soczewki oka na obecność glikokoniugatów, wzbogaciły dotychczasowy
stan wiedzy dotyczący występowania charakterystycznych fragmentów glikowanych peptydów
u pacjentów z zaćmą. Uzyskane wyniki badań mogą przyczynić się do usprawnienia badań nad
molekularnymi mechanizmami stresu oksydacyjnego prowadzonych technikami proteomiki. Odkrycie
to jest bardzo ważne z punktu widzenia diagnostyki medycznej, gdyż pozwala w sposób prosty, szybki
i niedrogi badać materiał biologiczny na obecność związków występujących w stanach chorobowych.