Monoclonal Mouse

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Cytokeratin
klon AE1/AE3
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR053
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, klon AE1/AE3, Ready-to-Use, (Link), jest
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciała te są przydatne w
identyfikacji raków lub nowotworów pochodzenia nabłonkowego (1-3). Interpretacja kliniczna dodatniego lub
ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez ocenę morfologiczną, wykonanie odpowiednich prób kontrolnych
i interpretowana przez doświadczonego patologa w kontekście historii choroby pacjenta i innych badań
diagnostycznych.
Streszczenie
i informacje ogólne
Cytokeratyny stanowią rodzinę białek rozpuszczalnych w wodzie, o masie cząsteczkowej 40-70 kDa, tworzących
cytoszkielet komórek nabłonkowych. Wyizolowano co najmniej 19 różnych typów cytokeratyn, które dzieli się na
dwie podrodziny. W skład podrodziny A wchodzą cytokeratyny o stosunkowo kwaśnym odczynie (pH < 5,5),
natomiast w skład podrodziny B – cytokeratyny o stosunkowo zasadowym odczynie (pH większe lub równe 6).
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub
następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały
niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu,
6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Dostarczany
odczynnik
Gotowe do użycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i roztwór NaN3 o stężeniu 0,015 mol/L.
Klon: AE1/AE3
Izotyp: IgG1, kappa
Immunogen
Ludzki naskórek modzeli (1)
Swoistość
W skład opisywanego zestawu AE1 i AE3 wchodzi mieszanina dwóch rodzajów przeciwciał monoklonalnych,
otrzymanych na drodze immunizacji myszy keratynami ludzkiej modzeli (2). Wykazano, że mieszanina
przeciwciał AE1 i AE3 pozwala na identyfikację większości ludzkich cytokeratyn, dzięki czemu może stanowić
narzędzie pozytywnej identyfikacji immunocytochemicznej komórek pochodzących z nabłonka jedno- i
wielowarstwowego (1,2,4). Przeciwciała AE1 wykazują reakcję z determinantą antygenową występującą na
większości cytokeratyn podrodziny A, w tym cytokeratyn 10, 13, 14, 15 16 i 19 (o masach cząsteczkowych
wynoszących odpowiednio 56,5, 54', 50, 50', 48 i 40 kDa) w klasyfikacji Molla. Przeciwciała nie wykazują reakcji
z cytokeratynami 12, 17 i 18 (o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 55, 47 i 45 kDa) wg tej
samej klasyfikacji (4). Przeciwciała AE3 wykazują reakcję z determinantą antygenową wspólną dla podrodziny B,
w tym cytokeratyn 1, 2, 3, 4 5, 6, 7 i 8 (o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 65, 67, 64, 59, 58,
56, 54 i 52 kDa) (5).
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
Przechowywanie
(115396-001)
Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z
ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby
uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
Należy stosować właściwe wyposażenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą
bądź oczami.
Niewykorzystany odczynnik należy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na opakowaniu.
Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do opakowania,
Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego
produktu. Z tego względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, należy wykonywać
dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie można wyjaśnić
różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, należy się skontaktować
z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
307121PL_001 s. 1/3
Przygotowanie próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe należy pociąć na skrawki o wymiarach 4 µm.
Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu. Optymalne wyniki uzyskuje się w
wyniku wstępnej obróbki tkanek przy użyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x)
(nr kat. K8000/K8004).
Odparafinowane skrawki: Zaleca się wstępną obróbkę utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie
skrawków tkankowych przy użyciu Dako PT (Link) (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera
Instrukcja użytkownika aparatu PT Link.
Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX
Target Retrieval Solution, High pH (10x) (Link) (nr kat. K8000/K8004). Dla aparatów PT Link należy stosować
następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas odmaskowania antygenu:
97°C przez 20 (±1) minut; ochłodzić do 65°C. Przepłukać skrawki rozcieńczonym roztworem o temperaturze
pokojowej EnVision FLEX Wash Buffer (10x) (Link) (nr kat. K8000).
Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i
odmaskowanie można wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje można
znaleźć w Instrukcji użytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe
należy poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003).
Wykonanie odczynu
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym system wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W oprogramowaniu
Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Szczegółowe informacje dotyczące
wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji użytkownika aparatu Autostainer
Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w używanym systemie Autostainer, należy skontaktować się z działem
wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury inkubacji należy również przeprowadzać w
temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zależności od rodzaju materiału oraz sposobu jego przygotowania i
powinny być określone indywidualnie w każdym laboratorium. Aby możliwe było wykonanie oceny przez
patologów z różnym nasileniem odczynu preparatów, należy skontaktować się z działem obsługi/obsługą
techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. Należy upewnić
się, że działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu należy ocenić, czy odczyn jest taki
jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną za pomocą EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (nr kat.
K8008). Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów należy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z użyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować nabłonek płaski
śluzówki, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji
taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX
Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja odczynu
Przeciwciała dają odczyn cytoplazmatyczny.
Charakterystyka
wydajnościowa
Tkanki prawidłowe: W wyniku badania 30 różnych, prawidłowych tkanek wykazano odczyn dodatni w cytoplazmie
nabłonka płaskiego i walcowatego szyjki macicy, jelita grubego, przełyku, skóry, jelita cienkiego, żołądka i
migdałków. Dodatni odczyn uzyskano również w przypadku tkanki gruczołowej (sutka, przytarczyc, stercza,
gruczołów potowych i tarczycy), astrocytów, substancji białej móżdżku, włókien glejowych mózgu, cewek
dystalnych i torebki Bowmana nerek, przewodu żółciowego, pneumocytów, oskrzeli, międzybłonka, przewodów
międzyzrazikowych trzustki, komórek części przedniej przysadki mózgowej, przewodów międzyzrazikowych i
komórek zrazikowych gruczołów ślinowych, komórek retikularnych i ciałek Hassalla grasicy oraz błony śluzowej i
mięśni gładkich trzonu macicy (6). Ujemny odczyn występował w przypadku nadnerczy, szpiku kostnego, serca,
osierdzia, nerwów obwodowych, mięśni szkieletowych, śledziony i jąder.
Przeciwciała AE1/AE3 reagują z cytokeratyną nabłonka wielowarstwowego płaskiego rogowaciejącego (56,5/65–
67) i nabłonka rogówki (55/64), cytokeratyną nabłonka wielowarstwowego płaskiego narządów wewnętrznych
(51/59), cytokeratyną nabłonka wielowarstwowego (50/58), cytokeratyną keratynocytów wykazujących nadmierną
proliferację (48/56) oraz cytokeratyną komórek nabłonka jednowarstwowego (45/52 i 46/54). Keratyna o masie
cząsteczkowej 40 kDa jest obecna w większości rodzajów nabłonka, z wyjątkiem dojrzałego naskórka (3, 4).
Tkanki nieprawidłowe: W preparatach tkanek zmienionych chorobowo Listrom i Dalton (20) badali przydatność
przeciwciał klonów AE1/AE3 wykonując testy na ponad 60 preparatach niskozróżnicowanych nowotworów
nabłonkowych, chłoniaków, czerniaków i mięsaków. Z wyjątkiem dodatniego odczynu w 2 z 6 przypadków raka
drobnokomórkowego i 3 z 5 przypadków raka z nabłonka dróg moczowych stwierdzono dodatni odczyn
wszystkich 34 nowotworów pochodzenia nabłonkowego. W preparatach o dodatnim odczynie przeciwciała
AE1/AE3 dawały jedynie słaby odczyn rozsiany cytoplazmatyczny lub okołojądrowy z komórkami raka z nabłonka
przejściowego. Montag i wsp. (8) stwierdzili, że przeciwciała AE1/AE3 są czułym odczynnikiem w diagnostyce
różnicowej rozsianego międzybłoniaka typu sarkomatycznego (wrzecionowatokomórkowego) (wynik dodatni w
30/30 przypadkach) i innych rodzajów nowotworów wrzecionowatokomórkowych (0/49). Pinkus i wsp. (6)
porównali opisywany test z odczynem z przeciwciałami anty-EMA. Na podstawie badania 87 nowotworów, w tym
48 różnych rodzajów raków gruczołowych, stwierdzono, że w 33% przypadków odczyn przeciwciał AE1/AE3 był
bardziej wiarygodny.
(115396-001)
307121PL_001 s. 2/3
Wprawdzie uzyskano dodatni odczyn struniaka chrzęstniakowatego (3/3 przypadki) i chłoniaka (1/8 przypadków)
z przeciwciałami anty-AE1/AE3, niemniej jednak nie obserwowano dodatniego odczynu wśród 25 nowotworów
pochodzenia nienabłonkowego, w tym 4 przypadków czerniaka i glejaka wielopostaciowego (7). Test immunoblot
z przeciwciałami AE1/AE3 nie pozwolił na wykrycie cytokeratyny w 8 przypadkach nowotworów pochodzenia
nienabłonkowego, w tym czerniaka, chłoniaka, nerwiakowłókniaka i mięsaka (9). Niemniej jednak, zaleca się (7)
stosowanie testu AE1/AE3 jako składnika panelu przeciwciał stosowanych w celu identyfikacji linii komórkowych
w przypadku nowotworów drobnokomórkowych o niskim stopniu zróżnicowania.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Tseng SCG, Jarvinen MJ, Nelson WG, Huang JW, Woodcock-Mitchell J, Sun TTl. Correlation of specific
keratins with different types of epithelial differentiation: Monoclonal antibody studies. Cell 1982; 30:361
Woodcock-Mitchell J, Eichner R, Nelson WG, Sun TT. Immunolocalization of keratin polypeptides in human
epidermis using monoclonal antibodies. J Cell Biol 1982; 95:580
Moll R, Franke WW, Schiller Dl. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal
epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31:11
Sun T-T, Eichner R, Schermer A, Cooper D, Nelson WG, Weiss RA. Classification, expression and possible
mechanisms of evolution of mammalian epithelial keratins: A unifying model. In: Levine A, Topp W, Vande
Woude G, Watson JD (eds.). Cancer cells 1 the transformed phenotype. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory 1984
Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity,
isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388
Pinkus GS, Etheridge CL, O’Connor EM. Are keratin proteins a better tumor marker than epithelial
membrane antigen? Amer J Clin Pathol 1986; 85:269
Listrom MB and Dalton LW. Comparison of keratin monoclonal antibodies MAK-6, AE1:AE3 and CAM-5.2.
Amer J Clin Pathol 1987; 88:297
Montag AG, Pinkus GS, Corson JM. Keratin protein immunoreactivity of sarcomatoid and mixed types of
diffuse malignant mesothelioma: An immunoperoxidase study of 30 cases. Hum Pathol 1988; 19:336
Nelson WG, Battifora H, Santana H and Sun T-T. Specific keratins as molecular markers for neoplasms with
a stratified epithelial origin. Canc Res 1984; 44:1600
Wydanie 09/07
(115396-001)
307121PL_001 s. 3/3